DB51T 2649-2019 小熊貓親子鑒定技術(shù)規(guī)范　　

DB51四川省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB51/T2649—2019 1 1 1 1 2 3 3 4 5 6DB51/T2649—20191DB51/T2649—2019小熊貓親子鑒定技術(shù)規(guī)范本標準適用于四川省圈養(yǎng)小熊貓親子鑒定、個體識別、遺傳多樣性評估和遺傳檔CJJ/T263-2017動物園動物管微衛(wèi)星標記Microsatellit微衛(wèi)星親子鑒定MicrosatellitePaternit4樣品采集與保存2DB51/T2649—20194.1采樣范圍4.2采樣工具一次性橡膠手套、EDTA抗凝采血管、采樣登記表、采4.3血液及組織樣品采集4.4糞便樣品采集采集樣品時，應佩戴一次性手套，禁止用手直接觸碰4.5樣品記錄與編號在采集樣品時，填寫《小熊貓樣品采集記錄表》（附錄A）。記錄采樣時間、地點、動物編號、性別、年齡、來源以及動物體況特征等。在采血管/采樣袋和采樣表表示成都動物園血液樣品，電子芯片號75687表示成都動物園糞便樣品，電子芯片號75634血液樣品采集編號規(guī)則為：動物園首寫字母（三位）+B（血液樣品）+樣品號或動物呼名，如 糞便樣品采集編號規(guī)則為：動物園首寫字母（三位）+F（糞便樣品）+樣品號或動物呼名，如“CDZ-F-001”表示成都動物園001號個體糞便樣品，“C使用樣品對應的專用商品試劑盒或傳統(tǒng)分子生物學技術(shù)手段進行3DB51/T2649—2019近期使用的DNA，裝有DNA的離心管保存于-2號為備選標記。當基本標記不能成功進行親子鑒定時，考進行小熊貓個體識別時，在10個微衛(wèi)星標記中選擇使用（附錄B），其中1-5號為基本標記，6-10號為備選標記。當基本標記不能成功進行個體識別時，考使用微量分光光度計對每個DNA樣品進行濃度分析。血液樣品260/280在1.8-2.0之間，糞便樣品260/280在1.7-2.1之間，濃度超過50ng/ul的DNA樣品合格。不在范圍內(nèi)的DNA記。詳細記錄引物合成的公司名稱、合成批次及每個引物Taqpolymerase(2.5U/4DB51/T2649—2019PCR擴增程序：95℃預變性10分鐘；95℃變性15秒，退火（退火溫度根據(jù)具體的引物確定）15秒，）；當PCR擴增完成后，取PCR產(chǎn)物5μL，經(jīng)1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如電將符合質(zhì)量要求的PCR產(chǎn)物避光（使用錫箔紙盒）存放于4℃冰箱，用將符合質(zhì)量要求的PCR產(chǎn)物送有關(guān)實驗室進行基因掃不同顏色標記引物的PCR產(chǎn)物或者相同顏色標記但PCR產(chǎn)物長度明顯不重疊的可以混合后進行基因同一批樣品或同一地樣品分兩/多批次檢測的，需使用一個已檢對未鑒定出父本或母本的，擴大疑是父母范圍，進行樣品采集、PCR擴增和基因分型，以進一步確當兩個或兩個以上的樣品微衛(wèi)星標記分型結(jié)果完當兩個樣品的微衛(wèi)星標記分型結(jié)果中只有一個標記差異時，對出現(xiàn)差異的位點重復PCR擴增（2-3個體；若仍存在標記差異，則認為兩個樣品來自不5DB51/T2649—2019A號性別左一雌雄6DB51/T2649—2019B5’-3’℃1Aifu-01R:GGTATCAGACGTGGGA2F:ACTCTACTATGATTCTGCCTATR:TGAAGGTTATCTCAGG3Aifu-04F:TTATTTTTTTATGGCTGAGR:GCACTGCTAGTTATTT4F:TGAGGGCATTTGATTTR:AGAGTGAACTGGAATG5Aifu-066F:TTCCCAACTTTCTTCTCTR:AACCAACCCAGTGACA7Aifu-22F:CACGTTGGCTTCAGTAR:GGTTCGGATAAAGTATTR:CCTTGATTTGTTGGAG8Aifu-23F:GGACCCAACAAGCCCTTTR:TTCTCTCTCAGCCTCTCA9F:AACCTCTGTCCTCCTCCR:GCACAATGGTTTAGGCR:ACGGGTCAGAGTCAGAF:AAGTTGAAATGCCCGAGR:TTGCTGGTAGTTGTAGTAATF:TGATTCAAGGTTCCCTAR:AAGAAAGTGGTTAGTTTAAF:AATGTCAAGGAAGAACCR:TTCACTGCTCACCGTTAifu-05F:GAATAATGAGCTTGCCTR:TTGACATTGGCTATGTGF:GACTCTTGGTTTCAGGGR:TCTACACTGGACCATTTTTR:CTTATGCTCTTTCTCC7DB51/T2649—20195’-3’℃F:TTCATGTCCTTTTGGATR:CCTCTTTTACCTCTGCF:AGAGTATCTCGGAAACTGF:TGCGGTGTATTCAGGTAR:TCTTTGAACCCTCAGCF:GGGGCCTTGTCTAATTCAifu-02F:GACCCAGCCCTAACTCR:FAM-CCTGCATTAGGCTCF:AGTGTCTGAAAAATGGAGATF:TAGGGTTCAAGCTCTTACTTAGR:AGCAAACTGTTCTACCACTAifu-24F:AGAGGG