DB21T 2395-2015 稻瘟病菌無毒基因檢測 PCR法

ICS65.020.01DB21DB21/T2395—2015稻瘟病菌無毒基因檢測PCR法遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2395—2015本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院提出。本標準由遼寧省農(nóng)村經(jīng)濟委員會歸口。本標準由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新中心負責起草。本標準主要起草人：鄭文靜、陸曉春、王世維、趙家銘、馬麗、叢玲、張麗霞、白春明、王春語、王妍、朱振興、李丹、王平、李金紅等。本標準由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新中心負責解釋。1DB21/T2395—2015稻瘟病菌無毒基因檢測PCR法本標準規(guī)定了檢測稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）無毒基因的檢測方法，包括原理、儀器設(shè)備、試劑及樣品、防污染措施、實驗步驟及結(jié)果分析。t2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求3術(shù)語及縮略語下列術(shù)語及縮略語適用于本標準3.1正向引物：處于DNA雙鏈上游的引物，簡稱F引物。3.2反向引物：處于DNA雙鏈下游的引物，簡稱R引物。3.3內(nèi)參引物：在聚合作用起始時，可以刺激合成另一種大分子，并與反應物以共價鍵形式連接的序3.4DNA：DeoxyribonucleosidetripHospHate，脫氧核糖核酸。3.5TE：Tris-Cl、EDTA緩沖液。3.6TBE：Tris-Cl、硼酸、EDTA緩沖液。3.7PrimeSTARHSDNAPolymerase：高保真DNA聚合酶。3.8PrimeSTARBuffer（5×):5×PCR反應液。3.9dNTP：DeoxyribonucleosidetripHospHate，脫氧核苷三磷酸。3.10PCR：Polymerasechainreaction。2DB21/T2395—20153.11bp：Basepair，堿基對。3.12Goldenview：核酸染料，替代溴化乙錠。3.13DNAMarker：標準分子量的核酸標記。3.14bp:Basepair,堿基對。3.15Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羥甲基氨基甲烷。3.16EDTA：disodiumethytenediaminetetracetace2H2O4原理根據(jù)稻瘟病菌無毒基因保守區(qū)序列設(shè)計特異性引物，提取稻瘟病菌DNA，對試樣進行PCR擴增，依據(jù)是否擴增獲得預期的DNA片段大小及特定的序列來判斷樣品是否攜帶該無毒基因。5儀器設(shè)備5.1分析天平：感量0.1g,0.01g和0.1mg。5.2瓷質(zhì)研缽、研杵。5.3具蓋塑料離心管：2mL,1.5ml，0.2mL。5.4移液槍和吸頭：1000μL,200μL,10μL。5.5水浴鍋。5.6臺式離心機。5.7NanoDrop2000c核酸濃度測定儀。5.8PCR熱循環(huán)儀。5.9瓊脂糖電泳槽及電泳儀。5.10凝膠成像系統(tǒng)5.11其它相關(guān)儀器設(shè)備。6試劑及樣品6.110%CTAB6.25MNacl6.30.5MEDTA(PH8.0)6.41MTris,pH8.06.5DNA提取緩沖液。3DB21/T2395—20156.61×TE緩沖液。6.75×TBE緩沖液。6.8氯仿:異戊醇（24:1）。6.9異丙醇。6.1075%乙醇。6.11Goldenview（代替溴化乙錠）。6.12干燥的稻瘟病菌絲0.05g～0.1g。6.13引物見附錄A除非另有說明，僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合GB/T6682規(guī)定的一級水。7防污染措施檢測過程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。8實驗步驟8.1試劑配制8.1.110%CTAB：分別稱取CTAB10g和NaCl4.1g，加入100mL重蒸餾水，65℃充分溶解。8.1.25MNacl：稱取Nacl73.05g，加入200mL重蒸餾水溶解，定容體積到250mL,平均分裝。8.1.30.5MEDTA(PH8.0)：稱取EDTA46.53g，加入200mL重蒸餾水，調(diào)整pH到8.0（約需NaOH5.5g），定容到250mL。