生物技術(shù)制藥 課件 2.基因工程制藥-1

基因工程制藥-1

geneticengineeringpharmaceutics張革中山大學(xué)藥學(xué)院微生物與生化制藥實驗室zhangge@12/29/20241中山大學(xué)藥學(xué)院張革基因工程（GeneEngineering):基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的.

其基本步驟

(1)提取目的基因.

(2)目的基因與運載體結(jié)合.形成一個重組DNA分子.

(3)將目的基因?qū)胧荏w細胞.(4)目的基因的表達.基因工程技術(shù)最成功的成就:用于新型生物技術(shù)藥物的研制12/29/20242中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/20243中山大學(xué)藥學(xué)院張革41、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識別特殊核甘酸序列，并水解DNA分子的磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵作用。一、基因工程菌的構(gòu)建與篩選

（一）工具酶12/29/20244中山大學(xué)藥學(xué)院張革Ⅱ型酶識別位點是一個回文對稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點也在這一回文對稱結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。51）II型限制性內(nèi)切酶的基本特征5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點12/29/20245中山大學(xué)藥學(xué)院張革62）核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式

粘性末端：12/29/20246中山大學(xué)藥學(xué)院張革平末端：

12/29/20247中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/20248中山大學(xué)藥學(xué)院張革3）同裂酶（isoschizomers)

指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對同裂酶(CCGG)，當靶序列中一個5-甲基胞嘧啶時HpaⅡ不能進行切割，而MspⅠ可以。SmaI(Serratia

marcescensSB) CCC^GGGXmaI(Xanthomonas

malvacaerum) C^CCGGG12/29/20249中山大學(xué)藥學(xué)院張革4）同尾酶（isocaudamer）指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。

。雜種位點（hybridsite）：由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價結(jié)合形成的位點。一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。GGATCC TGATCACCTAGGACTAGTBamHⅠBclⅠG GATCACCTAGTGGATC

ACCTAGT12/29/202410中山大學(xué)藥學(xué)院張革6）影響核酸內(nèi)切酶活性的因素（1）DNA的純度：為提高RE對低純度DNA的反應(yīng)效率，一般:a.增加RE的用量b.擴大酶催化反應(yīng)的體系(稀釋)c.延長酶催化反應(yīng)的保溫時間。（2）DNA的甲基化程度RE是原核生物限制-修飾體系的組成部分，因此識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會強烈地影響酶的活性。為避免產(chǎn)生這樣的問題，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的E.Coli菌株制備質(zhì)粒DNA。12/29/202411中山大學(xué)藥學(xué)院張革（3）酶切消化反應(yīng)的溫度：大多數(shù)37℃,但也有例外SmaI是25℃、ApaI是30℃；MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；還有些RE最適溫度高達60℃以上（4）DNA的分子結(jié)構(gòu)：某些RE切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達20倍。還有一些RE切割它們自己的處于不同部位的限制位點，其效率亦有明顯的差別。據(jù)推測，這很可能是由于側(cè)翼序列的核苷酸成份的差造成的。12/29/202412中山大學(xué)藥學(xué)院張革（5）反應(yīng)系統(tǒng)的組成氯化鎂,氯化鈉或氯化鉀：不正確的NaCl或Mg++濃度，會降低RE的活性，還可能導(dǎo)致識別序列的改變。Tris-HCl：維持最適的pH值（pH＝7.4）。β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：維持酶的穩(wěn)定性。牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性。12/29/202413中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202414限制性內(nèi)切酶在DNA克隆中的應(yīng)用12/29/202414中山大學(xué)藥學(xué)院張革限制性內(nèi)切酶市場新英格蘭公司(NewEnglandBiolabs，NEB)是目前限制性內(nèi)切酶市場主要供應(yīng)廠商。超過30%已知的限制性內(nèi)切酶是首先在NEB發(fā)現(xiàn)的北美市場，Promega的產(chǎn)品歐洲市場，RocheApplied和Fermentas公司。日本市場，Takara的產(chǎn)品

