(高清版)DB43∕T 953-2014 茄科蔬菜病毒病綠色防控技術(shù)操作

ofthesolanaceaevegetablevirusdiseases2014-10-21發(fā)布2014-11-20實(shí)施湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I前言 Ⅱ 1 13術(shù)語和定義 4發(fā)生流行規(guī)律 4.1接觸傳染病毒病流行規(guī)律 24.2蟲傳病毒病流行規(guī)律 25病害診斷 25.1病害田間診斷 25.2生物學(xué)檢測 2 25.4分子生物學(xué)檢測 2 27防治方法 37.1種苗防治 37.2農(nóng)業(yè)防治 3 4 47.5農(nóng)藥防治 5 59建立防治檔案 5附錄A(資料性附錄)茄科蔬菜病毒病癥狀 6附錄B(規(guī)范性附錄)病毒病生物學(xué)、血清、分子生物學(xué)檢測 7附錄C(規(guī)范性附錄)農(nóng)藥防治傳毒害蟲及病毒病一覽表 附錄D(資料性附錄)茄科蔬菜病毒病防治檔案 ⅡDB43/T953—2014本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省植物保護(hù)研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：湖南省植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉勇、張德詠、張卓、黃志龍、譚新球、文吉輝、孫淑娥、張宇、羅路云。11范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了茄科蔬菜病毒病的術(shù)語和定義、發(fā)生流行規(guī)律、病害診斷、本標(biāo)準(zhǔn)適用于辣椒、番茄、茄子等茄科蔬菜病毒病的綠色防控。2規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則瓜菜作物種子茄果類綠色食品農(nóng)藥使用準(zhǔn)則3術(shù)語和定義綠色防控技術(shù)Greencontroltechnical物防治、物理防治和科學(xué)用藥等資源節(jié)約型、環(huán)境友好型技術(shù)來控制農(nóng)作物病蟲害的植物保護(hù)措施。某些病毒亦可在發(fā)病植株殘體中長期存活；病毒在植物體內(nèi)進(jìn)行核酸(RNA或DNA)和蛋白外殼復(fù)制并4發(fā)生流行規(guī)律與帶毒害蟲的傳播有關(guān)。病毒病由液汁接觸和傳毒害24.1接觸傳染病毒病流行規(guī)律病毒可在多種植物上越冬，病殘體、帶毒種子均可成為病毒病的初侵染源，此外，結(jié)、排水不良和偏施氮肥都會加重病情發(fā)展。4.2蟲傳病毒病流行規(guī)律黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒主要通過蚜蟲和煙粉虱等介體傳播，在溫室大棚較高適合蚜蟲和煙粉虱生長繁殖，導(dǎo)致病毒病常年發(fā)生；在湖南地區(qū)無設(shè)施栽培在4月初進(jìn)行大田定植，由于溫度較低，不適合蚜蟲、煙粉虱生長、繁殖，田間未見通過蟲傳病毒病植株；田間蟲傳病毒病植株開始于5月底6月初，剛開始發(fā)病時田間有少量的蚜蟲、煙粉虱，隨著溫度的上升降雨量減少，特別是8月~9月的高溫干旱天氣，適合蚜蟲、煙粉虱的生長、發(fā)育和繁殖，田間出現(xiàn)了大量的蚜蟲、煙粉虱，隨著蚜蟲和煙粉虱的遷移，田間茄科蔬菜大面積的5.1病害田間診斷茄科蔬菜病毒病的危害癥狀有三種表現(xiàn)癥狀：葉片出現(xiàn)濃綠和淡綠色相同的花斑，幼苗表現(xiàn)矮縮，新葉略曲扭，成株不矮縮，新葉表現(xiàn)花葉，稱為花葉型。