間隙連接蛋白43-(Cx43)在皮膚傷口愈合中的作用

間隙連接蛋白43（Cx43）在皮膚傷口愈合中的作用摘要：間隙連接（gapjunction，GJ）是細(xì)胞膜上的通道結(jié)構(gòu)，其介導(dǎo)的細(xì)胞間間隙連接通訊（gapjunctioninter-cellularcommunication，GJIC）對(duì)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控及新陳代謝等起到重要的作用。間隙連接蛋白43（connexin43，Cx43）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分布最為廣泛的間隙連接蛋白，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)皮膚創(chuàng)傷后Cx43的表達(dá)會(huì)隨著傷口愈合的過(guò)程發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，并影響傷口愈合的速率和質(zhì)量，人為調(diào)控Cx43的表達(dá)水平會(huì)改善傷口愈合的速率和質(zhì)量。主要就Cx43結(jié)構(gòu)與功能、Cx43的水平對(duì)傷口愈合各階段的影響及Cx43與慢性傷口的關(guān)系進(jìn)行總結(jié)，以期為探索皮膚創(chuàng)傷，尤其是慢性傷口治療新途徑提供參考價(jià)值。關(guān)鍵詞：間隙連接蛋白43（Cx43）；間隙連接：傷口愈合：慢性傷口在動(dòng)物組織中，相鄰細(xì)胞間廣泛存在著間隙連接（gapjunction，GJ）。各種離子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝物質(zhì)及其他相對(duì)分子質(zhì)量小于1kD的物質(zhì)（如氨基酸、核苷酸及鈣離子等），可以通過(guò)GJ在細(xì)胞間交流，發(fā)揮細(xì)胞間信息及能量的傳遞功能，對(duì)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，細(xì)胞的增殖、分化、生長(zhǎng)調(diào)控及新陳代謝等起到重要的作用[1，2]。GJ由相鄰兩細(xì)胞細(xì)胞膜上的兩個(gè)連接子組成，每個(gè)連接子含有6個(gè)相同或不同的連接蛋白（connexin，Cx）。Cx是一類(lèi)較保守的膜蛋白家族，至今在人類(lèi)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了21種Cx，小鼠中20種Cx，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，將不同的Cx命名為Cx26、Cx32、Cx43等[3，4]。皮膚是人體最大的器官，哺乳動(dòng)物皮膚中存在多種類(lèi)型的Cx，包括Cx26、Cx30、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45等，Cx之間具有重疊表達(dá)和功能多樣性的特點(diǎn)，能夠形成一個(gè)復(fù)雜的間隙連接網(wǎng)絡(luò)。Cx的正常表達(dá)是皮膚維持正常功能所必需的，Cx基因突變后會(huì)引起相應(yīng)的疾病，如紅錐樣魚(yú)鱗病性耳聾、角膜炎一魚(yú)鱗病一耳聾綜合征、變異性紅斑角化病和指趾縮窄綜合征等[5～8]。皮膚功能的完整性是保證生存質(zhì)量所必需的，但是皮膚創(chuàng)傷是經(jīng)常發(fā)生且難以避免的事情。研究發(fā)現(xiàn)，皮膚傷口愈合過(guò)程中，間隙連接蛋白的分布和表達(dá)水平會(huì)隨傷口愈合各階段的進(jìn)行發(fā)生相應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化[4]，并且這種變化會(huì)影響皮膚傷口愈合的速率及質(zhì)量。Cx43是皮膚中分布最廣泛的連接蛋白，在真皮中的纖維細(xì)胞、血管、汗腺、皮脂腺、毛囊等附屬器及活化的白細(xì)胞和表皮層的角化細(xì)胞中均有表達(dá)[9-11]，且Cx43的表達(dá)水平隨傷口愈合的進(jìn)行發(fā)生顯著變化。通過(guò)不同措施調(diào)控傷口處Cx43的表達(dá)水平或其介導(dǎo)的間隙連接通道均會(huì)明顯改善傷口愈合的速率和質(zhì)量[4]，比如，在小鼠的切開(kāi)及切除傷口模型中施加針對(duì)Cx43的反義寡聚核苷酸下調(diào)傷口處Cx43的表達(dá)水平，傷口閉合的速率明顯加快，最后形成的瘢痕組織更加接近無(wú)創(chuàng)傷皮膚[12，13]，Cx43反義寡聚核苷酸治療創(chuàng)傷的研究已進(jìn)入臨床階段，有望成為治療皮膚創(chuàng)傷的新手段。Wright等利用多肽模擬物Gap27靶向Cx43胞外環(huán)來(lái)抑制細(xì)胞間隙連接通道，能夠促進(jìn)真皮層纖維細(xì)胞的遷移，從而促進(jìn)傷口愈合[14]。顯然，Cx43是影響傷口愈合速度與質(zhì)量的重要調(diào)控物質(zhì)之一，開(kāi)發(fā)以Cx43為靶點(diǎn)治療皮膚創(chuàng)傷及慢性傷口的新措施已成為基礎(chǔ)研究和臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)。