12/29/202415中山大學(xué)藥學(xué)院張革2、DNA連接酶能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。12/29/202416中山大學(xué)藥學(xué)院張革大腸桿菌的DNA連接酶是一條分子量為75KD的多肽鏈?？梢苑忾]雙螺旋DNA上具有5‘-磷酰基和3’-羥基的缺口（nick），不能封閉裂口（gap）；因此，只能連接粘性末端的DNA片段，不能拼接DNA平頭末端；用于粘性末端DNA或切口間連接。12/29/202417中山大學(xué)藥學(xué)院張革T4DNA連接酶（DNAligase）

該酶常從T4噬菌體的感染細胞中提取，是由T4噬菌體基因組所編碼的，它可催化DNA中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結(jié)合起來?；蚬こ讨谐Ｓ玫倪B接酶是T4連接酶。DNA連接酶對具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。12/29/202418中山大學(xué)藥學(xué)院張革3、DNA聚合酶DNA聚合酶 催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復(fù)制的主要酶。全稱叫依賴DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）或DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均縮寫為DDDP。12/29/202419中山大學(xué)藥學(xué)院張革大腸桿菌DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ（PolI）、

DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）、

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、

PolI和PolⅡ的主要功能參與DNA的合成；

PolⅢ的功能同DNA的復(fù)制有關(guān)；

Pol

Ⅰ

同DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。12/29/202420中山大學(xué)藥學(xué)院張革（1）大腸桿菌DNA聚合酶IDNA聚合酶Ⅰ的酶活性：

5’→3’的聚合酶活性；

5’→3’的外切酶活性；

3’→5’的外切酶活性（較低）。

3′5′3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性

3′5′

3′5′5′

3′12/29/202421中山大學(xué)藥學(xué)院張革（2）Klenow

聚合酶Klenow片段（Klenowfragment）：E.coliDNA聚合酶I經(jīng)部分水解生成的C末端605個aa片段。該片段保留了DNA聚合酶I的5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性，但失去了5’→3’外切酶活性。

5’

→3’聚合酶活性；

5’

→3’外切酶活性；

3’

→5’外切酶活性。5’

→3’聚合酶活性；

3’

→5’外切酶活性部分水解12/29/202422中山大學(xué)藥學(xué)院張革23用途⑴補平3‘-凹端利用5‘→3‘DNA聚合酶活性

在模板和引物(DNA或RNA)存在的條件下,以dNTP作底物,沿5‘→3‘方向合成與模板互補的DNA。

12/29/202423中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202424⑵3’-凹端標記12/29/202424中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202425⑶、3‘-凸端削平利用單鏈特異性的3→5外切核酸酶活性

12/29/202425中山大學(xué)藥學(xué)院張革(3)T4噬菌體DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA強。在沒有dNTP存在的情況下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按3’→5’的方向從3’-OH末端開始降解DNA。如果反應(yīng)物中存在一種dNTP時，它的水解作用進行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的dNTP互補的核苷酸時就會停止。12/29/202426中山大學(xué)藥學(xué)院張革3′→5′外切酶活性

3′T5′

3′5′GTCAGTCACAC12/29/202427中山大學(xué)藥學(xué)院張革3′→5′外切酶活性dATP

3′T5′

3′5′GTCAGTCAdATPdATPdATPCAC12/29/202428中山大學(xué)藥學(xué)院張革4.T7噬菌體DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性；有單鏈及雙鏈的3`→5`外切酶活性，但無5`→3`外切酶活性；特點：極佳的連續(xù)合成能力應(yīng)用：（1）用于長模板DNA的引物延伸反應(yīng)；（2）通過單純的延伸或取代合成途徑標記DNA3`末端；（3）使雙鏈DNA的5`或3`突出末端變成平末端。12/29/202429中山大學(xué)藥學(xué)院張革5.TaqDNA聚合酶顯著特點：熱穩(wěn)定性70℃反應(yīng)2h殘留活性為原來的90%；93℃反應(yīng)2h殘留活性為原來的60%；94℃反應(yīng)2h殘留活性為原來的40%。應(yīng)用：（1）DNA序列測定（2）PCR(polymerasechainreaction)對DNA的特定片段進行體外擴增。12/29/202430中山大學(xué)藥學(xué)院張革6.逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

