酶聯(lián)免疫吸附試驗課件

酶聯(lián)免疫吸附試驗

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗免疫標記技術(shù)（immunolabellingtechnique）:

是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)。特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。酶聯(lián)免疫吸附試驗免疫酶測定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標記的抗原或抗體進行的抗原抗體反應(yīng)。

辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細胞表面的抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗一、原理

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一種固相酶免疫測定的方法，目前廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的檢測。其基本原理是：將抗原或抗體固定在固相載體表面，并保持其免疫活性，再與酶標記抗體或抗原聯(lián)結(jié)，并保持并保留酶的活性，然后加入酶反應(yīng)的底物，后者被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，反應(yīng)顏色的深淺可與相應(yīng)抗原或抗體的量相關(guān)。在本實驗中，以辣根過氧化物酶標記抗人IgG抗體，與相應(yīng)抗原IgG結(jié)合，標記的酶可催化底物（鄰苯二胺）起顯色反應(yīng)，從而指示特異性抗原抗體反應(yīng)的存在。酶聯(lián)免疫吸附試驗二、材料：1、人IgG包被的微量酶標反應(yīng)板，（1：1萬，1：2萬，1：4萬，1：8萬，1：16萬）2、酶標抗人IgG抗體稀釋液、洗滌液（PH7.4，0.01MPBS-Tween20）、底物溶液，3、微量移液器、移液頭、吸水紙、洗瓶、濕盒、37℃恒溫箱等。酶聯(lián)免疫吸附試驗三、方法：1.人IgG包被微量酶標反應(yīng)板：取人IgG各100ul，分別加入第1至5孔，設(shè)第6孔為對照。置37℃恒溫箱2小時，取出，移入4℃冰箱過夜。取出，用洗滌液洗3次，5分鐘/次。(略）2.用含小牛血清（BSA）的PH7.4PBS封閉，置37℃恒溫箱，30分鐘，取出。用洗滌液洗3次，3~5分鐘/次。（略）3.用微量移液器吸取100ul酶標抗人IgG抗體，分別加入第6至1孔。置濕盒中，于37℃恒溫箱中孵育30分鐘。4.取出酶標板，用洗滌液洗3次，3~5分鐘/次。5.按第6孔至第1孔的順序，每孔各加100ul的底物溶液，置37℃恒溫箱中10-15分鐘。6.觀察顯色反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗用PBS洗滌3次（將洗板液加入每孔，3min后傾去），以洗去未結(jié)合的游離酶標抗體。不同濃度IgG100ul/孔酶標板126543酶標抗人IgG抗體底物觀察顯色酶聯(lián)免疫吸附試驗四、結(jié)果1654321~5孔，隨著包被抗原濃度降低，顏色逐漸變淡6孔（對照）無色五、結(jié)論

ELISA可簡便、快速、定量地檢測抗原或抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗操作注意事項：1、正確掌握微量移液器的使用方法：一檔取樣，二檔加樣。2、正確洗滌酶標板：勿使洗滌液溢出，造成交叉污染洗滌后應(yīng)盡量甩干孔內(nèi)殘液。3、注意加樣順序，加樣品時應(yīng)注意從最高稀釋度逐一加至最低稀釋度。4、底物OPD有一定致癌作用，故操作時應(yīng)小心，勿使底物沾染實驗臺等器材。5，槍頭（移液頭）忌丟入實驗臺微生物專用的廢液缸內(nèi)。酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA的分類√直接法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體√間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標記二抗檢測液相中未知抗體√雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標記一抗檢測液相中的可溶性抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗SandwichELISAindirectELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA檢測抗原

Ag+Ab*?Ag-Ab*酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA檢測抗體

Ab+Ag*?Ab-Ag*酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA檢測抗體Ag+Ab1?Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*?Ag-Ab1-Ab2*

酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗間接ELISA（可測多種細菌或病毒的抗體，用途廣泛）顯色

酶聯(lián)免疫吸附試驗免疫技術(shù)：以抗原-抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對樣品中相應(yīng)抗原或抗體進行檢測。標記技術(shù)：將可被探測的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方法與化合物連接。標記免疫分析：用可微量或超微量檢測的示蹤劑標記抗原、抗體，檢測免疫反應(yīng)結(jié)果并確定待檢物。免疫標記技術(shù)補充酶聯(lián)免疫吸附試驗放射免疫技術(shù)免疫熒光技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標記技術(shù)三大經(jīng)典標記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗放射免疫RIA以標記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標記抗原競爭結(jié)合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。

免疫放射IRMA以過量標記抗體與抗原非競爭結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離游離和結(jié)合標記抗體。放射受體分析RRA放射配體結(jié)合分析RBA其它放射免疫技術(shù)－原理酶聯(lián)免疫吸附試驗二、放射免疫技術(shù)－常用的放射性核素