在此，我們關(guān)注Cx43對(duì)傷口愈合各階段的作用，并對(duì)其進(jìn)行總結(jié)。1Cx43的結(jié)構(gòu)與功能在各類(lèi)動(dòng)物相鄰細(xì)胞的接觸區(qū)域廣泛存在著間隙連接通道，間隙連接通道是由兩相鄰細(xì)胞間連接子對(duì)接形成的，每個(gè)連接子又是由6個(gè)相同或不同的間隙連接蛋白聚合形成的六聚物。當(dāng)這些通道側(cè)向聚集形成半晶狀態(tài)時(shí)，也就是所謂的成熟的間隙連接通道或者間隙連接斑，它們的開(kāi)放或閉合能夠促進(jìn)相鄰細(xì)胞間交流[10]。其中，Cx43是分布最多且最廣泛的一種間隙連接蛋白，它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體上合成之后，轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體內(nèi)形成由6個(gè)連接蛋白組成的半通道，即連接子，之后通過(guò)運(yùn)輸小泡被運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜上，Cx43在質(zhì)膜上存在4個(gè)跨膜區(qū)域，其中N端和C端位于細(xì)胞膜胞質(zhì)側(cè)[8，15]。生長(zhǎng)因子、腫瘤促進(jìn)因子、癌基因蛋白激酶、激素和炎癥介質(zhì)等，可通過(guò)磷酸化羧基端的絲氨酸和/或酪氨酸來(lái)調(diào)控間隙連接通道功能[15]。相對(duì)于大部分蛋白質(zhì)而言，Cx43半衰期較短，只有1—3h[15-17]。因此，間隙連接能夠很快地重塑、周轉(zhuǎn)，始終處于高度動(dòng)態(tài)中，間隙連接區(qū)域的成核、重塑、生長(zhǎng)、內(nèi)在化及周轉(zhuǎn)對(duì)于各組織器官建立合適的細(xì)胞間交流水平起到非常重要的作用。所以，間隙連接蛋白如此短的半衰期對(duì)快速調(diào)節(jié)間隙連接通道具有重要的意義。組織的穩(wěn)態(tài)依賴(lài)于細(xì)胞間通訊功能進(jìn)行細(xì)胞的協(xié)調(diào)與調(diào)控。皮膚表皮之間沒(méi)有毛細(xì)血管的存在，只能依靠細(xì)胞間隙連接進(jìn)行細(xì)胞間物質(zhì)和信息的傳遞。通過(guò)對(duì)間隙連接蛋白家族基因的確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)表皮中能夠在時(shí)間上及空間上精確地表達(dá)9種以上連接蛋白。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)真皮層纖維細(xì)胞也表達(dá)多種間隙連接蛋白，尤其是Cx43。2Cx43與皮膚創(chuàng)傷愈合各階段的關(guān)系哺乳動(dòng)物皮膚傷口愈合是一個(gè)由可溶性介質(zhì)、血細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和多種類(lèi)型細(xì)胞參與的動(dòng)態(tài)的、相互作用的過(guò)程。正常情況下，皮膚傷口愈合過(guò)程由3個(gè)連續(xù)且重疊的階段組成：炎癥階段、增殖階段和組織重塑階段[18]。皮膚細(xì)胞層中存在著由間隙連接蛋白組成的廣泛的GJ網(wǎng)絡(luò)，在皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，表皮層和中皮層細(xì)胞中Cx43的分布及表達(dá)受到調(diào)控，反過(guò)來(lái)，Cx43的調(diào)控會(huì)進(jìn)一步影響傷口愈合的進(jìn)行。我們嘗試總結(jié)Cx43在傷口愈合各階段的變化，希望為探索Cx43影響傷口愈合的機(jī)制提供一定的幫助。2.1Cx43在炎癥階段的作用傷口愈合首先表現(xiàn)為局部炎癥反應(yīng)。血管損傷后立即啟動(dòng)血管收縮、血小板栓形成、血液凝結(jié)形成纖維蛋白凝塊等一系列反應(yīng)，從而止血以防傷口處血液的大量流失，一旦流血得到控制，炎癥細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞不斷滲透進(jìn)入傷口，促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生[19，20]。。皮膚創(chuàng)傷后，損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43表達(dá)顯著上調(diào)，并且血管中Cx43的表達(dá)上調(diào)是迅速且顯著的，在創(chuàng)傷后最初的幾小時(shí)就可以檢測(cè)到，并且在整個(gè)炎癥階段維持一個(gè)高水平[11，13]。