逆轉(zhuǎn)錄酶這類酶來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成DNA。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶兩種。RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。12/29/202431中山大學(xué)藥學(xué)院張革活性：5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3`-OH的RNA或DNA。用途：（1）在體外以mRNA為模板合成cDNA；（2）對有5`突出末端的DNA片段作末端標記（補平）；（3）雙脫氧法測序；（4）以DNA或RNA為模板合成核酸探針。12/29/202432中山大學(xué)藥學(xué)院張革（7）末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase):

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。來源于前淋巴細胞和分化早期的類淋巴細胞。功能：催化5`脫氧核苷三磷酸進行5`→3`方向的聚合作用,逐個將dNTP分子加到線性DNA分子3`-OH端。是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。用途：

(1)用于給外源DNA片段和及載體分子加上互補同聚物尾巴；

(2)標記DNA片段的3`末端。12/29/202433中山大學(xué)藥學(xué)院張革34與聚合酶的不同：12/29/202434中山大學(xué)藥學(xué)院張革逐個將dNTP分子加到線性DNA分子3`-OH端同聚物加尾12/29/202435中山大學(xué)藥學(xué)院張革大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌

12/29/202436中山大學(xué)藥學(xué)院張革堿性磷酸酶功能：催化核酸脫5’-P基團，使DNA或RNA片段5’-P末端轉(zhuǎn)換成5’-OH末端。來源：有兩種，分別來自于大腸桿菌和小牛腸道，前者叫bacterialalkalinephosphatase(BAP);后者叫calfintestinalalkalinephosphatase(CIP)

用途：去除DNA片段5‘磷酸，防止自身環(huán)化；同位素32P標記前的去除5‘磷酸。12/29/202437中山大學(xué)藥學(xué)院張革5‘3’3‘5’P--OH-PHO-堿性磷酸酶的活性堿性磷酸酶5‘3’3‘5’HO--OH-OHHO-12/29/202438中山大學(xué)藥學(xué)院張革T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）來源：T4噬菌體感染的E.coli。功能：催化γ-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA/RNA的5‘-OH端某些情況下，上述的多聚核苷酸的反應(yīng)可以反方向進行，將ATP的γ-磷酸基團與多聚核苷酸的5’端磷酸基團交換，從而不必用堿性磷酸酶對底物進行脫磷酸化。用途：標記DNA的5’-末端；使缺失5‘-P末端的DNA發(fā)生磷酸化作用。12/29/202439中山大學(xué)藥學(xué)院張革T4多核苷酸激酶的活性正向反應(yīng)交換活性12/29/202440中山大學(xué)藥學(xué)院張革S1核酸酶來源：來源于稻谷曲霉（Aspergillus

oryzae）功能：是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶。注意：對雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA-RNA雜交體相對不敏感。12/29/202441中山大學(xué)藥學(xué)院張革P--OHP--OHP--OHP--OHP--OHP--OH單鏈DNA或RNA帶缺口的雙鏈DNA5‘-磷酸單核苷酸或寡核苷酸S1核酸酶S1核酸酶12/29/202442中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202443中山大學(xué)藥學(xué)院張革(二）載體載體(vector)，基因工程上的載體是能將分離或合成的基因?qū)爰毎腄NA分子?；蚬こ讨杏腥N主要類型的載體∶質(zhì)粒DNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒。12/29/202444中山大學(xué)藥學(xué)院張革載體必須具備的幾個性能分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。能獨立于染色體而進行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。要有盡可能多種RE的切割位點，但每一種RE又要最少的切割位點（多克隆位點multiplecloningsites，MCS）。有適合的標記，易于選擇。有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉(zhuǎn)錄及表達，并且盡可能是高效的表達。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。12/29/202445中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202446中山大學(xué)藥學(xué)院張革載體的分類根據(jù)功能克隆載體:

