2025版高考生物二輪復(fù)習(xí)課件 第一部分 專題九 爭(zhēng)分點(diǎn)突破2 基因工程

基因工程爭(zhēng)分點(diǎn)突破2

一

核心提煉1.限制酶的選擇技巧(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)選擇限制酶①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇限制酶SmaⅠ。②為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也能被切出相同的黏性末端，如圖乙)。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)選擇限制酶(如圖)(3)根據(jù)Ti質(zhì)粒的T－DNA片段選擇限制酶。圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(假設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程(如圖)3.Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)(1)Cre重組酶：由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，具有限制酶特性，能夠特異性識(shí)別LoxP位點(diǎn)。能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。(2)LoxP序列：來(lái)源于P1噬菌體，包括兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的間隔區(qū)域，反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識(shí)別位點(diǎn)，而間隔區(qū)域決定了LoxP位點(diǎn)的方向。(3)①同向LoxP：如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列，僅保留一個(gè)LoxP。②反向LoxP：如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列倒位。4.CRISPR/Cas9基因編輯CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌體內(nèi)的用來(lái)對(duì)抗侵略細(xì)菌的外源DNA或噬菌體的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR是成簇的、規(guī)律間隔的、短回文重復(fù)DNA序列。Cas9蛋白是一種RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切核酸酶，當(dāng)細(xì)菌受到噬菌體的侵染時(shí)，噬菌體的某段DNA序列被Cas9內(nèi)切酶剪切后整合到CRISPR的間隔序列區(qū)域，當(dāng)相同種類的噬菌體再次侵染細(xì)菌時(shí)，轉(zhuǎn)錄的crRNA可以引導(dǎo)Cas9蛋白找到并切斷噬菌體(形成平末端)釋放到細(xì)菌體內(nèi)的DNA，從而阻止噬菌體在細(xì)菌體內(nèi)繁殖。其作用機(jī)制大體可以分為三個(gè)步驟：(1)內(nèi)切酶(Cas9酶)切割噬菌體獲取新的間隔序列；(2)將其引入原間隔序列并轉(zhuǎn)錄出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成復(fù)合物精準(zhǔn)切割與新間隔序列相同的基因。具體過(guò)程如圖所示。5.In－Fusion技術(shù)In－Fusion技術(shù)即無(wú)縫克隆和組裝技術(shù)，是一種新型的、快速、簡(jiǎn)潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)DNA片段的插入。具體原理：在載體末端和目的基因兩端應(yīng)具有15～25個(gè)同源堿基，而目的基因兩端的同源序列往往是通過(guò)引物設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)的，In－Fusion酶能夠識(shí)別具有相同末端序列的線性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA連接酶再將兩條DNA單鏈黏合起來(lái)。(1)質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程：①采用酶切或者PCR擴(kuò)增方法將載體線性化；②使用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行目的DNA片段的PCR擴(kuò)增；③反應(yīng)體系內(nèi)形成重組質(zhì)粒。(2)與傳統(tǒng)酶切、酶連相比的優(yōu)勢(shì)：①位點(diǎn)選擇靈活，在載體任意位置進(jìn)行基因克??；②快速簡(jiǎn)便；③克隆效率高，陽(yáng)性克隆高達(dá)90%以上；④可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)DNA片段。判斷下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的敘述(1)基因表達(dá)載體上的啟動(dòng)子是DNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，而終止子是使翻譯過(guò)程在需要的地方停下來(lái)(

)提示：基因表達(dá)載體上的啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，用于驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄；終止子使轉(zhuǎn)錄過(guò)程在所需要的地方停下來(lái)?！?2)基因表達(dá)載體具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，有助于目的基因的表達(dá)，而復(fù)制原點(diǎn)的作用是保證標(biāo)記基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存(

)提示：載體具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便構(gòu)建基因表達(dá)載體；復(fù)制原點(diǎn)可以保證重組DNA分子在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制?！?3)在果實(shí)中表達(dá)acs(乙烯合成關(guān)鍵酶基因)的反義基因可延遲果實(shí)成熟(

)(4)利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在腈水合酶(N0)的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩(wěn)定的融合型腈水合酶(N1)，加入連接肽需要通過(guò)改造基因?qū)崿F(xiàn)(

)√√(5)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，在DNA溶液中加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色(

)提示：將DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺試劑，沸水浴加熱五分鐘，待冷卻后，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色?！?6)“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，離心研磨液是為了加速DNA的沉淀(

)提示：“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，離心研磨液是為了加速細(xì)胞碎片的沉淀。×(7)粗提取DNA時(shí)，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，向過(guò)濾后所得濾液中加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精后再進(jìn)行過(guò)濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對(duì)含量較高的白色絲狀物(

)×提示：向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，向過(guò)濾后所得濾液中加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精，此時(shí)DNA析出，不會(huì)進(jìn)入濾液中。二

真題演練1.(2024·全國(guó)甲，38節(jié)選)質(zhì)粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點(diǎn)，限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在_____________________________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)；使用酶c單酶切構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)宜選用的連接酶是_______________。避免目的基因和質(zhì)粒的反向連接、防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化T4DNA連接酶2.(2023·全國(guó)乙，38節(jié)選)GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因?yàn)椴牧?，利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白?？蒲腥藛T從構(gòu)建的GFP突變基因文庫(kù)中提取目的基因(均為突變基因)構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如圖所示(箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向)。圖中①為_(kāi)_______；②為_(kāi)_______，其作用是____________________________________________________；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標(biāo)記基因，其作用是___________________________________________________________________。終止子啟動(dòng)子RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)3.(2022·福建，13節(jié)選)載體和CD14片段的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切抗性基因序列如圖所示。用XhoⅠ和SalⅠ分別酶切CD14和圖中載體連接，CD14接入載體時(shí)會(huì)形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA?？蛇M(jìn)一步用這兩種限制酶對(duì)CD14的連接方向進(jìn)行鑒定，理由是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。