有的葉片狹長呈線狀，色淡卷曲，節(jié)間縮短，稱條紋型(參見附錄A圖A1、A2)。5.2生物學(xué)檢測用于生物學(xué)檢測病毒的常用鑒別寄主植物有心葉煙、三生煙、本氏煙、莧用摩擦接種的方法對病毒進(jìn)行接種培養(yǎng)。具體方法和檢測結(jié)果見附錄B.15.3血清學(xué)檢測(Dot-ELISA檢測)在進(jìn)行生物學(xué)檢測的同時也使用血清學(xué)的方法對所采樣品進(jìn)行檢測。具體方法和檢測結(jié)果見附錄5.4分子生物學(xué)檢測 (RT),轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。擴(kuò)增片段與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致，則為陽性樣品，表明植物葉片中攜帶該病毒見附錄B.3。6防治原則3降低病蟲害暴發(fā)幾率，積極保護(hù)利用自然天低毒、低殘留和低污染的農(nóng)藥，將病蟲危害損失降到最低限度。7防治方法選用抗病、避病、優(yōu)質(zhì)適合當(dāng)?shù)卦耘鄺l件的各類符合國家種子質(zhì)量的品種。7.1.2種子脫毒、消毒茄科蔬菜種子播種前選擇晴天將種子曬(2～3)d,利用太陽紫外線殺死附著在種子表面的病原菌，用55℃溫開水侵泡種子0.5h左右，搓去種子表面粘液，用10%的磷酸三鈉溶液浸種0.5h左右，撈出后用干凈清水沖洗3次催芽。育苗前，徹底清除苗床枯枝殘葉和雜草，深耕土壤30cm左右，邊耕邊撒上生石灰和百菌清進(jìn)行土壤消毒，并把土塊敲碎整理好成高畦，最后用(400～600)倍高錳酸鉀溶液噴灑土壤，然后蓋好朔料薄膜覆蓋密封苗床7d左右再播種，苗床采用50目以上的銀灰色防蟲網(wǎng)進(jìn)行覆蓋，用來阻止蚜蟲、煙粉虱等傳毒害蟲的侵入，控制由傳毒害蟲傳播而導(dǎo)致的病毒病的發(fā)生；在育苗床上使用頻振式殺蟲燈誘蟲、7.2.1合理輪作倒茬理布局和輪作，對茄科蔬菜實(shí)行2～3年以上輪作倒茬。時摘除病蟲為害的葉片、果實(shí)或整株拔除，帶出田外深埋叉、農(nóng)田除草或其他農(nóng)作時應(yīng)減少對作物的機(jī)械損傷，防止操作病毒病傳播。使土壤疏松，有利于植物根系發(fā)育，提高植47.2.5土壤消毒定植前，徹底清除田間枯枝殘葉和雜草，深耕土壤，邊耕邊撒上把土塊敲碎整理好成高畦，最后用(400～600)倍高錳酸鉀溶液噴灑土壤，然后蓋好朔料薄膜覆蓋密封田塊7d左右再定植。作物育苗或田間種植時用40目以上的防蟲網(wǎng)構(gòu)建人工隔離屏障，能夠很好的防止傳毒害蟲對防蟲網(wǎng)內(nèi)作物的傳毒，朔料薄膜全程覆蓋生產(chǎn)技菜安全越夏，朔料薄膜的使用不僅在冬季能保溫，也可以阻隔降雨危害，確保蔬小行高畦，行與行之間挖一條深(10~15)cm,寬(15～20)cm的溝，以利于排水?？茖W(xué)配方施肥，改善土壤的理化性質(zhì)和營養(yǎng)狀況，促進(jìn)植物健壯成長，增加其對噴施鈣肥、硅肥等微量元素或在作物的不同生育期噴施300倍益農(nóng)光合細(xì)菌菌劑誘導(dǎo)植物對病毒病的抗性。能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用次數(shù)和用量，降低農(nóng)藥對環(huán)境的污染?？茖W(xué)管水7.3物理防治7.3.1燈光誘殺使用頻振式殺蟲燈、氖氣燈或誘蟲燈等誘殺傳毒害蟲。蔬菜園一般每30畝安裝1盞燈。采用頻振式殺蟲燈及太陽能殺蟲燈誘殺害蟲。