克隆一個基因或DNA片斷表達載體:

用于一個基因的蛋白表達整合載體:

把一個基因插入到染色體組中12/29/202447中山大學(xué)藥學(xué)院張革根據(jù)來源：

質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體真核細胞表達載體其中質(zhì)粒DNA是最常用的載體，但運載能力低，柯斯質(zhì)粒是質(zhì)粒和λ噬菌體DNA的結(jié)合體，運載能力最高。在這三種類型的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的目的，出現(xiàn)了各種類型的改造載體。12/29/202448中山大學(xué)藥學(xué)院張革（1）質(zhì)粒（plasmid）載體

質(zhì)粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，可自身復(fù)制和表達，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標記的抗藥性基因。作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體?？寺〉馁|(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲存。主要是DNA水平上的操作?；虮磉_的質(zhì)粒載體允許外源DNA的插入、儲存和表達。12/29/202449中山大學(xué)藥學(xué)院張革質(zhì)粒的生物學(xué)特性：1）質(zhì)粒DNA的構(gòu)型：SC型：共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA）OC型：開環(huán)DNA（ocDNA）L型：線性DNA（cDNA）12/29/202450中山大學(xué)藥學(xué)院張革作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分：復(fù)制基因(Ori)選擇性記號(Amp,Kana)多克隆位點(MCS)12/29/202451中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202452中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202453中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202454中山大學(xué)藥學(xué)院張革（三）目的基因常用制備方法1.化學(xué)合成法

較短的基因<100bp

大片段怎么合成？1977年，加拿大Itakara將人工合成的生長激素釋放因子基因在E.coli中表達，這是首次高等生物基因通過基因工程高效表達并產(chǎn)業(yè)化。干擾素、人胰島素、加壓素等的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)12/29/202455中山大學(xué)藥學(xué)院張革

合成兩條基因互補鏈片斷，經(jīng)退火成為兩端黏性末端的DNA片斷退火12/29/202456中山大學(xué)藥學(xué)院張革2.PCR法適用于克隆序列清楚的基因以基因組DNA為模板，直接進行PCR擴增較難多采用以mRNA為模板的RT-PCR法12/29/202457中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202458中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202459中山大學(xué)藥學(xué)院張革3.基因文庫法:基因文庫（genelibrary)：是指某一特定生物體全部基因組的克隆集合，包括所有外顯子和內(nèi)含子序列。基因文庫的構(gòu)建：鳥槍法（shotgun)12/29/202460中山大學(xué)藥學(xué)院張革Shotgunlibraty12/29/202461中山大學(xué)藥學(xué)院張革基因文庫的應(yīng)用12/29/202462中山大學(xué)藥學(xué)院張革4.cDNA文庫法cDNA（complementaryDNA）為具有與某RNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNA，或此DNA鏈與具有與之互補的堿基序列的DNA鏈所形成的DNA雙鏈。mRNA的cDNA，與原來基因的DNA（基因組DNA，genomicDNA）不同而無內(nèi)含子；在mRNA存在的3′末端的多A序列的核苷序列，外顯子序列、先導(dǎo)序列以及后續(xù)序列等。12/29/202463中山大學(xué)藥學(xué)院張革cDNA文庫指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部

mRNA，

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典

cDNA

文庫構(gòu)建的基本原理是用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機引物，給所合成的cDNA

加上適當?shù)倪B接接頭，連接到適當?shù)妮d體中獲得文庫。12/29/202464中山大學(xué)藥學(xué)院張革(四）載體DNA與目的基因的連接DNA分子體外重組：連接酶催化載體DNA與目的基因DNA片段連接。形成重組子（recombinant)的過程。1.粘性末端的連接：經(jīng)雙酶切獲得粘性末端，用連接酶進行連接2.平頭末端的連接：連接效率低，一般采用加尾法、接頭法3.連接效率：目的基因與載體DNA的摩爾比大于1