正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點(diǎn)(限制酶的識(shí)別序列)；而反向連接的重組DNA會(huì)形成新的序列，沒(méi)有這兩種酶的酶切位點(diǎn)(沒(méi)有限制酶的識(shí)別序列)4.(2024·新課標(biāo)，35節(jié)選)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細(xì)菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如圖所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列問(wèn)題：(1)限制酶切割的化學(xué)鍵是____________。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時(shí)，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，原因是__________________________________________________________________________。磷酸二酯鍵

不破壞N基因，使M1與M2之間有啟動(dòng)子、N基因、終止子，能保證N基因正常表達(dá)(2)CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對(duì)可以形成的堿基對(duì)有G－C和____________________。C－G、A－T、U－A5.(2024·湖南，21節(jié)選)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價(jià)值，科研人員對(duì)其進(jìn)行了多種育種技術(shù)研究。研究人員從野生百合中獲得一個(gè)抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因L，該基因及其上游的啟動(dòng)子pL和下游的終止子結(jié)構(gòu)如圖a。圖b是一種Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中基因gus編碼GUS酶，GUS酶活性可反映啟動(dòng)子活性。(1)研究病原微生物對(duì)L的啟動(dòng)子pL活性的影響。從圖a所示結(jié)構(gòu)中獲取pL，首先選用_________________酶切，將其與相同限制酶酶切的Ti質(zhì)粒連接，再導(dǎo)入煙草。隨機(jī)選取3組轉(zhuǎn)基因成功的煙草(P1、P2和P3)進(jìn)行病原微生物脅迫，結(jié)果如圖c。由此可知：三種病原微生物都能誘導(dǎo)pL的活性增強(qiáng)，其中_________的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。HindⅢ、BamHⅠ交鏈格孢根據(jù)目的片段以及質(zhì)粒上限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，若要獲得啟動(dòng)子pL并連接到質(zhì)粒上，可選用限制酶HindⅢ、BamHⅠ進(jìn)行酶切，以替換Ti質(zhì)粒中的啟動(dòng)子，從而達(dá)到根據(jù)GUS酶活性反映啟動(dòng)子活性的目的。根據(jù)圖c的結(jié)果可知，交鏈格孢處理的每一組轉(zhuǎn)基因煙草中的GUS酶活性都最高，可確定其誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。(2)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)栽培種百合B中也有L，但其上游的啟動(dòng)子與野生百合不同，且抗病性弱。若要提高該百合中L的表達(dá)量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，簡(jiǎn)要寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)思路：_____________________________________________________________________。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將百合B中基因L的啟動(dòng)子替換為野生百合中基因L的啟動(dòng)子pL欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將百合B中基因L的啟動(dòng)子替換為野生百合中基因L的啟動(dòng)子pL。6.(2023·海南，20節(jié)選)我國(guó)開(kāi)發(fā)了一種新型基因遞送系統(tǒng)(切—浸—生芽，簡(jiǎn)稱CDB法)。圖1與圖2分別是利用常規(guī)轉(zhuǎn)化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。則：(1)圖1與圖2中，農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，可將外源基因遞送到植物細(xì)胞中的原因是________________________________________________________

農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒中的T－DNA能將外源基因遞送到植物細(xì)胞中，并與植物細(xì)胞的染色體DNA整合到一起___________________________________________________。(2)已知某酶(PDS)缺失會(huì)導(dǎo)致植株白化。某團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體(含有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因)，利用圖2中的CDB法將該重組載體導(dǎo)入植株B，長(zhǎng)出毛狀根，成功獲得轉(zhuǎn)化植株B。據(jù)此分析，從毛狀根中獲得陽(yáng)性毛狀根段的方法是______________________________________，圖2中，鑒定導(dǎo)入幼苗中的基因編輯載體是否成功發(fā)揮作用的方法是___________________________，依據(jù)是____________________________________________________________________________________。熒光檢測(cè)選擇帶有綠色熒光標(biāo)記的毛狀根觀察幼苗是否表現(xiàn)出白化特征致植株白化，白化苗的出現(xiàn)意味著通過(guò)基因編輯技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)PDS基因的敲除PDS缺失會(huì)導(dǎo)三

模擬預(yù)測(cè)1.研究人員將靛藍(lán)色素酶基因(IDG)與啟動(dòng)子PTL12(棉纖維細(xì)胞特異啟動(dòng)子)相連以構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖，KpnⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ代表不同限制酶，圖中質(zhì)粒上酶的位置為其對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn))，并最終培育出能在棉纖維細(xì)胞中表達(dá)靛藍(lán)色素酶的彩色棉新品種。本研究中將IDG與啟動(dòng)子PTL12結(jié)合的主要目的是______________________________________________________________________________________________。PTL12是棉纖維細(xì)胞特異啟動(dòng)子，將IDG與特異啟動(dòng)子PTL12結(jié)合可以使IDG基因在棉纖維細(xì)胞中特異表達(dá)過(guò)程①②都使用KpnⅠ切割質(zhì)粒，目的是__________________________________________________________________________________。形成相同的黏性末端，使PTL12片段能與IDG按設(shè)計(jì)方向正確連接，保證IDG的正確表達(dá)2.(2024·天津?qū)幒訁^(qū)高三一模)藍(lán)細(xì)菌中的ictB蛋白能高效轉(zhuǎn)運(yùn)和濃縮CO2，從而提高細(xì)胞光合速率。我國(guó)科學(xué)家構(gòu)建了葉片特異性啟動(dòng)子Cab(葉綠體捕光色素蛋白Cab基因啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)的藍(lán)細(xì)菌ictB基因表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)ictB基因水稻，大大提高了水稻的產(chǎn)量。在ictB基因表達(dá)載體的構(gòu)建中，含Cab啟動(dòng)子和ictB基因的重組DNA分子和Ti質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)如圖1所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)為使重組DNA分子能定向插入T－DNA中，可用PCR的方法在重組DNA分子兩端添加限制酶識(shí)別序列，據(jù)圖可知，M端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是________，N端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是________。添加了限制酶識(shí)別序列的重組DNA分子與Ti質(zhì)粒的重組過(guò)程共需要______種酶。Bgl