進(jìn)幾年研究發(fā)現(xiàn)，減少傷口處Cx43的表達(dá)會(huì)加快傷口愈合的速率、提高傷口愈合的質(zhì)量，在炎癥階段的具體表現(xiàn)有炎癥反應(yīng)降低、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量減少、炎癥趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)減少[12，13，21]。Cx43表達(dá)減少引起炎癥反應(yīng)減小的具體機(jī)制還不是很清楚，但是我們知道炎癥細(xì)胞穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)至關(guān)重要，因此減少Cx43降低炎癥反應(yīng)很可能與炎癥細(xì)胞穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞能力減弱有關(guān)。在活化的白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有Cx43的表達(dá)，彼此之間存在直接的細(xì)胞交流[22]。白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙連接多少或者細(xì)胞交流程度很可能決定炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱。現(xiàn)在一致認(rèn)為炎癥反應(yīng)的發(fā)生需要3個(gè)步驟：1）附壁：隨著血管通透性增加和血流減慢，白細(xì)胞離開(kāi)軸流，沿血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行滾動(dòng)，并在滾動(dòng)過(guò)程中被激活；2）黏著：白細(xì)胞通過(guò)β2整合素與內(nèi)皮細(xì)胞上的選擇蛋白類(lèi)黏著分子黏著；3）游出和趨化作用：粘著于內(nèi)皮細(xì)胞表面的白細(xì)胞沿內(nèi)皮表面緩慢移動(dòng)，在內(nèi)皮細(xì)胞連接處伸出偽足，整個(gè)白細(xì)胞逐漸以阿米巴運(yùn)動(dòng)方式從內(nèi)皮細(xì)胞縫隙逸出，到達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜之間，最終穿過(guò)基底膜到血管外到達(dá)損傷處[23，24]。Sarieddine等發(fā)現(xiàn)Cx43—小鼠與Cx43+/+小鼠相比較，Cx43表達(dá)減少61%，肺損傷模型中募集到的中性粒細(xì)胞也降低到560/0，所以減少Cx43表達(dá)會(huì)顯著降低炎癥細(xì)胞的募集。并且，體外實(shí)驗(yàn)表明減少Cx43介導(dǎo)的細(xì)胞交流后，黏著于血管內(nèi)皮細(xì)胞的中性粒細(xì)胞顯著減少[25]。皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中減少Cx43引起炎癥反應(yīng)降低很可能也是和炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙連接相關(guān)。但是Zahler等研究表明中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間確實(shí)存在間隙連接，通過(guò)調(diào)控間隙連接影響炎癥細(xì)胞的遷移和滲透過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的能力，但是當(dāng)封閉間隙連接時(shí)，遷移穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的白細(xì)胞明顯增加[26]，這與我們推測(cè)相矛盾。因此，皮膚傷口處炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱與Cx43的關(guān)系需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。2.2Cx43在增殖階段的作用增殖階段發(fā)生在炎癥階段之后或與其存在重疊，特點(diǎn)是表皮層的表皮再生、真皮層或間充質(zhì)細(xì)胞層的恢復(fù)，并伴隨血管新生。在此階段，角質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞是最突出的修復(fù)細(xì)胞類(lèi)型[27，28]。皮膚的表皮是由基底層、刺細(xì)胞層、顆粒層及最頂端的角質(zhì)層組成，基底層的角化細(xì)胞仍具有干細(xì)胞樣特性，在皮膚損傷修復(fù)過(guò)程中起到重要作用，角化細(xì)胞增殖發(fā)生在表皮的基底層，當(dāng)其穿過(guò)基底層和顆粒層時(shí)經(jīng)歷最終的分化形成角質(zhì)層[10]。表皮傷口的再上皮化主要是角化細(xì)胞通過(guò)增殖、遷移和分化完成的。纖維細(xì)胞是構(gòu)成真皮層的主要細(xì)胞，皮膚創(chuàng)傷后，通過(guò)纖維細(xì)胞的遷移、增殖、分化形成肉芽組織、分泌膠原蛋白形成細(xì)胞外基質(zhì)填補(bǔ)真皮層區(qū)域以閉合傷口[29]。Cx43是表皮角化細(xì)胞最主要的連接蛋白，正常情況下，Cx43蛋白主要存在于表皮的基底層和基底層上的刺細(xì)胞層。