12/29/202465中山大學(xué)藥學(xué)院張革不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。定向克隆12/29/202466中山大學(xué)藥學(xué)院張革問題：如何加入合成接頭？12/29/202467中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202468中山大學(xué)藥學(xué)院張革EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ12/29/202469中山大學(xué)藥學(xué)院張革cDNA克隆的過程12/29/202470中山大學(xué)藥學(xué)院張革（五）重組DNA導(dǎo)入宿主細胞宿主細胞：原核細胞：大腸桿菌、枯草桿菌鏈球菌真核細胞：酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物細胞原核細胞的轉(zhuǎn)化方法：電穿孔轉(zhuǎn)化法化學(xué)轉(zhuǎn)化法12/29/202471中山大學(xué)藥學(xué)院張革導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)◆轉(zhuǎn)化(transformation)：以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入原核細胞的過程.◆轉(zhuǎn)染(transfection):

以噬菌體或病毒為載體構(gòu)建重組DNA分子導(dǎo)入真核細胞的過程.12/29/202472中山大學(xué)藥學(xué)院張革表達產(chǎn)物的形式：細胞內(nèi)不溶性表達（包含體）、胞內(nèi)可溶性表達、細胞周質(zhì)表達，極少還可分泌到胞外表達。不同的表達形式具有不同的表達水平，且會帶來完全不同的雜質(zhì)。1.重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌12/29/202473中山大學(xué)藥學(xué)院張革氯化鈣轉(zhuǎn)化法：在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化(transformation)特指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入宿主細胞的過程。是利用低溫（0℃）和氯化鈣（CaCl2）低滲溶液的理化處理使宿主細胞處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)，即感受態(tài)（competence）。

轉(zhuǎn)染法：如果外源DNA被包裝成λ噬菌體顆粒，則可通過噬菌體感染機制導(dǎo)入宿主細胞。體外包裝是將重組DNA分子與λ噬菌體的頭部、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合，從而組裝成完整具有感染力的λ噬菌體粒子。12/29/202474中山大學(xué)藥學(xué)院張革重組DNA導(dǎo)入酵母酵母：繁殖迅速，可廉價的大規(guī)模培養(yǎng)，而且沒有毒性，基因工程操作與原核生物相似，表達產(chǎn)物直接分泌到細胞外，簡化了分離純化工藝。表達產(chǎn)物能糖基化。特別是某些在細菌系統(tǒng)中表達不良的真核基因，在酵母中表達良好。目前以釀酒酵母應(yīng)用最多。12/29/202475中山大學(xué)藥學(xué)院張革酵母電轉(zhuǎn)化法：酵母用山梨醇處理，制備感受態(tài)細胞；將線性化DNA、感受態(tài)細胞置于電轉(zhuǎn)儀中，通過電擊將DNA導(dǎo)入細胞；電擊后應(yīng)立即加入冰冷的山梨醇溶液（是為了修復(fù)電擊受損的酵母細胞，加入的越快越有利于細胞的恢復(fù)）。12/29/202476中山大學(xué)藥學(xué)院張革重組DNA導(dǎo)入鏈霉菌鏈霉菌：重要的工業(yè)微生物。特點是不致病、使用安全，分泌能力強，可將表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，可做理想的受體菌。12/29/202477中山大學(xué)藥學(xué)院張革原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法：原生質(zhì)體protoplast：人工條件下用溶菌酶等除去細胞壁后，所留下的部分。用PEG處理原生質(zhì)體(化學(xué)助融劑如PEG加Ca2+）加入DNA。

