DB51T 2467-2018 鯽皰疹病毒II型病診斷技術(shù)規(guī)程

12018-04-18發(fā)布2018-05-01實(shí)施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I II 1 13術(shù)語(yǔ)和定義 1 2 26臨床檢查 2 2 29病毒鑒定 3 4附錄A(規(guī)范性附錄)試劑配方 5附錄B(資料性附錄)CyHV-2解旋酶基因參考序列(1446bp) 6ⅡDB51/T2467—2018本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009給出的規(guī)定進(jìn)行編寫(xiě)。本標(biāo)準(zhǔn)中附錄A為規(guī)范性附錄、附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：耿毅、余澤輝、陳德芳、鄧夢(mèng)玲、黃小麗、歐陽(yáng)萍、鄭李平。1鯽皰疹病毒11型病診斷技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鯽皰疹病毒II型病診斷的術(shù)語(yǔ)與定義、試劑和材料、臨床檢查、實(shí)驗(yàn)室樣品采集、病毒分離、病毒鑒定和綜合判定等技術(shù)規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鯽(Carassiusauratus)與金魚(yú)皰疹病毒II型病的診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于文件的應(yīng)用時(shí)必不可少的。凡是注日期的應(yīng)用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB/T18088出入境動(dòng)物檢疫采樣SC/T7014水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范SC/T7103水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于此文件。鯽皰疹病毒11型Cyprinidherpesvirus2,CyHV-2是一種感染鯽魚(yú)及其變種(金魚(yú)、異育銀鯽與彩鯽等)的高致病性病毒，又稱金魚(yú)造血器官壞死病毒(Goldfishhaematopoieticnecrosisvirus,GFHNV)或皰疹病毒性造血器官壞死病病毒(Hhaematopoieticnecrosisvirus巢氏聚合酶鏈?zhǔn)戏磻?yīng)。細(xì)胞病變效應(yīng)。金魚(yú)鰭細(xì)胞系。24試劑和材料用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。4.2試劑與培養(yǎng)基按GB/T4789.28與SC/T7014規(guī)定執(zhí)行，金魚(yú)鰭細(xì)胞系(GFF)、小牛血清(FBS)、M199營(yíng)養(yǎng)5設(shè)備和器械6臨床檢查6.1臨床癥狀6.2外部檢查鰓明顯充血、出血，呈現(xiàn)典型“大紅鰓”,或腐爛壞死；肝、腎腫大、出血；7實(shí)驗(yàn)室樣品采集8病毒的分離3DB51/T2467—20188.1樣品處理應(yīng)在10℃以下進(jìn)行。先用組織研磨器將樣品勻漿，再用細(xì)胞培養(yǎng)液PBS緩沖液(A.1)按1:10的最終稀釋度組織懸液，加入100IU/mL雙抗(青霉素、鏈霉素A.2)后，置4℃冰箱作用1-2h后，反復(fù)凍融3次，用0.22μm的一次性濾器過(guò)濾除菌，濾液保存于-20℃或以下溫度冷凍保存。8.2細(xì)胞接種與觀察將上述濾液用細(xì)胞培養(yǎng)液(A.3)再做兩次10倍稀釋，然后將這1:10、1:100、1:1000三種稀釋度的濾液，分別接種到生長(zhǎng)24-48h的GFF單層細(xì)胞，按每2cm2的細(xì)胞單層接種100μL,的中，25°℃吸附1-2h后棄病毒液，然后加含2%FBS和100IU/ml雙抗的M199細(xì)胞培養(yǎng)維持營(yíng)養(yǎng)液(A.4),置于25°C培養(yǎng)。接種濾液后的細(xì)胞，7d內(nèi)每天每天用倒置顯微鏡觀察CPE出現(xiàn)情況。典型的CPE為細(xì)胞空泡、變圓、脫落。若細(xì)胞出現(xiàn)CPE,收集細(xì)胞液進(jìn)行鑒定。若細(xì)胞在接毒后7d未出現(xiàn)CPE,盲傳一次，再培養(yǎng)觀察7d,未出現(xiàn)CPE的樣品則可判定為陰性。9病毒鑒定9.1樣品處理對(duì)有臨床癥狀的病魚(yú)，按8.1的要求取樣勻漿后取50mg-100mg于1.5mlEP管中；對(duì)出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)樣品取450μL于1.5mlEP管中。用CyHV-2核酸作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)感染CyHV-2鯽魚(yú)正常組織或無(wú)病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物為陰性對(duì)照，用等體積的雙蒸水作為空白對(duì)照。DNA提取可使用商品化的組織病毒DNA抽提試劑盒(按說(shuō)明書(shū)操作),或使用傳統(tǒng)酚-氯仿提取法，具體操作如下(傳統(tǒng)法):a)將樣品置于-40℃冰箱反復(fù)凍融3次，12000r×5min。b)取上清400μl,加入500ultris-飽和酚，充分混合，靜置5min,12000r×5min,4℃。c)取上清加入飽和酚，氯仿各200μl,混勻，靜置5min,12000r×5min,4℃。重復(fù)一次。d)取上清加入200μl氯仿，混勻，12000r×5min,4℃,此時(shí)將出現(xiàn)分層。如果中層蛋白多，則重復(fù)上一步驟。e)取上清加1-2倍體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置20min,12000r×5min,4℃。