考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)含量

實驗二考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)含量指導(dǎo)老師：王小燕一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握考馬斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。

二、實驗原理考馬斯亮藍G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1000μg／mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。二、材料、主要儀器和試劑

1．實驗材料

新鮮綠豆芽

2．主要儀器

（1）分析天平、臺式天平

（2）刻度吸管

（3）具塞試管、試管架

（4）研缽

（5）離心機、離心管

（6）燒杯、量筒

（7）微量取樣器

3．試劑

（1）牛血清白蛋白標準溶液的配制：準確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為1000μg／mL的原液。

（2）蛋白試劑考馬斯亮藍G-250的配制：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。此溶液在常溫下可放置一個月。

（3）乙醇

（4）磷酸（85％）

四、操作步驟1．標準曲線制作

（1）0~100μg／mL標準曲線的制作：取6支10mL干凈的具塞試管，按表1取樣。蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min后用1cm光經(jīng)的比色杯在595nm波長下比色，記錄各管測定的光密度OD595nm，并做標準曲線。

表1低濃度標準曲線制作

（2）0~1000μg／mL標準曲線的制作：另取6支10mL具塞試管，按表2取樣。其余步驟同（1）操作，做出蛋白質(zhì)濃度為0~1000μg／mL的標準曲線。

表2高濃度標準曲線制作

2．樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定

（1）待測樣品制備：稱取新鮮綠豆芽下胚軸2g放入研缽中，加2mL蒸餾水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min離心20min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入10mL容量瓶，并以蒸餾水定容至刻度，即得待測樣品提取液。

（2）測定：另取2支10mL具塞試管，按下表取樣。吸取提取液0.1mL（做一重復(fù)），放入具塞刻度試管中，加入5mL考馬斯亮藍G-250蛋白試劑，充分混合，放置2min后用1cm光徑比色杯在595nm下比色，記錄光密度OD595nm，并通過標準曲線查得待測樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X（μg）。以標準曲線1號試管做空白。

五、結(jié)果計算式中：X為在標準曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（μg）。六、附注

1．Bradford法由于染色方法簡單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測定。

2．有些陽離子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物質(zhì)不干擾測定，但大量的去污劑如TritonX-100、SDS等嚴重干擾測定。

3．蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G