12/29/202478中山大學(xué)藥學(xué)院張革重組DNA導(dǎo)入哺乳類細胞哺乳動物細胞：由于外源基因的表達產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細胞分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液成分完全由人控制，從而是產(chǎn)物純化變得容易。產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物。但動物細胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低，而且培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較稀。顯微注射法磷酸鈣轉(zhuǎn)染法葡聚糖轉(zhuǎn)染法陽性介質(zhì)轉(zhuǎn)染法電穿孔法細胞融合法病毒感染法12/29/202479中山大學(xué)藥學(xué)院張革（六）重組子的篩選與鑒定載體遺傳標記法抗生素抗性篩選法如果外源DNA片段插入載體的位點位于抗生素抗性基因之外，將轉(zhuǎn)化后的重組體細胞置于含有該抗生素的培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，仍可長出菌落。此法缺點是假陽性率高在含有抗生素的培養(yǎng)基中能夠生長的抗性細胞內(nèi)可能存在哪幾種類型的載體？12/29/202480中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202481中山大學(xué)藥學(xué)院張革互補篩選法采用遺傳缺陷型宿主細胞、而重組子含有編碼該基因的DNA序列。最常用的為藍白斑篩選某些載體，如M13噬菌體載體，pUC質(zhì)粒系列等，它們的載體上都攜帶lacZ基因一段序列，它編碼β-半乳糖苷酶的α肽，而宿主細胞為lacZ△Ml5的突變株。當將上述載體的轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)在含有x-gal和IPTG平板中，由于基因內(nèi)互補作用，產(chǎn)生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培養(yǎng)基中的無色的x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）分解成半乳糖和呈藍色的5-溴-4氯-靛藍，使菌落呈藍色：12/29/202482中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202483中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202484中山大學(xué)藥學(xué)院張革營養(yǎng)缺陷型篩選法用某些物理因素或化學(xué)因素處理宿主細胞，使基因發(fā)生突變，喪失合成某一物質(zhì)（如氨基酸、維生素、核苷酸等）的能力，因而它們不能在基本培養(yǎng)基上生長，必須補充某些物質(zhì)才能生長。這樣從野生型經(jīng)誘變篩選得到的菌株，稱為營養(yǎng)缺陷型。導(dǎo)入編碼某些營養(yǎng)成分基因的載體，可使營養(yǎng)缺陷型細胞在缺少該營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中生長。12/29/202485中山大學(xué)藥學(xué)院張革組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救12/29/202486中山大學(xué)藥學(xué)院張革噬菌斑篩選法：噬菌體成功感染細菌將導(dǎo)致溶菌未插入外來DNA的空載體由于長度過小不能裝配成噬菌體顆粒。12/29/202487中山大學(xué)藥學(xué)院張革2.核酸分子雜交法菌落(或噬菌斑)原位雜交(insituhybridization)將轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)在瓊脂平板上，當形成菌落或噬菌斑后，再將硝酸纖維濾膜貼在平板上，使菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上。翻轉(zhuǎn)此濾膜并置于另一不含菌的平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)后的濾膜上可長出菌落或噬菌斑。12/29/202488中山大學(xué)藥學(xué)院張革取出濾膜，用裂解液處理使菌體裂解，釋放出DNA。再用堿處理，使DNA變性，經(jīng)烘烤將變性DNA固定于濾膜上。然后用放射性同位素標記的核酸探針進行分子雜交，并經(jīng)放射自顯影，黑點代表雜交上的菌落，即可篩選到陽性克隆。12/29/202489中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202490中山大學(xué)藥學(xué)院張革DNA印跡分析（Southernblotting)通過吸附或電泳方法將經(jīng)凝膠電泳分離的DNA分子物質(zhì)從膠上轉(zhuǎn)移到固相載體上，再與特定的探針反應(yīng)從而達到檢測或鑒定這些DNA分子物質(zhì)的過程。NorthernBlotting（Northern印跡）

