DB51T 1549-2012 櫻桃致死黃化病PCR檢驗鑒定方法

DB51DB51/T1549—2012櫻桃致死黃化病PCR檢驗鑒定方法2012-12-20發(fā)布2013-03-01實施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I前言 12原理 1 14儀器及用具 2 2 3 4 4附錄A(資料性附錄)櫻桃致死黃化病基本信息 5本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則進(jìn)行編寫。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：萬佳、寧紅、謝成倫、蔣輝、吳志平、郭迪金、陳素清、余堅志、肖連康、朱本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布。1櫻桃致死黃化病(CherryLethalYellowsphytoplasma,CLYphytoplasma)是由植原體侵染引起黃化組(16SrV),PCR方法是檢測該植原體的有效方法之一，可以快速進(jìn)行櫻桃致死黃化病檢驗鑒定。3試劑和材料除非另有說明，在本標(biāo)準(zhǔn)中僅使用確認(rèn)的分析純——滅菌超純水(ddH?O)。buffer)稱取12.14gTris試劑，加蒸餾水1L攪拌至溶解，高壓滅菌solution)稱取37.224gEDTA試劑，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，邊攪拌邊加入NaOH,調(diào)pH值至8.0,加熱溶解至澄清，定容1L后高壓滅菌保存?！猄DS液[10%](SDSsolution)稱取20gSDS粉末，加蒸餾水200ml在68℃溶解?！狣NA提取液(DNAextrationbuffer)取Tris液10ml,EDTA液40ml,SDS液10ml,加熱攪拌至70℃混合均勻，調(diào)pH=8.0,高壓滅菌后室溫保存?！鞍酌窴液[10μg/μl](ProteinaseK-Solution)稱取5mg蛋白酶K,加入500μl無菌超純水——十二烷基肌氨酸鈉[10%](N-Lauroy——異丙醇(C?H?O)。——TE緩沖液(TEbuffer)1MTris-HClBuffer5ml,1MEDTA2ml,將溶液定容到500ml后，——NaCI[5M]稱取292.5gNaCl,溶解并定容至1L?！狢TAB/NaCl溶液(CTAB/NaClbuffer)4.1gNaCl溶于80ml水中，緩慢加入10gCTAB,加2——苯酚(C?H?O)?！确?CHCl?)。——乙醇(C?H?OH)?！狿CR混合緩沖液(PCRMixbuffer)含dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶、緩沖液。——植原體通用引物(Primers)。利用已報道的植原體16SrDNA和16S-23SrDNA間隔區(qū)序列R16mF2:5'-CATGCAAGTCGAACR16mR1:5'-CTTAACCCCAAT——電泳緩沖液TAE(TAEBuffer)。在1L水中加入Tris堿242g,冰醋酸57.1ml和37.2gNa?EDTA·2H?O,pH8.5,配置成50倍貯存液；使用時稀釋為1倍工作液?！傊悄z[2%](Agarosegel)。在TAE溶液中加入2%瓊脂糖，融化后在每100ml瓊脂糖中加入5μlDNA熒光染料(GV),冷卻至60℃到入相應(yīng)制膠槽中，插入梳子，冷卻凝固備4儀器及用具——電子天平(1/100g,1/10000g)?！欣?內(nèi)徑60mm～80mm)。——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(PCR儀)。5田間取樣表1櫻桃致死黃化病檢測取樣數(shù)量(平方米)5個樣品10個樣品20個樣品25個樣品注：不同品種面積及采樣數(shù)量分別計算，每20張葉片為1個3rpm離心15分鐘。溫浴1-2小時后，在4℃下6000rpm離心10分鐘。浴30分鐘~60分鐘?！尤?00μl5MNaCl混勻后，加入84μlCTAB/NaCl,在65℃下溫浴10分鐘。——取上清，加入2倍體積的無水乙醇沉淀DNA,4℃下13000rpPCR擴增需設(shè)陰性對照(模板為雙蒸水)和陽性對照(模板為已知感染櫻桃致死黃化病植株的PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸60秒，共35大小的標(biāo)準(zhǔn)。100伏電壓電泳30分鐘。46.4.2成像及分析將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)觀察窗內(nèi)，觀察分析并成像保存。有該特異性條帶；供試樣品出現(xiàn)與陽性對照相同大小的1432bp特異性條帶，樣品為陽性，判定為帶櫻桃致死黃化病植原體；供試樣品未出現(xiàn)與陽性對照相同大小的1432bp特異性條帶，樣品為陰性，判定8樣品處理5(資料性附錄)A.1分類地位櫻桃致死黃化病植原體隸屬于細(xì)菌界(Bacteria),硬壁菌門(Firmicutes),柔膜菌綱(Mollicutes)(又稱16SrV組(榆樹黃化組)。A.2病原特征該植原體無細(xì)胞壁，約8nm~100nm,能夠通過細(xì)菌濾器，多型性，有球形、橢圓形、長桿形、梭A.3典型癥狀該病危害嚴(yán)重，寄主感病后幾年時間內(nèi)死亡率可高達(dá)100%