8.1.41MTris,pH8.0：稱取Tris-base121.9g，加入800mL重蒸餾水，將溶液冷卻到室溫，調(diào)整pH到8.0（約需濃HCl50mL）并定容至1000mL。8.1.5DNA提取緩沖液：10mL1MTrispH混合，加水46mL定容到100mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）。8.1.61×TE緩沖液：1mL1MTris（pH8.00.2mL0.5MEDTA（pH8.0加水定容至100mL。定容至1000mL，使用時稀釋10倍。8.2稻瘟病菌菌絲DNA提取8.2.1取單孢培養(yǎng)后烘干的菌絲0.1g于研缽中加入液氮用研杵研磨，菌粉轉(zhuǎn)入2mL滅菌離心管，并加入65℃預熱的DNA提取緩沖液700μL，蓋蓋混勻，置于水浴鍋內(nèi)65℃溫浴1h（期間間隔15min搖動混勻，使DNA提取緩沖液與菌絲充分混合，保證菌絲DNA的提取效率）。4DB21/T2395—20158.2.212000r/min離心10min，取上清液600μL置于新的2mL離心管，加入等體積氯仿／異戊醇（24﹕1）振蕩抽提5min~10min，12008.2.3緩慢吸取上清液500μL置于新的1.5mL離心管，加入等體積氯仿／異戊醇（24﹕1）振蕩抽提5min~10min，12000r/min離心10min。8.2.4緩慢吸取上清液300μL于新的1.5mL離心管，加入900μL-20℃預冷的無水乙醇，-20℃放置10min，12000r/min離心10min。8.2.5倒掉上清液，用75%乙醇洗滌沉淀3次，干燥后加入100μL1×TE緩沖液溶解，利用NanoDrop2000c測定菌株DNA濃度，并用1×TE緩沖液稀釋至100ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3PCR反應8.3.1將DNA、PrimeSTARBuffer（5×)、dNTPMixture、正向引物（F）及反向引物（R）及重蒸餾水置于冰上融化。8.3.2在0.2mL加蓋無菌離心管中，按先后順序加入PrimeSTARBuffer（5×)dNTPMixture(2.5mM)2.4μL正向引物及反向引物(100nM)0.2μL(終濃度:0.2μM~0.3μM)試樣DNA1μL（20-100ng）重蒸餾水20.1μLPrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.3μL混合后用移液槍抽打混勻，封蓋后短暫離心待用。8.3.3將離心管置于PCR儀中，反應程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s，55℃~61℃退火30s72℃延伸30s～60s（每對引物的退火溫度及延伸時間參見附錄A29個循環(huán)，72℃總延伸5min，4℃保存。8.4電泳8.3.1用200mL玻璃燒杯稱取瓊脂糖0.5g，加入0.5×TBE緩沖液50mL。8.3.2杯口用錫箔紙蓋好封嚴，置微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。8.3.3待瓊脂糖溫度達到50℃左右時加入2.5μLGoldenview（代替溴化乙錠混勻，迅速將膠倒至模具中，放上樣梳。8.3.4約20min待膠完全凝固后，拔下上樣梳，置于盛有0.5×TBE緩沖液的電泳槽中。8.3.5吸取5μLPCR反應液，上樣130v，電泳0.5h～1.0h。8.3.6電泳結(jié)束后，取下瓊脂糖凝膠，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶大小，照相。8.4PCR產(chǎn)物測序?qū)?5μL的PCR產(chǎn)物提交至中美泰和（北京）生物技術(shù)公司，純化PCR產(chǎn)物，測序。5DB21/T2395—20159結(jié)果分析9.1判定原則鑒定稻瘟病菌中是否攜帶抗稻瘟病基因時，如不能獲得特定長度的PCR產(chǎn)物，則可判斷試樣中不含有相應的無毒基因；如可擴增出特定長度的PCR產(chǎn)物，則需結(jié)合電泳結(jié)果和測序結(jié)果共同分析。所有無毒基因的擴增子序列應與附錄B的seq1-18中陰影部分序列相比對。9.2Avr1-CO39以參試菌株DNA為模板，利用附錄A中Primer1擴增，如擴增子長600bp，且序列如與附錄B中seq1陰影部分序列（外顯子區(qū)）相符，表明該菌株攜帶Avr1-CO39，反之，如果無特異性擴增產(chǎn)物或測序結(jié)果與附錄B中seq1陰影部分序列不符則表明該菌株不攜帶此無毒基因。