12/29/202491中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202492中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/202493中山大學(xué)藥學(xué)院張革3.限制性酶譜分析法將初步篩選的陽性克隆小量培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA，用1-2種RE酶切，然后進行凝膠電泳，檢測插入DNA片段大小。12/29/202494中山大學(xué)藥學(xué)院張革XhoINotIXhoIMEKK11200bpPromoter400bppUC-mT2700bpColony12313100bp1200bp400bp2700bpXhoIcuttingXhoI+NotIcutting1200bppUC-mT/pLMP1-MEKK14300bp實例12/29/202495中山大學(xué)藥學(xué)院張革4.DNA序列測定為了確證目的基因序列的正確性，必須對重組體的DNA進行序列測定。12/29/202496中山大學(xué)藥學(xué)院張革5.目的基因表達產(chǎn)物測定法例：免疫斑點測定法如果表達產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的一部分，它具有抗原性可與其特異抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。此法實驗操作極似菌落(或噬菌斑)原位雜交。將平板上的克隆轉(zhuǎn)移到濾膜上，處理濾膜使菌體裂解，釋放出蛋白質(zhì)，固定于濾膜上，加入標記抗體。如果抗體用放射性同位素標記，則免疫反應(yīng)后進行自顯影；若加入的抗體用酶偶聯(lián)(酶標)，那么此酶就可將無色底物水解成有色產(chǎn)物。12/29/202497中山大學(xué)藥學(xué)院張革基因載體目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒

PCRcDNA

人工合成基因文庫限制性內(nèi)切酶有切口的載體有切口的目的基因DNA連接酶

重組體

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體的宿主細胞表型篩選電泳法核酸雜交免疫學(xué)方法目的基因的表達12/29/202498中山大學(xué)藥學(xué)院張革

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程12/29/202499中山大學(xué)藥學(xué)院張革（七）原核細胞表達的特點及選擇外源基因表達的調(diào)控元件啟動子:是DNA鏈上能與RNA聚合酶結(jié)合并起始mRNA合成的一段序列plac啟動子:最早應(yīng)用于的表達系統(tǒng)是Lac乳糖操縱子ptrc啟動子:是trp啟動子和lac啟動子的拼合啟動子λPL:λ噬菌體的轉(zhuǎn)錄啟動子PL,該啟動子受控于λ噬菌體cI基因產(chǎn)物T7啟動子:是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流12/29/2024100中山大學(xué)藥學(xué)院張革核糖體結(jié)合位點(rbs):原核微生物的mRNA結(jié)合核糖體的序列稱為SD序列(shine-dalgarnosequence)。SD序列位于AUG上游3-11個核苷酸處的一段3-9個堿基的DNA序列,該序列和核糖體蛋白S1與16SrRNA的3′端互補，形成核糖體-mRNA復(fù)合體，共同起始蛋白質(zhì)的合成。SD序列與AUC之間的距離可直接影響表達效率。終止子：是基因3‘端可被RNA聚合酶識別并停止轉(zhuǎn)錄功能的特定序列。12/29/2024101中山大學(xué)藥學(xué)院張革2.外源基因在大腸桿菌中的表達形式大腸桿菌被內(nèi)膜、外膜分隔為胞內(nèi)、周質(zhì)、胞外三個區(qū)域表達可定位于胞內(nèi)、周質(zhì)、胞外胞內(nèi)表達率高，但易行成包涵體12/29/2024102中山大學(xué)藥學(xué)院張革胞內(nèi)表達的兩種方式非融合蛋白的胞內(nèi)表達表達非融合蛋白的操縱子必須改建成：細菌或噬菌體的啟動子-細菌的RBS-真核基因的AUG-結(jié)構(gòu)基因-*。易被蛋白酶破壞；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反應(yīng)StopATGSDP目的基因12/29/2024103中山大學(xué)藥學(xué)院張革非融合型表達載體

PSDForeignDNA非融合型表達載體非融合基因主要元件：強啟動子，SD，ATG：第一個密碼子ATGPSDTAAMCS12/29/2024104中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/2024105中山大學(xué)藥學(xué)院張革融合型表達載體

