T-HBIQA 0004-2024 人體尿液中9種酪氨酸激酶類藥物含量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法

ICS01.040.11CCSC10/29T/HBIQADeterminationofninetyrosinekinasedrugsinhumanurinebyHPLC-MS/MS2024-08-15發(fā)布河北省檢驗檢疫學會發(fā)布T/HBIQA0004—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由河北省檢驗檢疫學會提出并歸口。本文件起草單位：河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院、河北醫(yī)科大學藥學院。本文件主要起草人：李揮、梁艷、李怡霖、宋莉、姜文。1T/HBIQA0004—2024人體尿液中9種酪氨酸激酶類藥物含量的測定高效液相色譜-串聯(lián)質譜法本文件規(guī)定了人體尿液中9種酪氨酸激酶類藥物含量的高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法。本文件適用于人體尿液中替萬替尼，LY2157299，索拉非尼，倫伐替尼，瑞戈非尼，卡博替尼，安羅替尼，阿帕替尼和吉非替尼含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理樣品用甲醇提取，提取液加入無水硫酸鎂鹽析后，用N-丙基乙二胺（PSA）吸附凈化，液相色譜-質譜/質譜法測定，內標法定量。5試劑和材料5.1試劑和材料除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.2乙酸乙酯：色譜純。5.1.3丙酮：色譜純。5.1.4甲酸：色譜純。2T/HBIQA0004—20245.1.5乙酸：色譜純。5.1.6乙腈：色譜純。5.1.7無水硫酸鎂。5.1.8N-丙基乙二胺（PSA）。5.1.9標準品：替萬替尼（CAS號：1000873-98-2）、LY2157299（CAS號：700874-72-2）、索拉非卡博替尼（CAS號：1140909-48-3），安羅替尼（CAS號：1058156-90-3），阿帕替尼（CAS：41567-78-6吉非替尼（CAS號：184475-35-2）和普萘洛爾（CAS號：525-66-6）純度均≥98%。5.1.10混合標準儲備溶液的配制：分別稱取替萬替尼，LY2157299，索拉非尼，倫伐替尼，瑞戈非尼，卡博替尼，安羅替尼，阿帕替尼和吉非替尼1mg（精確到0.01mg)，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別配制成替萬替尼，LY2157299，索拉非尼，倫伐替尼，瑞戈非尼，卡博替尼，安羅替尼，阿帕替尼和吉非替尼的儲備溶液，于-20℃保存至分析。5.1.11標準中間溶液的配制：取500μL標準儲備溶液（5.1.10）至50mL量瓶中，加甲醇稀釋，混勻，得到1μg/mL的標準中間溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.12內標儲備液的配制：稱取1mg（精確到0.01mg)普萘洛爾，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到0.1mg/mL的內標儲備液，于-20℃保存至分析。5.1.130.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液：準確移取甲酸1.0mL置于1L量瓶中，用水定容，混勻。6儀器設備6.1液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）。6.2氮吹濃縮儀。6.3渦旋震蕩儀。6.4電子分析天平（精度0.01mg)。6.5高速冷凍離心機（最高轉速22000rpm）。7試樣制備全部尿液樣本充分混勻后，在4℃、3000r/min條件下離心10min，取管內上清液分裝，-80℃儲存待測。3T/HBIQA0004—20248試驗步驟8.1試樣預處理取200μL尿液試樣（7）加入5mL離心管中，加入1.5mL乙腈進行提取，并渦旋混勻30s。然后，分別加入350mgMgSO4和40mgPSA進行鹽析和凈化。渦旋30s后，12000r/min離心10min，取上清液1mL，經0.22μm微孔膜過濾后移入離心管，室溫下氮氣吹干，加入200μL含有內標的甲醇溶液作為復溶溶劑，待測定。