ⅠEcoRⅤ4據(jù)圖1可知，重組DNA分子中有BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，故不能選擇BamHⅠ，又因?yàn)镾au3AⅠ也可識(shí)別BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，故也不能選擇Sau3AⅠ，又由于Spe

Ⅰ能切割Cab啟動(dòng)子，也不能選擇，故只能選擇Bgl

Ⅰ和EcoRⅤ，再根據(jù)啟動(dòng)子的方向可知，M端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是Bgl

Ⅰ，N端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是EcoRⅤ；添加了限制酶識(shí)別序列的重組DNA分子與Ti質(zhì)粒的重組過(guò)程共需要4種酶，分別是Bgl

Ⅰ、EcoRⅤ、DNA連接酶和Sau3AⅠ(切割Ti質(zhì)粒)。_____________________________________。檢測(cè)應(yīng)選用的植物器官是______，原因是_________________________________________________________________。(2)將農(nóng)桿菌液浸泡過(guò)的水稻愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入________進(jìn)行篩選，最終獲得多個(gè)水稻株系a1、a2、a3、a4。對(duì)a1～a4四個(gè)水稻株系的ictB蛋白表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2，其中a4株系ictB蛋白表達(dá)量較低的原因可能是_________潮霉素a4水稻株葉片系中沒(méi)有導(dǎo)入目的基因或目的基因未表達(dá)Cab啟動(dòng)子是葉片特異性啟動(dòng)子，它使ictB基因只能選擇性地在葉片中表達(dá)由圖1可知潮霉素抗性基因位于Ti質(zhì)粒的T－DNA上，隨T－DNA整合到水稻細(xì)胞的染色體上，所以將農(nóng)桿菌液浸泡過(guò)的水稻愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入潮霉素進(jìn)行篩選，篩選出的愈傷組織可再分化形成叢芽，最終獲得多個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系；蛋白質(zhì)的表達(dá)量與基因的表達(dá)有關(guān)，故a4株系ictB蛋白表達(dá)量較低的原因可能是其沒(méi)有導(dǎo)入目的基因或目的基因沒(méi)有表達(dá)。由于Cab啟動(dòng)子是葉片特異性啟動(dòng)子，它使ictB基因只能選擇性地在葉片中表達(dá)，故檢測(cè)應(yīng)選用的植物器官是葉片。3.隨著土壤鹽漬化(主要是Na＋引起)不斷加劇，提高耐鹽性已成為研究和改良作物的重要方向。從高鹽環(huán)境中吸收K＋可維持細(xì)胞內(nèi)K＋/Na＋穩(wěn)態(tài)，從而提高植物的耐鹽性。H是細(xì)胞膜上的一種K＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，B蛋白可以增強(qiáng)H的功能。為探究作用機(jī)理，研究人員構(gòu)建了兩個(gè)分別含有CFP－B和YFP－H融合基因的表達(dá)載體。CFP和YFP分別是青色熒光蛋白基因和黃色熒光蛋白基因。為了獲得含CFP－B的表達(dá)載體，選擇了已經(jīng)包含CFP的載體p1300－CFP。相關(guān)信息如圖所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)為將B基因連入CFP基因，需使用兩端帶有酶切位點(diǎn)序列的引物擴(kuò)增B基因，優(yōu)先選擇的酶切位點(diǎn)是________________，理由是___________________________________________________________________________________。BamHⅠ和Pst

ⅠBsrGⅠ在CFP基因中存在，不能使用；雙酶切可避免目的基因和載體自身環(huán)化和反向連接(2)據(jù)此，研究人員使用的兩條引物序列分別為5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分別代表(1)選擇的酶切位點(diǎn)，N代表任意堿基的核苷酸。第一條引物中NN的作用是___________________________________________________________________。

使得CFP與B基因之間的堿基個(gè)數(shù)為3的倍數(shù)，翻譯時(shí)B基因不發(fā)生移碼第二條引物與圖中B基因末端序列不相同的原因是____________________________________________________________________________________________________________。用同樣的方法獲得了含YFP－H融合基因的表達(dá)載體。

第一條引物與模板鏈配對(duì)，序列與圖示B基因序列相同，第二條引物與非模板鏈配對(duì)，序列應(yīng)與圖示B基因序列互補(bǔ)4.通過(guò)體內(nèi)同源重組可以進(jìn)行靶向基因敲除，原理如圖1所示。同源重組技術(shù)結(jié)合tetr－sacB雙重選擇系統(tǒng)可對(duì)基因進(jìn)行敲除與回補(bǔ)，研究基因的功能。圖2是科研人員利用該方法對(duì)大腸桿菌LacZ基因進(jìn)行敲除與回補(bǔ)的相關(guān)過(guò)程，其中tetr是四環(huán)素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物能將無(wú)色化合物X－gal水解成藍(lán)色化合物。限制酶EcoRⅠBamHⅠHindⅢXma