PSDForeignDNA融合型表達載體

C端融合基因ATGTAA

N端融合基因ATGTAA12/29/2024106中山大學(xué)藥學(xué)院張革融合蛋白的表達融合蛋白氨基端是原核序列羧基端是真核序列；優(yōu)點：操作簡便蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定易高效表達；StopATGSDP目的基因tagtag12/29/2024107中山大學(xué)藥學(xué)院張革Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相載體（1）融合型載體----pGEX系列12/29/2024108中山大學(xué)藥學(xué)院張革12/29/2024109中山大學(xué)藥學(xué)院張革1.小分子量或易降解，或?qū)λ拗饔卸镜哪康牡鞍椎谋磉_2.GST標簽純化樹脂GSTResin純化12/29/2024110中山大學(xué)藥學(xué)院張革（2）融合型載體----His融合1.His-Tag分子量小，無抗原性2.Ni-NTAResin

(His標簽純化樹脂)親和純化12/29/2024111中山大學(xué)藥學(xué)院張革

pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達載體。該質(zhì)粒在PRPL啟動子下游插入proteinG的IgGFc結(jié)合區(qū)基因片段180個堿基對，1.可用親和層析(SPA)。簡化下游工藝。2.溴化氫裂解，不用酶（3）融合型載體----IgG融合12/29/2024112中山大學(xué)藥學(xué)院張革融合表達質(zhì)粒pBG-2的結(jié)構(gòu)12/29/2024113中山大學(xué)藥學(xué)院張革分泌型表達：將外源基因接到信號肽之后，使之在胞質(zhì)內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，當表達的蛋白質(zhì)進入細胞外膜和細胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)后時，被信號肽酶識別切割，從而釋放出有生物活性的外源基因表達產(chǎn)物。產(chǎn)量不高，信號肽不被切割或不在特定位置上切割。12/29/2024114中山大學(xué)藥學(xué)院張革目標蛋白在周質(zhì)空間中表達的優(yōu)點大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為100種，只占菌體總蛋白數(shù)量的4%。蛋白水解酶的含量與在細胞質(zhì)中相比也少得多，因此目標蛋白在周質(zhì)空間中表達有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。目標蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間過程中信號肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。周質(zhì)空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢使目標蛋白能夠較好折疊，維持正確的構(gòu)象。12/29/2024115中山大學(xué)藥學(xué)院張革3.大腸桿菌中外源蛋白表達效率的影響因素外源基因密碼子的使用稀有密碼子：AGA、AGC、ATA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC共八種采用稀有密碼子會導(dǎo)致：表達效率低下、錯配率高可采用定點突變的策略進行同義突變12/29/2024116中山大學(xué)藥學(xué)院張革mRNA的結(jié)構(gòu)：mRNA的一級結(jié)構(gòu)對翻譯效率的影響采用偏好密碼子（增加T、A含量）大腸桿菌的核酸酶系統(tǒng)能專一性地識別外源DNA或RNA并對其進行降解。mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯效率的影響發(fā)夾的形成的雙重作用—即可保護mRNA不被降解、但阻礙翻譯的起始和延伸12/29/2024117中山大學(xué)藥學(xué)院張革表達載體的選擇（1）載體能夠獨立的復(fù)制；（2）具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記。且克隆位點應(yīng)在啟動子序列后，以使克隆的外源基因得以表達；（3）具有很強的啟動子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄無關(guān)的基因；（4）具有抑制子，使啟動子受到控制，只有當誘導(dǎo)時才能進行轉(zhuǎn)錄；（5）具有很強的終止子；（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。12/29/2024118中山大學(xué)藥學(xué)院張革外源蛋白的穩(wěn)定性組建融合蛋白；利用信號肽，分泌型表達；特異性突變；位點特異突變，改變二硫鍵位置；蛋白酶缺陷型宿主12/29/2024119中山大學(xué)藥學(xué)院張革（八）真核細胞表達的特點及選擇由于：原核表達系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工修飾多以包涵體形式存在外源蛋白在原核生物中不穩(wěn)定，易被降