創(chuàng)傷發(fā)生后Cx43的表達(dá)部位不發(fā)生變化，但是表達(dá)水平發(fā)生顯著變化[30，31]。傷口邊緣基底層和刺細(xì)胞層中的Cx43水平會(huì)顯著下調(diào)，存在基底層上的角化細(xì)胞也會(huì)選擇性地表達(dá)S368磷酸化的Cx43（表明創(chuàng)傷會(huì)影響Cx43的磷酸化狀態(tài)）[32]，通過(guò)熒光染料luciferyellow表明間隙連接通道也會(huì)與間隙連接蛋白一樣發(fā)生相應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化[33]。與表皮層的角化細(xì)胞相同，創(chuàng)傷后最初24～48h，傷口邊緣真皮層纖維細(xì)胞中Cx43表達(dá)下調(diào)，此時(shí)纖維細(xì)胞開(kāi)始向傷口處遷移，并形成肉芽組織。通過(guò)shRNA、siRNA、反義寡聚核苷酸、模擬肽或基因敲除技術(shù)會(huì)進(jìn)一步降低傷口處Cx43蛋白表達(dá)，顯著加快傷口愈合的速率和質(zhì)量，具體表現(xiàn)在角化細(xì)胞的遷移和增殖加快、纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞的速率加快、肉芽組織形成及成熟提早等[13，1434，35]。Cx43水平影響傷口愈合的增殖階段的機(jī)制還沒(méi)有完全弄清楚?？偨Y(jié)最近的研究發(fā)現(xiàn)，Cx43可能是通過(guò)兩個(gè)方面影響創(chuàng)傷愈合過(guò)程的。第一，傷口愈合過(guò)程中Cx43表達(dá)水平及磷酸化水平可能會(huì)選擇性地使一些間隙通道穿過(guò)分子通過(guò)，從而影響角化細(xì)胞的增殖和分化[36，37]；第二，間隙連接蛋白除了具有組成間隙連接通道執(zhí)行物質(zhì)和信息交流的功能外，還能夠與其他分子，如黏著分子、細(xì)胞骨架蛋白、ZO-1等結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移[10，38，39]。所以傷口處下調(diào)Cx43后會(huì)改變細(xì)胞極性，降低細(xì)胞黏著，改變細(xì)胞骨架促進(jìn)細(xì)胞向傷口處遷移，進(jìn)而加快細(xì)胞的遷移速率[21]。血管再生也是皮膚傷口愈合一個(gè)關(guān)鍵因素，再生血管為再生組織提供有利于增殖分化的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為傷口愈合提供足夠的物質(zhì)準(zhǔn)備[40]。血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠表達(dá)Cx37、Cx40和Cx433間隙連接蛋白，其中Cx43是最主要的間隙連接蛋白。小鼠皮膚創(chuàng)傷后，發(fā)現(xiàn)傷口處損傷的血管中Cx43表達(dá)顯著上調(diào)。同樣地，Kwak利用小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，得出同樣的結(jié)論，創(chuàng)傷會(huì)增加Cx43的表達(dá)[41]。但是也有研究與之相矛盾，表明血管內(nèi)皮細(xì)胞創(chuàng)傷后細(xì)胞間的交流會(huì)減少，如Larson等用牛的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞研究創(chuàng)傷對(duì)間隙交流的影響，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后傷口邊緣的內(nèi)皮細(xì)胞間間隙交流會(huì)減少[42]。Pepper等比較牛微血管內(nèi)皮細(xì)胞與大血管（主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈）內(nèi)皮細(xì)胞創(chuàng)傷后Cx43的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞創(chuàng)傷后Cx43表達(dá)增加，但是大血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43表達(dá)不變[43]。創(chuàng)傷對(duì)Cx43表達(dá)變化的影響很可能與血管類(lèi)型有關(guān)，皮膚創(chuàng)傷一般只涉及微血管，因此，動(dòng)物模型中，皮膚創(chuàng)傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43表達(dá)增加。降低傷口處血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Cx43對(duì)血管再生的影響表現(xiàn)在血管形成及成熟提早，很可能同纖維細(xì)胞一樣，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，進(jìn)一步促進(jìn)血管快速再生。2.3Cx43在組織重塑階段的作用傷口愈合重塑階段試圖將損