DB37T 4459-2021 鵝星狀病毒感染診斷技術(shù)規(guī)范

37Diagnostictechnicalspecificationforgooseastrovirus2021-12-27發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1鵝星狀病毒感染診斷技術(shù)規(guī)范臨床癥狀、病理變化；實(shí)驗(yàn)室診斷包括樣品的采集與保存、病毒分離鑒定、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)適用于鵝組織、分泌物、排泄物和病毒培養(yǎng)物中鵝星狀病毒分離鑒定及核酸檢測(cè)；間接ELISA抗體檢測(cè)GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物NY/T541—2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范4.1環(huán)境4.1.3生物樣品應(yīng)嚴(yán)格控制避免對(duì)環(huán)境造成污染，試驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)將相關(guān)樣品（如血樣）進(jìn)行無(wú)害化處25.1儀器設(shè)備5.2試劑與材料），5.3樣品采集與運(yùn)送5.3.2組織樣品：采集疑似鵝星狀病毒感染死亡鵝的肝臟、脾臟和腎臟等組織樣品。采集病料時(shí)，用5.3.3泄殖腔/喉拭子樣品：活禽泄5.4樣品處理與保存5.4.1樣品應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行處理，取10g～20g樣品放入滅菌的研缽中磨碎。研磨充分的組織35.5檢測(cè)要求在每次檢測(cè)過(guò)程中，需要設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)亡高峰，鵝群的死亡率為20%～30%，最高可達(dá)50%。小球腫脹，脾臟有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞空泡變7.1.1.1不同溫度的冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃)。4組織樣品處理液接種鵝胚后，當(dāng)胚體3d～5d內(nèi)出現(xiàn)死亡，且胚體尿囊膜增厚，死亡鵝胚全身皮膚），7.2.1.2.11陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，為健康鵝5染料溶液，混勻后倒入放置在水平臺(tái)面上的凝膠盤(pán)中，膠板厚5mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣孔），放入電泳槽中，加1×TA陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)601bp的擴(kuò)增條帶，且陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶時(shí)，判定試驗(yàn)結(jié)果成立。67.2.2.2.5陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，為健康mol/L。0.4μL，探針P（10μmol/L）0.8μL，模板RNA2μL，加ddH2O至20μL。反應(yīng)液混勻后置于），7），），L加入到96孔聚苯乙烯板中，4℃孵育過(guò)夜。孵育后鵝星狀病毒間接ELISA檢測(cè)方法陰性對(duì)照OD均值=（ODA1+ODA2）/2；陽(yáng)性對(duì)照OD均8.4.2.3當(dāng)樣品0.17＜OD450＜0.21，9鵝星狀病毒感染綜合判定根據(jù)第6章、第7章、第8章中的判定結(jié)果，可對(duì)鵝星狀病毒感染進(jìn)行綜8A.1磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/LpH7.NaClNa2HPO4.12H2O0.5×TAE電泳緩沖液加至微波爐中完全融化，待冷至50℃~60℃時(shí)加入核酸染料，搖勻。倒入板上凝固后，取下梳子，備A.3.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）溶液（p滅菌雙蒸水氫氧化鈉調(diào)pH至0.5mol/L乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）A.3.3配制1×TAE電泳緩沖液50×TAE電泳緩沖液A.5包被液（0.05mol/L9Na2CO3NaHCO3A.6洗滌液A.7樣品稀釋液（封閉液）圖B.1PCR產(chǎn)物大小對(duì)照?qǐng)D12養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），其保藏編號(hào)為CCTCCNO:V201808。該病毒供，由13日齡血清抗體陰性鵝胚接種病毒后，收集死亡胚體尿囊液后離心所得，病毒滴度≥105.0ELD50。用鵝星狀病毒SDPY株感染3周齡～4周齡健康雛鵝，感染后2周采血，分離血清，-15℃以下保存。【無(wú)菌檢驗(yàn)】按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄方法進(jìn)行【效價(jià)測(cè)定】用中和試驗(yàn)測(cè)定，對(duì)100ELD50鵝星狀病毒SDPY株的中和效價(jià)不低于5。健康雛鵝在隔離器中飼養(yǎng)至3～4周齡，采血，分離血清，-15℃以下保存。用于鵝星狀病毒ELISA【無(wú)菌檢驗(yàn)】按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄方法進(jìn)行【效價(jià)測(cè)定】用中和試驗(yàn)測(cè)定，對(duì)100ELD50鵝星狀病毒SDPY株的中和效價(jià)不高于1:2。根據(jù)SDPY株ORF2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列ORF2-R：5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGTCGACTCATGTCCGCCCTT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為759