DB51T 1539-2012 油菜根腫病菌土壤帶菌PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程　

DB51DB51/T1539—2012油菜根腫病菌土壤帶菌PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程2012-12-20發(fā)布2013-03-03實(shí)施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 14試劑及材料 2 2 2 3 3附錄A(資料性附錄)油菜根腫病基本信息 4Ⅱ本標(biāo)準(zhǔn)附錄A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2000規(guī)則進(jìn)行編寫(xiě)。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉勇、黃小琴、張蕾、尹全、劉紅雨、周西全、楊曉蓉。11范圍2規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682-1992分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試3原理油菜根腫病是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)引起的專(zhuān)性寄生性土傳病害。該菌屬原生動(dòng)物界、根腫菌門(mén)根腫菌綱根腫菌(Plasmodiophora),主要侵染十字花科作物，通過(guò)農(nóng)事操作、種苗帶菌、灌溉等多種方式進(jìn)行傳播。病原菌以休眠孢子(囊)隨病殘?bào)w在土壤中越冬，在土中能4試劑及材料除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-19—-溶菌酶。——三氯甲烷(CHCl?)。———異戊醇(C?H??O)。———異丙醇(C?H?O)。——無(wú)水乙醇(CH?O)。2——電泳緩沖液TAE:242gTris,57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加蒸餾水—PCR引物：根據(jù)GenBank上已發(fā)表的根腫病菌基因片段序列，設(shè)計(jì)特異性引物。P2:5'-AGTTCGCTGCGTTCTT——陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照：以根腫病發(fā)病植株根部休眠孢子(囊)DNA提取液為陽(yáng)性對(duì)照，以不發(fā)5儀器和設(shè)備——渦旋儀。——微量分光光度計(jì)?！埔浩鳎?.5μL,10μL,20μL,100μL,1000μL。6田間土壤取樣品采用“S”形采集法，用不銹鋼土壤取樣器采集0~15cm耕層土壤，每個(gè)土樣由15個(gè)樣點(diǎn)組成，等量混合后采用四分法采取1kg土樣裝入干凈塑料自封袋。一個(gè)土樣用一個(gè)土壤取樣器或用75%酒精消毒土壤取樣器后再使用。土壤取樣點(diǎn)分布范圍根據(jù)種植面積大小確定(表1)。表1油萊根腫病田間土壤帶菌檢測(cè)取樣標(biāo)準(zhǔn)種植面積(m2)以田塊為單位進(jìn)行土壤取樣7實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)液，10000r/min離心3min,棄上清液，重復(fù)操作2次。在裝有土壤的2mL離心管中加入0.2g滅菌玻37℃水浴30min,上下顛倒離心管數(shù)次，水浴結(jié)束后加入0.5mLSDS緩沖液，68℃水浴30min,期間上下顛倒離心管數(shù)次，10000r/min離心5min,收集上清液。按上述方法再把殘?jiān)樘?次。在上清液3中加入等體積的三氯甲烷/異戊醇(24:1,V/V),顛倒混勻放置10min,10000r/min離心5min,收集上清液。加入2/3倍體積的異丙醇，-20℃沉淀30min,12000r/min離心5min,棄上清液。沉淀用70%乙醇洗滌1次，混合10重復(fù)DNA抽提液，冷凍干燥后溶于50μLTE緩沖液中，微量分光光度計(jì)測(cè)定記錄將土壤中提取的根腫病菌DNA稀釋至100ng/μL,取稀釋后的DNA溶液1μL,加入到擴(kuò)增反應(yīng)體系中，變性95℃30s、退火58℃30s、延伸72℃30s,35個(gè)循環(huán)；72℃保溫7min,4℃保存。7.3瓊脂糖凝膠電泳在電泳緩沖液中加入2%瓊脂糖，加熱融化后冷卻至55℃左右加入5μLDNA熒光染料(GV)制備凝膠，凝固后進(jìn)行電泳。5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入上樣孔，80v恒壓電泳25min,將電泳后的凝膠移入凝膠成像系統(tǒng)成像檢測(cè)，記錄成像結(jié)果。8結(jié)果及判斷8.1試驗(yàn)結(jié)果成立條件陽(yáng)性對(duì)照經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后出現(xiàn)498bp大小條帶，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照不出現(xiàn)任何條帶，試驗(yàn)結(jié)果成立，反之則不成立。8.2結(jié)果判斷在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提條件下，土壤樣品DNA擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照一樣的498bp條帶，則說(shuō)明土壤中攜帶根腫病菌休眠孢子濃度大于等于10?個(gè)/g。9廢棄物處理檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，收集后高壓滅菌處理。4(資料性附錄)A.1病原及其分類(lèi)地位A.2病原特征根腫病菌的休眠孢子囊在寄主根部薄壁組織細(xì)胞內(nèi)形成，球形或扁圓形、單胞、無(wú)色或略帶灰色，結(jié)構(gòu)穿透寄主細(xì)胞