Ⅰ識(shí)別序列和切割位點(diǎn)↓5′—GAATTC—3′

↓5′—GGATCC—3′

↓5′—AAGCTT—3′

↓5′—CCCGGG—3′回答下列問(wèn)題：(1)據(jù)圖1分析，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，體內(nèi)同源重組具有的特點(diǎn)是_____________________________。無(wú)需使用限制酶和DNA連接酶(2)圖2過(guò)程①中，設(shè)計(jì)兩種引物時(shí)需在引物5′端分別添加________、________限制酶的識(shí)別序列；過(guò)程⑤中，設(shè)計(jì)兩種引物時(shí)需在引物5′端分別添加________基因兩端的同源序列。(3)圖2過(guò)程⑦中，在含有_______________的培養(yǎng)基中出現(xiàn)了白色菌落，即為篩選出的敲除LacZ基因菌株。過(guò)程⑧通過(guò)同源重組技術(shù)結(jié)合tetr－sacB雙重選擇系統(tǒng)可對(duì)LacZ基因進(jìn)行回補(bǔ)，篩選LacZ基因回補(bǔ)菌株時(shí)應(yīng)在培養(yǎng)基中添加______________。EcoRⅠBamHⅠLacZ四環(huán)素和X－gal蔗糖和X－gal5.PMP22基因在人基因組中有多個(gè)拷貝，表達(dá)產(chǎn)生的PMP22蛋白在人髓鞘細(xì)胞中不可或缺，但PMP22蛋白過(guò)量可引發(fā)腓骨肌萎縮癥(CMT1A)，科研人員希望利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)治療CMT1A?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)原理如圖1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA雙鏈，造成DNA損傷，一次切割過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生____個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。機(jī)體修復(fù)DNA損傷時(shí)，可能會(huì)改變堿基序列。圖中g(shù)RNA的作用是___________________________________。2定向引導(dǎo)Cas9蛋白與靶向基因結(jié)合(2)科研人員本來(lái)的基因編輯方案是將gRNA結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)在PMP22基因內(nèi)部，后改為如圖2所示的方案，該方案比起原方案的優(yōu)點(diǎn)是_________________________________________________________________________________________________。既能專一性切除多余的PMP22基因，又能確保必要的PMP22基因不被破壞，比破壞PMP22基因結(jié)構(gòu)更可靠(3)科研人員希望在人髓鞘細(xì)胞中表達(dá)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，構(gòu)建的基因表達(dá)載體如圖3所示。①在對(duì)gRNA對(duì)應(yīng)的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，需要在上游和下游引物的5′端分別添加堿基序列__________________和__________________，保證DNA片段定向插入。②基因表達(dá)載體上，除了圖示序列和標(biāo)記基因外，還需要的序列是_________。5′－GTCGAC－3′5′－GGATCC－3′Cas9基因?yàn)楸ＷC不破壞復(fù)制原點(diǎn)，DNA上游需添加Sal

Ⅰ的識(shí)別序列；由于Xho

Ⅰ與Sal

Ⅰ為同尾酶，為避免目的基因與載體任意連接，DNA下游需添加BamHⅠ的識(shí)別序列。6.(2024·青島高三二模)某種雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突變?yōu)閙所致，科研團(tuán)隊(duì)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因智能不育系的思路是將育性恢復(fù)基因OsNP1(在原始生殖細(xì)胞中表達(dá))、花粉失活基因ZM－AA(在花粉中表達(dá))兩個(gè)基因一起構(gòu)建重組Ti質(zhì)粒。然后通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胗鷤M織細(xì)胞，從轉(zhuǎn)基因后代中篩選m位點(diǎn)是純合但兩個(gè)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)是雜合的可育植株。(1)圖1為已導(dǎo)入ZM－AA基因的重組Ti質(zhì)粒，圖2為OsNP1基因和相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，其中A鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈。為使OsNP1基因與圖1中Ti質(zhì)粒正確連接來(lái)構(gòu)建基因表達(dá)載體，應(yīng)選擇的酶有_____________________________；采用PCR技術(shù)擴(kuò)增圖2中的OsNP1基因時(shí)，會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)、中、短三種長(zhǎng)度的單鏈，一個(gè)OsNP1基因在第n次循環(huán)中新合成的短鏈數(shù)為_(kāi)______。BamHⅠ、HindⅢ和DNA連接酶2n－2圖1重組Ti質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間含有三種酶的酶切位點(diǎn)，即EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ，而圖2OsNP1基因兩端的酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ，EcoRⅠ酶切會(huì)導(dǎo)致目的基因和Ti質(zhì)粒自身環(huán)化和反向連接，為使OsNP1基因與圖1中Ti質(zhì)粒正確連接來(lái)構(gòu)建基因表達(dá)載體，應(yīng)選擇的酶是BamHⅠ、HindⅢ和DNA連接酶。PCR技術(shù)擴(kuò)增會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)、中、短三種長(zhǎng)度的單鏈，分別代表模板鏈、引物鏈(第一次擴(kuò)增形成的)、新合成的短鏈；一個(gè)OsNP1基因在n－1次循環(huán)中共形成2n－1個(gè)DNA分子、形成2n個(gè)DNA單鏈，而這些單鏈中只有模板鏈不會(huì)新合成短鏈，則第n次循環(huán)中新合成短鏈的數(shù)目＝2n－2。(2)重組Ti質(zhì)粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具體作用分別是_________________________________、_______________________________。篩選出導(dǎo)入目的基因的愈傷組織細(xì)胞篩選出導(dǎo)入重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌新霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，用于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞(愈傷組織細(xì)胞)；卡那霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記基因，用于篩選含有重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。(3)若使兩個(gè)基因分別在不同的細(xì)胞中表達(dá)，需將兩個(gè)基因分別與_____________________________________________重組在一起。在特定細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因啟動(dòng)子等調(diào)控元件四

專題強(qiáng)化練12345678910111213答案對(duì)一對(duì)題號(hào)12345678910答案ADACCBCABCACDBD題號(hào)11答案(1)低256(或44)

GTTT

CAAT(或CAAT

GTTT)

(2)卡那霉素SacⅠ

④

(3)1/412345678910111213對(duì)一對(duì)題號(hào)

12答案(1)Cla

Ⅰ

Mun

Ⅰ

(2)4

P4與A擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的WAP基因的啟動(dòng)子，EPO基因不表達(dá)(3)能使EPO基因在大鼠的乳腺細(xì)胞中特異性表達(dá)(4)EPO基因是真核生物的基因，該基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA無(wú)法在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)加工成熟，表達(dá)出來(lái)的產(chǎn)物不是EPO題號(hào)13答案(1)DNA聚合酶和DNA連接酶引物F13′端序列(2)BclⅠ和SmaⅠ

①④

(3)先篩選出能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌，再用含草甘膦的培養(yǎng)基篩選出導(dǎo)入融合基因的擬南芥細(xì)胞(4)根促進(jìn)植物對(duì)磷元素的吸收答案1.(2024·江西，12)γ-氨基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。利用L-谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導(dǎo)入生產(chǎn)菌株E.coliA，構(gòu)建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是A.圖示表明，可以從釀酒酵母S