此裝置是利用害蟲的趨光、趨波、波段、波的頻率設(shè)定在特定的范圍內(nèi)，近距離用光，遠(yuǎn)距離用波，加上害蟲本撲燈，燈外配以頻陣高壓電網(wǎng)，害蟲觸電后達(dá)到誘殺成蟲的目的。安裝時燈底部距離地面1.20m,于蔬在作物育苗或田間種植時用40目以上的防蟲網(wǎng)能夠很好的防止傳毒害蟲對防蟲網(wǎng)內(nèi)作物的傳毒。在春季和秋季蚜蟲發(fā)生期，用銀灰色地膜覆蓋栽培蔬菜或懸掛銀灰色膜條，每畝(30～40)條，可7.3.4色板誘殺利用蚜蟲、薊馬、煙粉虱等成蟲對黃色或綠色有較強(qiáng)趨性的特性，在田間放置30cm×40cm的誘蟲黃板或綠板300塊/hm2,將黃板或綠板呈棋盤式均勻插置田間，黃板或綠板底部略高出植株頂端20cm左右，黃板或綠板粘滿害蟲后及時更換。7.4生物防治保護(hù)田間有益昆蟲，利用生物多樣性控制傳毒害蟲。5田間釋放瓢蟲、草蛉等捕食性天敵和麗蚜小蜂等寄生性天敵防治蚜蟲、薊馬、煙粉虱等傳毒害蟲。7.4.3生防菌防控利用蚜霉菌、蠟蚜輪枝菌、1.8%阿維菌素乳油、木霉菌等生防菌株防治傳毒害蟲。在上述措施無法控制在病毒病和傳毒害蟲經(jīng)濟(jì)閥值以下，且病毒病和傳毒害蟲出現(xiàn)大面積爆發(fā)時，采用農(nóng)藥防治。農(nóng)藥使用應(yīng)符合國家綠色食品農(nóng)采用高效、低毒、低殘留農(nóng)藥防治病毒病，防治病毒病常用藥劑的用量及用法見附錄C。通過切斷傳毒介體的傳播途徑，來控制茄科類蔬菜病毒病發(fā)生具有重要作用。蔬菜定植后(1~3)d,將25%噻蟲嗪水分散粒劑稀釋(1000~1500)倍液按每株50ml灌根處理，對傳毒害蟲進(jìn)行預(yù)防。交替使用，同一藥劑不得連續(xù)施用2次；茄科蔬菜病毒病主要傳毒介體有蚜蟲、煙粉虱等害蟲。a)蚜蟲農(nóng)藥防治當(dāng)田間有蟲率(5～15)%時開始用藥，優(yōu)先采用植物源農(nóng)藥，防治蚜蟲常用藥劑的用量及用法見附錄C。b)煙粉虱農(nóng)藥防治當(dāng)田間有蟲率(10～15)%時開始用藥，優(yōu)先采用植物源農(nóng)藥，防治煙粉虱常用藥劑的用量及用法見附錄C。建立茄科蔬菜病毒病防治檔案，具體檔案記錄表格見附錄D。6附錄A(資料性附錄)茄科蔬菜病毒病的危害癥狀有三種表現(xiàn)癥狀：葉片出現(xiàn)濃綠和淡綠色相同的花斑，幼苗表現(xiàn)矮縮，新葉略歪扭，成株不矮縮，新葉表現(xiàn)花斑，稱為花葉型。有的葉片狹長呈線狀，色淡卷曲，節(jié)間縮短，圖A1辣椒病毒病為害癥狀圖A2番茄病毒病為害癥狀7附錄B(規(guī)范性附錄)B.1病毒生物學(xué)檢測B.1.1病毒摩擦接種方法400)目撒到待接種葉的表面(也可直接將金剛砂加在研磨液中),在營養(yǎng)缽內(nèi)插上標(biāo)簽，注明處理及時間；用手指或研棒、棉球和紗布蘸取少許汁接過種的葉片，將植株放于溫室(最好22~25℃)。用緩沖液接種植株作對照；接種后的純化，將帶毒葉片用接種緩沖液研磨后采用摩擦汁液接種的方法斑點(diǎn)剪下，用接種緩沖液研磨再次接種至枯斑寄主，出現(xiàn)單斑癥狀后再次取下單現(xiàn)斑點(diǎn)后再取單個斑點(diǎn)接種于系統(tǒng)寄主，出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀后再取葉片進(jìn)行保存和檢測。B.1.2病毒的保存干燥的方法處理后，寫明標(biāo)簽，存于-80℃冰箱。將經(jīng)分離純化后得到的不同病毒的病毒分離物分別接圖B1CMV分離物接種至莧色藜上的癥狀(a):枯斑；接種至心葉煙上的癥狀(b):系統(tǒng)花葉。圖B2TMV分離物接種至心葉煙上的癥狀(a):枯斑；接種至三生煙上的癥狀(b):系統(tǒng)花葉。