f)棄上清，用75%酒精洗滌，12000r×5min,4℃,重復(fù)操作一次。g)棄上清，操作臺(tái)中自然晾干后，20-30μ1TE溶解沉淀，-20℃保存，備用。9.3巢氏PCR擴(kuò)增反應(yīng)分兩步進(jìn)行，先使用外引物P1-F和P1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物為模板使用內(nèi)引物P2-F和P2-R進(jìn)行二次擴(kuò)增。9.3.1第一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)雙蒸水補(bǔ)足體積至25μL?；靹蚝螅?000r/min離心30s。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸40s,循環(huán)30次，最后在72℃延伸10min。4DB51/T2467—20189.3.2第二次PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系：12.5μLMix-reactionbuffer,P2-F和P2-R引物各lμL(10umol/L),取1μL第一次PCR產(chǎn)物為模板，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足體積至25μL?；靹蚝?，3000r/min離心30s。反應(yīng)條件：同第一次PCR反應(yīng)。9.4瓊脂糖凝膠電泳用TAE電泳緩沖液(A.5)配制1%的瓊脂糖(A.6)平板，凝固后放入水平電泳槽，使電泳緩沖液(A.7)剛好淹沒(méi)膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍(lán)指示劑溶液(A.8)混合后加入樣品孔，使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對(duì)照。120V電泳約20min-40min,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。于紫外光下觀察。9.5結(jié)果判定第一次PCR后陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條716bp的DNA片段條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有該擴(kuò)增條帶。第二次PCR后陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條357bp的DNA片段條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有該擴(kuò)增條帶。待測(cè)樣品PCR擴(kuò)增后能在相應(yīng)的716bpDNA位置上有帶，且巢氏PCR擴(kuò)增后在相應(yīng)357bp位置上有帶者；或者雖經(jīng)PCR擴(kuò)增后可能因?yàn)闈舛忍涂床坏娇梢?jiàn)的目的條帶，但第二次PCR擴(kuò)增后在相應(yīng)357bp位置上有帶者，均可判定為陽(yáng)性，無(wú)帶則為陰性。若第二次PCR擴(kuò)增條帶大小和陽(yáng)性片段接近難以確定，則進(jìn)行測(cè)序，并與已知序列(附錄B)比對(duì)，同源性達(dá)98%以上則為陽(yáng)性，否則為陰性。10綜合判定有臨床癥狀，滿足以下任何一條都可以確診為CyHV-2陽(yáng)性，判定患鯽皰疹病毒II型病?！苯犹崛〔≡罱M織DNA作為模板，巢氏PCR檢測(cè)陽(yáng)性。若沒(méi)有臨床癥狀，滿足以下任何一條都可以確診為CyHV-2陽(yáng)性，判定為CyHV-2攜帶。—細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)典型CPE,巢氏PCR檢測(cè)陽(yáng)性；—直接提取組織DNA作為模板，巢氏PCR檢測(cè)陽(yáng)性。5(規(guī)范性附錄)800mL超純水中溶解8gNaCl,0.2gKCl,3.58gNa?HPO?-12H?0,0.24gKH2P04,用1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH為7.4,加超純水定容至1L,高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆?。將青霉素和鏈霉素霉素用超純水配成各?0,000IU/mL濃度的混合儲(chǔ)存液，經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾后分裝，-20℃保存，使用時(shí)的工作濃度為100IU/mL。A.3M199營(yíng)養(yǎng)液按說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行配制，按說(shuō)明書(shū)加入一定量的NaHCOs調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液pH值為7.2,定容至1L,0.22μm濾器過(guò)濾除菌后分裝，4℃保存?zhèn)溆?。A.4細(xì)胞生長(zhǎng)液(含10%胎牛血清的M199)、細(xì)胞維持液(含2%胎牛血清的M199)相應(yīng)加入胎牛血清即A.5TE緩沖液(pH8.0)將0.121gTris堿(分子量121.1),0.0372g乙二胺四乙酸二鈉(分子量372.24)加入80mL雙蒸水中，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,加雙蒸水定容至100mL,室溫保存。A.61%瓊脂糖凝膠瓊脂糖1g中加入1xTAE緩沖液100mL,加熱溶解后，加入5μLGoldenview混勻。A.750×TAE電泳緩沖液在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50mL0.5/LE