中分離得到目的基因gadBB.E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸時(shí)，

L-谷氨酸鈉的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)?！?2345678910111213答案由圖示可知，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，A正確；由題干可知，E.coliB以L-谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸，因此L-谷氨酸鈉為反應(yīng)底物，而不是起供能作用，B錯(cuò)誤；E.coli

A和E.coliB均為生產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌種，故二者均不能高效降解γ-氨基丁酸，C錯(cuò)誤；根據(jù)題干及題圖給出的信息，無(wú)法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒，D錯(cuò)誤。12345678910111213答案2.(2024·永州高三模擬)自然界中很少出現(xiàn)藍(lán)色的花，天然藍(lán)色花出現(xiàn)的主要原因是花瓣細(xì)胞液泡中的花青素在堿性條件下顯藍(lán)色。我國(guó)科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建了基因表達(dá)載體(如圖)，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將上述基因?qū)氚酌倒?，在?xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)。下列相關(guān)敘述正確的是A.不同限制酶的識(shí)別序列都是由6個(gè)脫

氧核苷酸組成的B.將idgS基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)使用的限制

酶是SpeⅠ和BamHⅠC.將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)使用的限制酶是PmeⅠ和SacⅠD.啟動(dòng)子和終止子不表達(dá)出蛋白質(zhì)，都屬于基因的調(diào)控序列√12345678910111213答案大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)脫氧核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的脫氧核苷酸組成，A錯(cuò)誤；由圖可以看出，idgS基因插入Ti質(zhì)粒的SpeⅠ和SacⅠ兩個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)之間，sfp基因插入Ti質(zhì)粒的啟動(dòng)子1和終止子1之間；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)，可使用限制酶BamHⅠ，將idgS基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)，可用SpeⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切割，B、C錯(cuò)誤；啟動(dòng)子和終止子不表達(dá)出蛋白質(zhì)，都屬于基因的調(diào)控序列，D正確。12345678910111213答案3.由于PCR擴(kuò)增出的目的基因末端為平末端，且無(wú)合適的限制酶識(shí)別序列，需借助中間載體P將目的基因接入載體E。圖示為兩種載體的結(jié)構(gòu)和相關(guān)限制酶的識(shí)別序列，下列敘述正確的是A.構(gòu)建重組載體P時(shí)，應(yīng)選擇EcoRⅤ進(jìn)

行酶切，再用T4DNA連接酶連接B.為了便于該目的基因接入載體E，可

用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割載體PC.載體P不能作為基因表達(dá)載體，是因

為它不含起始密碼子和終止密碼子D.若受體細(xì)胞表現(xiàn)出抗性基因的相應(yīng)性狀，表明重組載體成功導(dǎo)入受體細(xì)胞√12345678910111213答案由于載體E只有產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，要使中間載體P接入載體E，同時(shí)防止載體E自身環(huán)化，需要用兩種限制酶分別切割載體E和中間載體P，據(jù)圖可知，中間載體P和載體E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶識(shí)別序列，故可選用XhoⅠ和PstⅠ酶進(jìn)行酶切，載體P的這兩種酶識(shí)別序列中含有EcoRⅤ識(shí)別位點(diǎn)，并且其切割產(chǎn)生平末端，可以用于連接目的基因，SmaⅠ酶雖然也能切割得到平末端，但是其識(shí)別位點(diǎn)沒(méi)有位于XhoⅠ和PstⅠ酶識(shí)別位點(diǎn)之間，故不能選擇其對(duì)中間載體P進(jìn)行切割，連接平末端用T4DNA連接酶，A正確，B錯(cuò)誤；12345678910111213答案由圖可知，不直接選擇P構(gòu)建表達(dá)載體是因?yàn)樗缓瑔?dòng)子與終止子，C錯(cuò)誤；受體細(xì)胞表現(xiàn)出抗性基因的相應(yīng)性狀，可能是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，也可能只導(dǎo)入了空質(zhì)粒(不含目的基因的質(zhì)粒)，D錯(cuò)誤。12345678910111213答案4.目的基因和載體如果用同一種限制酶處理，連接時(shí)會(huì)出現(xiàn)正反接的情況，為鑒定篩選出的表達(dá)載體中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR后，結(jié)合電泳技術(shù)鑒定，圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，其中目的基因?yàn)殚L(zhǎng)度300bp的片段。下列有關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.PCR復(fù)性溫度不宜太低，避免引物錯(cuò)配和模板鏈

形成雙鏈B.電泳條帶遷移的位置和速度與DNA分子的大小和

構(gòu)象有關(guān)C.選取引物甲、丙，擴(kuò)增出450bp長(zhǎng)度片段時(shí)，可以說(shuō)明目的基因正接D.選取引物甲、乙，擴(kuò)增出400bp長(zhǎng)度片段時(shí)，可以說(shuō)明目的基因反接12345678910111213答案√復(fù)性是在高溫解旋后降低溫度讓引物與模板鏈結(jié)合，復(fù)性溫度不宜太低，避免引物錯(cuò)配和模板鏈形成雙鏈，A正確；電泳條帶遷移的位置和速度與DNA分子的大小和構(gòu)象有關(guān)，電泳一段時(shí)間后，較大的DNA分子遷移距離小，離加樣孔近，而較小的DNA分子遷移距離大，離加樣孔遠(yuǎn)，B正確；12345678910111213答案由于使用的引物是甲和丙，沒(méi)有與基因相應(yīng)位置配對(duì)，因此不管目的基因正接還是反接，擴(kuò)增出的片段均為450bp，C錯(cuò)誤；選取引物甲和乙，擴(kuò)增出400bp長(zhǎng)度片段時(shí)，可以說(shuō)明目的基因反接，若正接，不能擴(kuò)增出100bp的片段，D正確。12345678910111213答案5.普通棉花中β-甘露糖苷酶基因表達(dá)出的GhMnaA2能催化半纖維素降解，使棉纖維長(zhǎng)度變短。為了培育長(zhǎng)絨棉，科研人員構(gòu)建了反義GhMnaA2基因表達(dá)載體(將正義GhMnaA2基因與載體反向連接)，獲得了轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)絨棉新品種，具體過(guò)程如圖所示，圖中SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ代表相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正義表達(dá)載體可獲得3kb、18kb、28kb、59kb4種長(zhǎng)度的DNA片段。下列敘述正確的是A.正義GhMnaA2基因的轉(zhuǎn)錄方向是B→AB.過(guò)程①得到的表達(dá)載體均為反義表達(dá)載體C.反義GhMnaA2基因可能通過(guò)抑制GhMnaA2