8.2標準曲線取相應的空白樣品，按照7步驟進行處理，用得到的空白樣品提取液，將混合標準儲備溶液逐級稀釋，得到倫伐替尼，索拉非尼，卡博替尼，阿帕替尼，吉非替尼，瑞戈拉非尼，安羅替尼：0.1、0.2、0.5、1、2、5、8和10ng/mL；替萬替尼和LY2157299：1、2、3、10、20、50、80和100ng/mL的系列混合標準工作溶液（內標普萘洛爾的濃度為100ng/mL），濃度由低到高進行檢測，以分析物與內標定量離子的峰面積比值對質量濃度作圖，做出內標標準曲線回歸方程。8.3儀器參考條件8.3.1液相色譜參考條件a.色譜柱：HypersilGOLDVANQUISHC18（100×2.1μm，1.9μm或相當者。b.流動相：A相為乙腈；B相為0.1%甲酸水溶液。c.柱溫：40℃。d.進樣體積：5μL。e.流速：0.3mL/min。梯度洗脫程序見表1：表1梯度程序洗脫表時間/min流動相A/%流動相B/%00.52955695578970308.3.2質譜參考條件a.電離方式：電噴霧電離，正離子掃描模式。b.電噴霧電壓：3500V。4T/HBIQA0004—2024c.鞘氣流速；45Arb。d.輔助氣流速：10Arb。e.離子傳輸溫度：325℃。f.霧化溫度：350℃。e.碰撞氣：氬氣。其他質譜條件見附錄A。8.4測定8.4.1測定步驟將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質譜儀中，得到9種酪氨酸酶類藥物的質譜響應值，根據(jù)標準曲線得到待測液中9種酪氨酸酶類藥物的濃度。樣品溶液中各組分的響應值應在標準曲線的線性范圍內，超過線性范圍則應稀釋后再進樣測定（內標物根據(jù)測定結果，添加與稀釋倍數(shù)相同倍數(shù)的內標量，開展前處理實驗，稀釋后再進樣分析）。8.4.2定性判定在相同條件測定樣品溶液和標準溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時間與標準溶液中的某種組分峰的保留時間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對子離子的質荷比一致，樣品溶液中定性離子相對豐度與濃度相當標準工作溶液中定性離子的相對豐度進行比較時，相對偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在該組分。9種酪氨酸激酶標準物質的色譜圖參見附錄B。表2定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度>50%>20%~50%>10%~20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%8.4.3數(shù)據(jù)計算尿液樣本中各藥物濃度含量為：式中:Xi——試樣中待測組分含量，單位為納克每毫升(ng/mL)；5T/HBIQA0004—2024ρi——由標準曲線得出的測試液中某種組分的質量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；V定容——定容體積，單位為毫升(mL)；K——稀釋倍數(shù)；V試樣——試樣體積，單位為毫升(mL)。8.5空白試驗取空白尿樣，按8.1-8.4測定步驟進行。8.6定量限和重復性8.6.1方法定量限本方法索拉非尼的定量限為0.02ng/mL，卡博替尼的定量限為0.04ng/mL，吉非替尼的定量限為0.01ng/mL，瑞戈非尼的定量限為0.01ng/mL，安羅替尼的定量限為0.04ng/mL，替萬替尼的定量限為0.4ng/mL，LY2157299的定量限為0.2ng/mL，倫伐替尼的定量限為0.04ng/mL，阿帕替尼的定量限為0.02ng/mL。8.6.2重復性在重復性實驗條件下獲得兩次獨立實驗結果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的15%。6T/HBIQA0004—2024（資料性附錄）多反應監(jiān)測質譜參數(shù)表A.1目標物的質譜參數(shù)及參考保留時間化合物母離子(m/z)子離子(m/z)碎裂電壓(V)碰撞電壓(eV)參考保留時間(min)倫伐替尼427.1370.1a/312.027/432.80索拉非尼465.1252.1a/270.133/243.67卡博替尼502.2323.1a/297.137/353.10瑞戈非尼483.1270.1a/288.133/243.72阿帕替尼398.2212.1a/184.126/373.03吉非替尼447.17524/472.74安羅替尼408.2339.1a