125I

3H射線γβ理化性

活潑

差核素豐度

>90%－半衰期60.2d12.3y標記方法簡單復(fù)雜標記設(shè)備低廉昂貴測量條件簡單復(fù)雜常用標記核素酶聯(lián)免疫吸附試驗熒光抗體技術(shù)熒光免疫測定均相熒光免疫測定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相熒光免疫測定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對抗原或抗體進行定性、定位或定量檢測。熒光免疫技術(shù)的類型酶聯(lián)免疫吸附試驗熒光抗體技術(shù)的基本原理

熒光素標記抗體與切片中組織細胞抗原反應(yīng)，洗滌分離后熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物及其部位，對組織細胞抗原進行定性和定位檢測，或?qū)ψ陨砜贵w進行定性和滴度測定。酶聯(lián)免疫吸附試驗Immunofluorescence,IF酶聯(lián)免疫吸附試驗熒光顯微鏡

利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。

酶聯(lián)免疫吸附試驗病原體檢測寄生蟲（猴胚腎細胞內(nèi)弓形蟲）細菌（藤黃微球菌)熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗免疫病理檢測腫瘤（人肝癌細胞）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗主要試劑:

酶標記的抗體或抗原酶標物特點：

免疫學(xué)活性酶對底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性酶免疫測定法原理及特點酶聯(lián)免疫吸附試驗特點：靈敏度高、特異性強、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。原理：酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析

原理及特點酶聯(lián)免疫吸附試驗辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標記用酶常用酶酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位

液體標本中抗原或抗體的定性和定量酶免疫技術(shù)的分類酶聯(lián)免疫吸附試驗堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測定

常用酶酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高

常用底物酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗HRP的常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗AP的底物

β-Gal的底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

酶作用后，生成高強度熒光物，用熒光計測量。常用底物酶和酶作用底物酶聯(lián)免疫吸附試驗酶免疫技術(shù)的核心組成部分

酶結(jié)合物（conjugate）酶標記物通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

酶標記抗體或抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234一、基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗固相的抗原或抗體

酶標記物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)的底物

三個必要試劑

二、方法類型及反應(yīng)原理酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色應(yīng)用：

二價或二價以上的較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測抗原的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結(jié)合3、加酶標抗體無抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY酶聯(lián)免疫吸附試驗競爭法

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測抗原的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標抗原競爭與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標抗原，酶標抗原與抗體結(jié)合YE酶聯(lián)免疫吸附試驗間接法方法

用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用

常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定ELISA檢測抗體的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結(jié)合3、加酶標抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法

應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測ELISA檢測抗體的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗捕獲法

應(yīng)用：

病原體急性感染診斷中的IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測抗體的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體底物顯色

酶聯(lián)免疫吸附試驗洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色酶聯(lián)免疫吸附試驗人IL-2定量酶聯(lián)檢測

BAS-ELISA(生物素-親和素ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗

一、原理

ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)是一種固相酶免疫測定的方法，廣泛應(yīng)用于各種抗原或抗體的微量檢測，其基本原理是將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原－抗體反應(yīng)在固相表面進行，通過洗滌將固相上的抗原－抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分離，再利用各種操作方法，測定可溶性抗原或抗體。

BAS-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素(B)與親和素(A)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達1015M-1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。酶聯(lián)免疫吸附試驗本實驗采用雙抗體夾心ELISA法?？谷薎L-2單抗包被于酶標板上，標準品中的IL-2會與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-2抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。生物素和親和素特異性結(jié)合；抗人IL-2抗體與結(jié)合在單抗上的人IL-2結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有IL-2，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現(xiàn)藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，IL-2濃度與OD450值之間呈正比，繪制標準曲線。酶聯(lián)免疫吸附試驗二、材料（人IL-2ELISA試劑盒）

1.1ng/ml人IL-2標準品2.標準品稀釋液3.生物素化抗人IL-2抗體（1:100）4.酶結(jié)合親和素（1:100）5.洗滌液6.顯色劑（過氧化氫－四甲基聯(lián)苯胺）7.終止液8.抗人IL-2單抗包被板條9.封板膠紙酶聯(lián)免疫吸附試驗三、操作步驟

1.包被抗體：用0.05MPH9.6碳酸鹽緩沖液將已知抗體作適當稀釋，在每個聚苯乙烯酶標板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜(18-24小時)。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。

2.配制不同濃度的標準品：

孔號12345678NS(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

人IL-2(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:256酶聯(lián)免疫吸附試驗3.加樣：將稀釋的不同濃度的標準品各100ul加入反應(yīng)孔1~8孔中，同時第9孔作空白孔。37℃孵育60分鐘，洗滌4次，0.5分鐘/次。

4.加B-Ab（生物素化抗IL-2