基因的翻譯來(lái)保證棉纖維長(zhǎng)度D.用NotⅠ切割反義表達(dá)載體獲得的DNA片段

的長(zhǎng)度為21kb和87kb√12345678910111213答案由圖可知，反義表達(dá)載體中，反義GhMnaA2基因轉(zhuǎn)錄方向是B→A，則正義GhMnaA2基因的轉(zhuǎn)錄方向是A→B，A錯(cuò)誤；由于只能由SmaⅠ來(lái)構(gòu)建反義表達(dá)載體，因此過(guò)程①得到的表達(dá)載體可能為反義表達(dá)載體，也可能為正義表達(dá)載體，B錯(cuò)誤；12345678910111213答案反義GhMnaA2基因轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA與正常轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)，從而阻止其與核糖體結(jié)合，即反義GhMnaA2基因可能通過(guò)抑制GhMnaA2基因的翻譯來(lái)保證棉纖維長(zhǎng)度，C正確；12345678910111213答案用SmaⅠ和NotⅠ切割正義表達(dá)載體可獲得3kb、18kb、28kb、59kb4種長(zhǎng)度的DNA片段，據(jù)此判斷左側(cè)SmaⅠ和NotⅠ之間的長(zhǎng)度是59kb，A位置處SmaⅠ和NotⅠ之間的長(zhǎng)度是3kb，B位置處SmaⅠ和NotⅠ之間的長(zhǎng)度是18kb，右上角E6位置處SmaⅠ和NotⅠ之間的長(zhǎng)度是28kb，故用NotⅠ切割反義表達(dá)載體獲得的DNA片段的長(zhǎng)度應(yīng)分別為18＋28＝46(kb)和3＋59＝62(kb)，D錯(cuò)誤。12345678910111213答案6.雙向啟動(dòng)子可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)RNA聚合酶來(lái)驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)，研究人員構(gòu)建了圖示表達(dá)載體，以檢測(cè)雙向啟動(dòng)子作用效果。下列分析不正確的是A.可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好

的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞B.為連入GUS基因，需用SalⅠ

和SphⅠ酶切已整合了雙向

啟動(dòng)子及LUC基因的質(zhì)粒C.在培養(yǎng)基中添加壯觀霉素可篩選出成功導(dǎo)入該表達(dá)載體的微生物受體細(xì)胞D.可通過(guò)觀察是否出現(xiàn)熒光和藍(lán)色物質(zhì)確認(rèn)雙向啟動(dòng)子的作用√12345678910111213答案將基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，A正確；如果用SphⅠ酶切已整合了雙向啟動(dòng)子及LUC基因的質(zhì)粒時(shí)就會(huì)破壞LUC基因，B錯(cuò)誤；如果成功導(dǎo)入含有壯觀霉素抗性基因的基因表達(dá)載體，受體細(xì)胞就具有抗壯觀霉素的能力，在含有壯觀霉素的培養(yǎng)基上能生存，因此可以篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的微生物受體細(xì)胞，C正確；雙向啟動(dòng)子如果正常表達(dá)，就會(huì)合成熒光素酶和β-葡萄糖苷酶，二者催化底物分別產(chǎn)生熒光或生成藍(lán)色物質(zhì)，從而確定雙向啟動(dòng)子的作用，D正確。12345678910111213答案7.(2024·常德高三三模)研究人員將目的基因插入質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程如圖所示，再將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中。由β-半乳糖苷酶基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈藍(lán)色，否則菌落為白色。下列敘述錯(cuò)誤的是A.將目的基因插入質(zhì)粒中時(shí)，需要用到的

酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA連接酶B.需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一

種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)C.將按圖示構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌

后，大腸桿菌可正常表達(dá)該目的基因D.在含X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可出現(xiàn)藍(lán)色菌落12345678910111213答案√目的基因兩側(cè)含有限制酶XhoⅠ、NheⅠ的識(shí)別序列，將目的基因插入質(zhì)粒中時(shí)，需要用到限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接在一起，A正確；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)，B正確；12345678910111213答案將按圖示構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，由于目的基因的轉(zhuǎn)錄方向和啟動(dòng)子的方向相反，大腸桿菌不能正常表達(dá)該目的基因，C錯(cuò)誤；在含X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，β-半乳糖苷酶基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈藍(lán)色，D正確。12345678910111213答案8.(不定項(xiàng))(2024·德州高三二模)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，其原理如圖1所示?？蒲腥藛T根據(jù)豬的細(xì)胞表面抗原基因RAG1的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)了sgRNA1和sgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了兩種基因敲除豬，檢測(cè)基因敲除豬體內(nèi)的RAG1基因表達(dá)情況如圖2所示。下列說(shuō)法正確的是12345678910111213答案12345678910111213答案A.CRISPR/Cas9識(shí)別目標(biāo)DNA序列主要與sgRNA序列的特異性相關(guān)B.基因敲除豬的細(xì)胞表面抗原減少，器官移植過(guò)程中免疫排斥作用減弱C.兩種sgRNA都可引導(dǎo)Cas9在轉(zhuǎn)錄水平上減弱RAG1基因的表達(dá)D.據(jù)圖2可知，用sgRNA2制備的基因敲除豬用于器官移植效果更好√√√CRISPR/Cas9識(shí)別目標(biāo)DNA序列主要與sgRNA編碼序列有關(guān)，即主要與sgRNA序列的特異性相關(guān)，A正確；豬的細(xì)胞表面抗原會(huì)導(dǎo)致器官移植時(shí)發(fā)生免疫排斥，基因敲除豬的細(xì)胞表面抗原減少，器官移植過(guò)程中免疫排斥作用減弱，提高了器官移植的成功率，B正確；12345678910111213答案轉(zhuǎn)錄是以DNA的一條鏈為模板合成RNA的過(guò)程，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)，用于驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，科研人員根據(jù)豬的細(xì)胞表面抗原基因RAG1的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)了sgRNA1和sgRNA2，故兩種sgRNA都可引導(dǎo)Cas9在轉(zhuǎn)錄水平上減弱RAG1基因的表達(dá)，C正確；12345678910111213答案據(jù)圖2可知，與對(duì)照組相比，用sgRNA1制備的基因敲除豬RAG1基因表達(dá)量更低，說(shuō)明用sgRNA1制備的基因敲除豬用于器官移植效果更好，D錯(cuò)誤。12345678910111213答案9.(不定項(xiàng))(2024·永州高三一模)Cre/LoxP系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)特定基因的敲除(如圖1)。把幾種熒光蛋白基因和Cre酶能識(shí)別并切割的序列(LoxP1和LoxP2)串在一起，構(gòu)建表達(dá)載體T(如圖2)。部分熒光蛋白基因會(huì)被Cre酶隨機(jī)“剪掉”，且兩個(gè)LoxP1之間或兩個(gè)LoxP2之間的基因，最多會(huì)被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表達(dá)，隨機(jī)呈現(xiàn)不同的顏色。下列說(shuō)法正確的是A.Cre酶切下一個(gè)待敲除基因的過(guò)程，