9.3Avr-Pia以參試菌株DNA為模板，利用附錄A中Primer2擴增，如擴增子長464bp，且序列如與附錄B中seq2陰影部分序列相符，表明該菌株攜帶Avr-Pia，反之，如果無特異性擴增產(chǎn)物或測序結(jié)果與附錄B中seq2陰影部分序列不符則表明該菌株不攜帶此無毒基因。9.4Avr-Pii以參試菌株DNA為模板，利用附錄A中Primer3擴增，如擴增子長373bp，且序列如與附錄B中seq3陰影部分序列相符，表明該菌株攜帶Avr-Pii；反之，如果無特異性擴增產(chǎn)物或測序結(jié)果與附錄B中seq3陰影部分序列不符則表明該菌株不攜帶此無毒基因。9.5Avr—Pik以參試菌株DNA為模板，利用附錄A中Primer4擴增，如擴增子長503bp，且序列如與附錄B中seq4陰影部分序列相符，表明該菌株攜帶Avr-PiK-D；如陰影部分序列如與seq5相符，表明該菌株攜帶Avr-PiK-B；如陰影部分序列如與seq6相符，表明該菌株攜帶Avr-PiK-E；如陰影部分序列如與seq7相符，表明該菌株攜帶Avr-PiK-F；如陰影部分序列如與seq8相符，表明該菌株攜帶Avr-PiK-G；如無特異性PCR擴增產(chǎn)物或編碼區(qū)序列（陰影部分）與seq4-8均不符的表明該菌株不攜帶Avr-Pik或已知的等位基因類型。9.6Avr-PitaAvr-Pita具4段外顯子，利用Primer5和Primer6擴增，再將兩端產(chǎn)物序列相拼接，若陰影部分序列如與seq9相符，表明該菌株攜帶Avr-Pita；如陰影部分序列如與seq10相符，表明該菌株攜帶Avr-Pita-Ⅰ;如陰影部分序列如與seq11相符，表明該菌株攜帶Avr-Pita-Ⅱ;如陰影部分序列如與seq12相符，表明該菌株攜帶Avr-Pita-Ⅲ;如陰影部分序列如與seq13相符，表明該菌株攜帶Avr-Pita-Ⅳ;如陰影部分序列如與seq14相符，表明該菌株攜帶Avr-Pita-Ⅴ;如陰影部分序列如與seq15相符，表明該菌株攜帶Avr-1-Pita-Ⅵ;如陰影部分序列如與seq16相符，表明該菌株攜帶Avr-Pita-Ⅶ;若無特異性PCR擴增產(chǎn)物或編碼區(qū)序列（陰影部分）與seq9-16均不符的表明該菌株不攜帶Avr-Pita或已知的等位基因類型。9.6Avr-Piz-t6DB21/T2395—2015如無特異性PCR擴增產(chǎn)物或編碼區(qū)序列與seq17-18均不符的表明該菌株不攜帶Avr-Piz-t或已知的等位基因類型。7DB21/T2395—2015（規(guī)范性附錄）用于擴增無毒基因的引物無毒基因引物序列(5′-3′)延伸時間退火溫度(℃)Primer1Avr1-CO39FCTCTGAACAACTAAGCAACA40RCAACCTGGACTCTTATTGATCPrimer2Avr-PiaFTTATTGCTACCACCTTCCTC30RGTAGTAACTGAGTTGGCGTTPrimer3Avr-PiiFCCTCGGCTTCTTGTATATTACT30RTAAATCGTGCGCTTTCAGATPrimer4Avr-PikFCTGCACACATCAACAGTCTT30RTCACAGTTAAGGCAACGTAGPrimer5Avr-Pita1*FGTTTCCGCCTTTATTGGTTTRAATCCCATCCCATTCGTAACPrimer6Avr-Pita2*FTTCTCTAACCTGCCACGATA30RCCTCCATTCCAACACTAACGPrimer7Avr-Piz-tFGATCAAATGAACACCAGGAA30RCGATGAAGAATGGAAGAATG8DB21/T2395—2015（資料性附錄）無毒基因的擴增子序列序列編號擴增子DNA序列Seq1CTCTGAACAACTAAGCAACAGCGAGGAGATCACACCCTAAATCATGCTGCTAGTAATGCGATATAATGGCCAAACAACGTACTAGAAATGACTAATAAGTACCCAGTCAAGTCAACTTGCTGTAGTATTATATTTAACGAAGCGTCCATTTACTGCCAGGGCAAGTTTATCAATGGGACCAGTGTTCTCCCTCCTCTGGACAACTCAGTTCTTTGCAAACGCTAGACAGTCTACCTCTCTGCCACCATTTTTACTTTTCAAAAATTTACTCCTTGCCGCTACTGAAACTTCTACAATTGAAAGAGCCCACAATGAAAGTCCAAGCTACATTCGCCACCCTTATCGCCCTTGCGGCTTACTTTCCAGCAGCCAATGCTTGGAAAGATTGCATCATCCAACGTTATAAAGACGGCGATGTCAACAACATATATACTGCCAATAGGAACGAAGAGATAACTATTGAGGAATATAAAGTCTTCGTTAATGAGGCCTGCCATCCCTACCCAGTTATACTTCCCGACAGATCGGTCCTTTCTGGCGATTTTACATCAGCTTACGCTGACGACGATGAGTCTTGTTGATCAATAAGAGTCCAGGTTGSeq2TTATTGCTACCACCTTCCTCCGCCTCAGCATCGCTTTGCCCTCATTGCACACAACAACCTCCATTAAAATACATACATATTTCTATTCCCTTTCCATAACAGTATCCCTACCCGCCAGCCCCATACACGAAAATTCTCAAAATGCATTTTTCGACAATTTTCATCCCCTTTGCCTTAGCTGCTCTAAAAGTAAGCGCTGCGCCAGCTAGATTTTGCGTCTATTACGACGGCCACCTTCCCGCGACACGTGTCCTGCTTATGTACGTTAGAATCGGCACTACAGCGACTATTACGGCCCGTGGGCACGAATTCGAAGTTGAAGCAAAAGACCAGAATTGCAAAGTTATTCTCACCAATGGCAAACAAGCACCGGATTGGCTTGCTGCCGAGCCTTACTAGGTTTAAAACGGAAGAGCAGCAGCTTGCTGGTTAAACTTCAAAATAAACGCCAACTCAGTTACTACSeq3CCTCGGCTTCTTGTATATTACTGTATAATTCCTTTTCTTCCCTCCTTATATTTTTCATCTTAAAACTAAACATTTAAATTCAGCTTCAAATATACCAAAATCCCCTTTTATTCCTTCCAATTTACCAAAATGCAACTTTCCAAAATTACTTTCGCTATTGCATTATATGCAATCGGAATCGCAGCACTTCCCACTCCGGCCAGCCTGAATGGCAACACTGAGGTCGCAACCATCTCCGACGTTAAACTTGAGGCCCGCAGCGACACCACTTATCATAAATGCTCCAAATGCGGTTATGGCAGCGATGATTCCGACGCGTATTTTAATCATAAATGCAACTAATGTAAGTTAAAATCTGAAAGCGCACGATTTASeq4CTGCACACATCAACAGTCTTTCAATTTTCGCCTTCCCATTTTTAAACATACTTTTTAACATTTTACAGAC9DB21/T2395—2015TCTTCTTTAACTTTGTTTGCAAAAGACATTATTTTGAAAAGTCAATATGCGTGTTACCACTTTTAACACATTCCTTCTCACTTTGGGAACTGTCGCTGTCGTCAATGCCGAAACGGGCAACAAATATATAGAAAAACGCGCTATCGACCTAAGTCGAGAGCGAGACCCTAACTTTTTCGACCACCCTGGTATTCCTGTACCCGAATGTTTTTGGTTTATGTTTAAAAACAACGTACGTCAAGATGCTGGAACCTGTTACAGCTCTTGGAAAATGGACATGAAAGTTGGTCCAAACTGGGTCCATATTAAATCAGACGATAATTGCAATTTGTCGGGCGACTTCCCTCCAGGTTGGATTGTTTTGGGGAAAAAAAGGCCCGGCTTTTAAATTAAAAGGAAATCACAGTTAAGGCAACGTAGGGAGGTTTGACGAGGTTTACGCTTGGTTGACGGCTCATAAGASeq51381TCTTCTTTAACTTTGTTTGCAAAAGACATTATTTTGAAAAGTCAATATGCGTGTTACCAC1441TTTTAACACATTCCTTCTCACTTTGGGAACTGTCGCTGTCGTCAATGCCGAAACGGGCAA1501CAAATATATAGAAAAACGCGCTATCGACCTAAGTCGAGAGCGAGACCCTAACTTTTTCGA1561CAACGCTGATATTCCTGTACCCGAATGTTTTTGGTTTATGTTTAAAAACAACGTACGTCA1621AGATGCTGGAACCTGTTACAGCTCTTGGAAAATGGACATAAAAGTTGGTCCAAACTGGGT1681CCATATTAAATCAGACGATAATTGCAATTTGTCGGGCGACTTCCCTCCAGGTTGGATTGT1741TTTGGGGAAAAAAAGGCCCGGCTTTTAAATTAAAAGGAAATCACAGTTAAGGCAACGTAG1801GGAGGTTTGACGAGGTTTACGCTTGGTTGACGGCTCATAAGASeq6CTGCACACATCAACAGTCTTTCAATTTTCGCCTTCCCATTTTTAAACATACTTTTTAACATTTTACAGAC1381TCTTCTTTAACTTTGTTTGCAAAAGACATTATTTTGAAAAGTCAATATGCGTGTTACCAC1441TTTTAACACATTCCTTCTCACTTTGGGAACTGTCGCTGTCGTCAATGCCGAAACGGGCAA1501CAAATATATAGAAAAACGCGCTATCGACCTAAGTCGAGAGCGAGACCCTAACTTTTTCGA1561CAACCCTGGTATTCCTGTACCCGAATGTTTTTGGTTTATGTTTAAAAACAACGTACGTCA1621AGATGCTGGAACCTGTTACAGCTCTTGGAAAATGGACATGAAAGTTGGTCCAAACTGGGT1681CCATATTAAATCAGACGATAATTGCAATTTGTCGGGCGACTTCCCTCCAGGTTGGATTGT1741TTTGGGGAAAAAAAGGCCCGGCTTTTAAATTAAAAGGAAATCACAGTTAAGGCAACGTAG1801GGAGGTTTGACGAGGTTTACGCTTGGTTGACGGCTCATAAGASeq7CTGCACACATCAACAGTCTTTCAATTTTCGCCTTCCCATTTTTAAACATACTTTTTAACATTTTACAGAC1381TCTTCTTTAACTTTGTTTGCAAAAGACATTATTTTGAAAAGTCAATATGCGTGTTACCAC1441TTTTAACACATTCCTTCTCACTTTGGGAACTGTCGCTGTCGTCAATGCCGAAACGGGCAADB21/T2395—20151501CAAATATATAGAAAAACGCGCTATCGACCTAAGTCGAGAGCGAGACCCTAACTTTTTCGA1561CCACCCTGATATTCCTGTACCCGAATGTTTTTGGTTTATGTTTAAAAACAACGTACGTCA1621AGATGCTGGAACCTGTTACAGCTCTTGGAAAATGGACATGAAAGTTGGTCCAAACTGGGT1681CCATATTAAATCAGACGATAATTGCAATTTGTCGGGCGACTTCCCTCCAGGTTGGATTGT1741TTTGGGGAAAAAAAGGCCCGGCTTTTAAATTAAAAGGAAATCACAGTTAAGGCAACGTAG1801GGAGGTTTGACGAGGTTTACGCTTGGTTGACGGCTCATAAGASeq8CTGCACACATCAACAGTCTTTCAATTTTCGCCTTCCCATTTTTAAACATACTTTTTAACATTTTACAGAC1381TCTTCTTTAACTTTGTTTGCAAAAGACATTATTTTGAAAAGTCAATATGCGTGTTACCAC1441TTTTAACACATTCCTTCTCACTTTGGGAACTGTCGCTGTCGTCAATGCCGAAACGGGCAA1501CAAATATATAGAAAAACGCGCTATCGACCTAAGTCGAGAGCGAGACCCTAACTTTTTCGA1561CCACCCTGGTATTCCTGTACCCGAATGTTTTTGATTTATGTTTAAAAACAACGTACGTCA1621AGATGCTGGAACCTGTTACAGCTCTTGGAAAATGGACATGAAAGTTGGTCCAAACTGGGT1681CCATATTAAATCAGACGATAATTGCAATTTGTCGGGCGACTTCCCTCCAGGTTGGATTGT1741TTTGGGGAAAAAAAGGCCCGGCTTTTAAATTAAAAGGAAATCACAGTTAAGGCAACGTAG1801GGAGGTTTGACGAGGTTTACGCTTGGTTGACGGCTCATAAGASeq91021TTCCAAACATACAAACAATTATCCACTGACTGAAAATCGACAGTTTTGTTTGCACAATCA1081ACATTATAATTACAATTAAAAACTTCTGCACAATTAACATTATTTTTGCAATTATGCTTT1141TTTATTCATTATTTTTTTTTCACACCGTTGCGATTTCGGCCTTCACCAACATTGGCACCT1201TTTCACACCCAGTTTACGATTACAATCCAATTCCAAACCATATCCACGGAGATTTAAAAA1261GGCGGGCTTATATTGAACGCTATTCCCAATGTTCAGATTCGCAGGCCTCCGAAATTCGTG1321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