8B.2病毒的血清檢測植物葉片稱重后，按重量體積比1:10~1:50(g/ml)加入0.01mol/LPBS研磨；8000rpm離心3min;取2ul上清點(diǎn)到硝酸纖維素膜(NC膜);室溫干燥10min;NC膜浸入到含5%脫脂奶粉室溫封閉30min;NC膜放入5%的脫脂奶粉1:5000倍稀釋的單抗中室溫孵育(30～60)min;PBST洗膜(3~4)次，每次3min;NC膜放入用5%的脫脂奶粉1:8000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗wholemolecule中室溫孵育(30～60)min;PBST洗膜(4~5)次，每次5min;最后一遍再用PBS洗5min。顯色底物NBT66ul和BCIP33ul加到10ml底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時終止反應(yīng)(顯色5～20min),即在自來水中漂洗一下，肉眼觀察并記錄結(jié)果見圖B3。圖B3CMV和TMV分離物的Dot-ELISA檢測結(jié)果B.3分子生物學(xué)檢測B.3.1GB溶液配方采用硅粒吸附法提取植物總RNA。取病葉0.1g,加3mLGB溶液，研磨至勻漿；取500μL研磨液，加100μLNLS,70℃溫育10min,不時上下顛倒混勻，冰上放置5min,13000/min離心10min;取300離心1min,倒去上清；加500μL洗滌液(WB:無水乙醇=1:1)洗滌，6000/min離心1min,倒掉上清，重復(fù)該步驟；沉淀加ddH?O150μL,70℃溫育4min,1min后將離心管蓋打開，隨即蓋上；13000/min離心3min,取上清，-20℃保存。B.3.3RT-PCR擴(kuò)增B.3.3.1反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全氏金，以硅粒吸附法提取的總RNA為模板，選取隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT),轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈具體反應(yīng)體系及步驟見表B.1。9上述混合液25℃孵育10min,42℃孵育30min,85℃加熱5min,-20℃保存。名稱(前引/后引)引物序列片段長度ATTTAAGTGGASGGAAAAVC(K=G或T;W=A或T;V=A,C或G;S=G或C;Y=C或T;R=A或G;B=G,C或T)前引后引酶反應(yīng)程序94℃預(yù)變性4min,94℃,45s;57℃,45s;72℃,Imin,35個循環(huán)；72℃延伸7min。94℃預(yù)變性4min,94℃,45s;55℃,45s;72℃,1min,35個循環(huán)；72℃延伸7miB.3.4瓊脂糖凝膠電泳1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取5HL擴(kuò)增反應(yīng)物與2mLSYBRGreen染料、3mLloadingbuffer混勻，電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。擴(kuò)增片段與預(yù)帶大小一致，則為陽性樣品，表明植物葉片中攜帶該病毒見附錄圖B.4、B.5。圖B.4茄科作物攜帶CMV的檢測圖B.5茄科作物攜帶TMV的檢測DB43/T953—2014附錄C(規(guī)范性附錄)防治農(nóng)藥安全間隔期(天)防治時期1.5%植物靈乳劑770.5%大黃素甲醚水劑1000倍液720%鹽酸嗎啉胍.乙酸銅71000倍噴霧70.