需要破壞四個(gè)磷酸二酯鍵B.若小鼠細(xì)胞含一個(gè)表達(dá)載體T(不含

Cre酶)，其肌肉組織細(xì)胞呈紅色C.若小鼠細(xì)胞含一個(gè)表達(dá)載體T(含Cre酶)，其腦組織細(xì)胞呈紅色或黃色或藍(lán)色D.若小鼠細(xì)胞含兩個(gè)表達(dá)載體T(含Cre酶)，其一個(gè)腦組織細(xì)胞內(nèi)可能隨機(jī)出現(xiàn)兩種顏色√12345678910111213答案√√12345678910111213答案DNA單鏈上相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸之間通過(guò)磷酸二酯鍵相連，DNA由兩條單鏈螺旋纏繞形成，Cre酶切下一個(gè)待敲除基因的過(guò)程中，需要切斷基因前后兩端，因此需要破壞四個(gè)磷酸二酯鍵，A正確；據(jù)圖可知，小鼠有編碼紅、黃、藍(lán)熒光蛋白的基因，前端有腦組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，肌肉細(xì)胞不會(huì)表達(dá)顏色基因，故若小鼠細(xì)胞含一個(gè)表達(dá)載體T(不含Cre酶)，其肌肉組織細(xì)胞呈無(wú)色，B錯(cuò)誤；12345678910111213答案小鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)有2個(gè)相同表達(dá)載體T(含Cre酶)，Cre酶對(duì)每個(gè)DNA片段隨機(jī)剪切，因而細(xì)胞的顏色由細(xì)胞內(nèi)兩種熒光蛋白的顏色疊加而成，故其腦組織細(xì)胞可能隨機(jī)出現(xiàn)兩種顏色，D正確。10.(不定項(xiàng))(2024·青島高三二模)TaIBH1－2D是小麥中一個(gè)調(diào)控千粒重的關(guān)鍵基因。為驗(yàn)證TaIBH1－2D的功能，研究人員構(gòu)建了過(guò)表達(dá)株系，可利用酶切法檢驗(yàn)TaIBH1－2D與載體是否連接，圖1三個(gè)泳道分別是用不同的限制酶完全酶切后(只考慮圖示酶切位點(diǎn))，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果；同時(shí)構(gòu)建了敲除TaIBH1－2D基因的突變體。圖2統(tǒng)計(jì)了不同植株的千粒重。下列說(shuō)法正確的是12345678910111213答案A.電泳的緩沖液中含指示劑，可在紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)B.泳道1為單酶切空載體，泳道2為單酶切的重組載體C.泳道3為雙酶切的重組載體，且目的基因與載體正確連接D.由圖2分析，TaIBH1－2D負(fù)調(diào)控小麥千粒重√12345678910111213答案√載樣緩沖液中的指示劑指示電泳進(jìn)程，核酸染料加在凝膠中，凝膠中的DNA分子經(jīng)過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)，A錯(cuò)誤；12345678910111213答案泳道1和泳道2均出現(xiàn)一個(gè)條帶，說(shuō)明這兩個(gè)條帶都是單酶切得到的，因?yàn)橹亟M載體單酶切后的長(zhǎng)度大于空載體，泳道1的條帶長(zhǎng)度小于泳道2，則泳道1為單酶切空載體，泳道2為單酶切的重組載體，B正確；12345678910111213答案泳道3有一個(gè)條帶的大小與泳道1相同，且還有兩個(gè)較小的條帶，則泳道3為限制酶A和限制酶B雙酶切的重組載體，由于目的基因的兩側(cè)都有限制酶A的酶切位點(diǎn)，所以無(wú)法判斷目的基因與載體是否正確連接，C錯(cuò)誤；12345678910111213答案分析圖2，TaIBH1－2D基因過(guò)表達(dá)株系的千粒重小于野生型和敲除突變體的，說(shuō)明TaIBH1－2D負(fù)調(diào)控小麥千粒重，D正確。12345678910111213答案11.(2024·山東，25)研究發(fā)現(xiàn)基因L能夠通過(guò)脫落酸信號(hào)途徑調(diào)控大豆的逆境響應(yīng)。利用基因工程技術(shù)編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點(diǎn)處插入大豆基因L的向?qū)NA序列，將載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞后，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可引導(dǎo)核酸酶特異性結(jié)合基因組上的目標(biāo)序列并發(fā)揮作用。載體信息、目標(biāo)基因L部分序列及相關(guān)結(jié)果等如圖所示。12345678910111213答案LB/RB：T－DNA的邊界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr氨芐青霉素抗性基因。甲載體信息12345678910111213答案乙目標(biāo)基因L部分序列丙限制酶識(shí)別序列、切割位點(diǎn)及電泳結(jié)果(1)用PCR技術(shù)從大豆基因組DNA中擴(kuò)增目標(biāo)基因L時(shí)，所用的引物越短，引物特異性越____(填“高”或“低”)。限制酶在切開(kāi)DNA雙鏈時(shí)，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產(chǎn)生的黏性末端最多有_________種。載體信息如圖甲所示，經(jīng)BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應(yīng)為5′－______________－3′和5′－______________－3′。12345678910111213答案低256(或44)GTTT(或CAAT)CAAT(或GTTT)單鏈突出序列NNNN為黏性末端，N代表任意堿基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上能得到256種黏性末端。載體上有2個(gè)BsaⅠ酶切位點(diǎn)，最后兩個(gè)空序列為GTTT和CAAT，方向均從5′到3′。12345678910111213答案12345678910111213答案(2)重組載體通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入大豆細(xì)胞，使用抗生素_________篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點(diǎn)如圖乙所示，PCR產(chǎn)物完全酶切后的電泳結(jié)果如圖丙所示。據(jù)圖可判斷選用的限制酶是_______，其中純合的突變植株是______(填序號(hào))?？敲顾豐acⅠ④導(dǎo)入大豆細(xì)胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通過(guò)使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株。根據(jù)圖甲可知，目標(biāo)基因L的目標(biāo)序列跟突變序列之間的差異只有在SacⅠ酶切位點(diǎn)上存在差異，BamHⅠ和EcoRⅠ這兩個(gè)酶切位點(diǎn)完全相同，12345678910111213答案根據(jù)圖丙及題意可知，要以上述抗性植株的DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因L，并對(duì)PCR產(chǎn)物完全酶切后進(jìn)行電泳從而判斷植株含有的是目標(biāo)序列還是突變序列，因此只能選用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突變序列存在酶切位點(diǎn)，但是目標(biāo)序列沒(méi)有，因此經(jīng)過(guò)該酶酶切后突變序列的電泳條帶會(huì)出現(xiàn)兩條，目標(biāo)序列是一條，根據(jù)圖丙結(jié)果可知，只有④為純合的突變植株。12345678910111213答案(3)實(shí)驗(yàn)中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其體細(xì)胞中只有1條染色體有T－DNA插入。用抗生素篩選這個(gè)植株的自交子代，其中突變位點(diǎn)純合且對(duì)抗生素敏感的植株所占比例為_(kāi)____，篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。12345678910111213答案1/4根據(jù)題意可知，在實(shí)驗(yàn)中獲得了一株基因L成功突變的純合植株，已知該植株具有抗生素抗性，經(jīng)過(guò)檢測(cè)卻發(fā)現(xiàn)其體細(xì)胞中只有1條染色體有T－DNA插入。根據(jù)圖示可知，抗生素抗性基因在T－DNA片段上，因此如果用抗生素來(lái)篩選該植株進(jìn)行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例為1/2，不含T－DNA(對(duì)抗生素敏感)的配子比例為1/2，因此突變位點(diǎn)純合且對(duì)抗生素敏感的植株所占比例應(yīng)該為1/2×1/2＝1/4，篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。12345678910111213答案12.(2024·岳陽(yáng)高三期末)人促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種可用于治療腎性貧血的糖蛋白類激素，可用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)EPO?？蒲腥藛T利用大12345678910111213答案鼠乳清酸蛋白(WAP)基因上游的調(diào)控序列及啟動(dòng)子和3′UTR序列構(gòu)建了基因表達(dá)載體。構(gòu)建前，科研人員擴(kuò)增了WAP基因上游不同長(zhǎng)度的片段，將這些片段分別插入EPO基因中，以確定WAP基因啟動(dòng)子的具體位置。相關(guān)信息如圖所示，回答下列問(wèn)題：12345678910111213答案(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入基因表達(dá)載體中，以指導(dǎo)EPO基因的表達(dá)，需要在引物末端添加特定的限制酶識(shí)別序列。由圖中信息可知，在P1～P4末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是______，在A末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是_______。ClaⅠMunⅠ需要將WAP基因上游的調(diào)控序列及啟動(dòng)子和3′UTR序列與EPO基因相連，則擴(kuò)增的WAP基因上游的調(diào)控序列及啟動(dòng)子和3′UTR序列的5′端不能含有目的基因上的酶切位點(diǎn)，則P1～P4末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是ClaⅠ，WAP基因上游的調(diào)控序列及啟動(dòng)子和3′UTR序列的3′端需要與EPO基因相連，但是不能破壞EPO基因序列，也不能破壞WAP基因上游的調(diào)控序列及啟動(dòng)子和3′UTR序列，則A末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是MunⅠ。12345678910111213答案有EPO生成。含P4與A擴(kuò)增產(chǎn)物的個(gè)體沒(méi)有EPO生成的原因是___________________________________________________________。12345678910111213答案(2)將通過(guò)PCR處理后的含不同長(zhǎng)度的WAP基因上游序列與EPO基因連接，構(gòu)建成表達(dá)載體的過(guò)程中，需要____種限制酶切割上述DNA片段。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因雌性大鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入含P1～P3與A擴(kuò)增產(chǎn)物的個(gè)體乳汁中有EPO，而含P4與A擴(kuò)增產(chǎn)物的個(gè)體沒(méi)4P4與A擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的WAP基因的啟動(dòng)子，EPO基因不表達(dá)需要用兩種限制酶切割WAP基因上游的調(diào)控序列及啟動(dòng)子和3′UTR序列，用兩種限制酶切割EPO基因，所以共需要4種限制酶切割上述DNA片段。P4與A擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的WAP基因的啟動(dòng)子，EPO基因不表達(dá)，則含P4與A擴(kuò)增產(chǎn)物的個(gè)體沒(méi)有EPO生成。12345678910111213答案(3)該實(shí)驗(yàn)中，在EPO基因上游插入大鼠WAP基因啟動(dòng)子的理由是___________________________________________。能使EPO基因在大鼠的乳腺細(xì)胞中特異性表達(dá)12345678910111213答案啟動(dòng)子具有組織特異性，大鼠WA