臨床微生物檢驗(yàn)-臨床標(biāo)本檢驗(yàn)

臨床標(biāo)本微生物學(xué)檢驗(yàn)

腦脊液標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)學(xué)習(xí)目標(biāo)１熟悉腦脊液標(biāo)本中常見(jiàn)的病原體

２熟悉腦脊液標(biāo)本采集３掌握腦脊液標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)X脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)正常人的腦脊液是無(wú)菌的。一旦感染，病情危急。一、腦脊液中常見(jiàn)病原體臨床上最常見(jiàn)的1．細(xì)菌性腦膜炎以結(jié)核性腦膜炎最為常見(jiàn)，肺炎球菌腦膜炎、流感嗜血桿菌腦膜炎及其他革蘭陰性桿菌腦膜炎均可發(fā)生。2．真菌性腦膜炎最常見(jiàn)隱球性腦膜炎。3．病毒性腦膜炎乙腦病毒、腸道病毒。腦脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)?zāi)X脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)二、標(biāo)本采集1.標(biāo)本采集多由臨床醫(yī)生采集，以70%酒精或2%碘酊消毒背部下方，并麻醉之；然后以一特制通管針，輕輕的由第三與第四腰椎間的中線部位穿刺入脊髓蛛網(wǎng)膜采集約3～5ml腦脊液于3支無(wú)菌試管中，每支試管至少1～2ml；然后馬上將第2支（或第1支）送至實(shí)驗(yàn)室。做腦脊液培養(yǎng)時(shí)，建議同時(shí)做血培養(yǎng)。腰穿時(shí)必須作徹底消毒和無(wú)菌操作。2.標(biāo)本的運(yùn)送常溫立即送檢，實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后應(yīng)立即接種。腦脊液標(biāo)本送檢的理想時(shí)間為15分鐘內(nèi)，半小時(shí)送檢是可接受的，如果送檢時(shí)間超過(guò)1小時(shí)，則會(huì)影響結(jié)果，在結(jié)果報(bào)告時(shí)，在備注處注明此情況。如不能及時(shí)送檢，可使用血培養(yǎng)瓶（懷疑腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌感染時(shí)，請(qǐng)勿使用血培養(yǎng)瓶）腦脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)（一）檢驗(yàn)程序腦脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)三、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)（一）檢驗(yàn)程序三、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)?zāi)X脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)操作流程腦脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)（二）檢驗(yàn)方法

（1）一般細(xì)菌涂片鏡檢：取沉淀物涂片，革蘭染色鏡檢，可初步報(bào)告。1.涂片鏡檢

混濁或膿性腦脊液可直接涂片，染色鏡檢。無(wú)色透明的腦脊液應(yīng)以3000r/m離心10～15分鐘，根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牡牟煌扇〔煌娜旧椒ㄧR檢。

腦脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)（二）檢驗(yàn)方法（2）結(jié)核分枝桿菌檢查：腦脊液表面如形成纖維網(wǎng)，疑為結(jié)核分枝桿菌，以4000r/min離心30分鐘，取沉淀物做涂片，抗酸染色鏡檢，可初步報(bào)告。腦脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)（二）檢驗(yàn)方法（3）新型隱球菌檢查：取沉淀物涂片，墨汁染色鏡檢，可初步報(bào)告。2.分離培養(yǎng)與鑒定腦脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)（1）一般細(xì)菌培養(yǎng)：取標(biāo)本分區(qū)劃線接種于血平板和巧克力平板上，置35℃CO2培養(yǎng)18～24h。根據(jù)菌落特征和形態(tài)染色，進(jìn)一步做生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，同時(shí)做AST。

（2）結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)：疑結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，取腦脊液接種于羅-琴或米氏7H-10培養(yǎng)基，斜置于35℃培養(yǎng)7天后直立，繼續(xù)孵育至1個(gè)月，有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)菌落進(jìn)行鑒定。腦脊液標(biāo)本的檢驗(yàn)（3）真菌培養(yǎng)：疑真菌感染時(shí)，用血平板或沙保弱培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，分別置22℃及35℃培養(yǎng)，有菌落生長(zhǎng)進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

3.結(jié)果報(bào)告一旦發(fā)現(xiàn)病原體，立即報(bào)告臨床醫(yī)生。增菌培養(yǎng)過(guò)程中有菌生長(zhǎng)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行涂片、革蘭染色、鏡檢，及時(shí)報(bào)告細(xì)菌種類（一級(jí)報(bào)告）。如有細(xì)菌生長(zhǎng)，增菌液直接進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，爭(zhēng)取短時(shí)間報(bào)告（二級(jí)報(bào)告）。建立危急值報(bào)告制度，按照危急值報(bào)告程序報(bào)告和登記制度進(jìn)行登記。臨床標(biāo)本微生物學(xué)檢驗(yàn)

膿液標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)

學(xué)習(xí)目標(biāo)１熟悉膿液標(biāo)本中常見(jiàn)的病原體

２熟悉膿液標(biāo)本采集３掌握膿液標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)撘褐谐Ｒ?jiàn)病原體細(xì)菌種類革蘭陽(yáng)性菌革蘭陰性菌球菌金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、腸球菌、消化鏈球菌、四聯(lián)球菌肺炎克雷白桿菌、變形桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、卡他布蘭漢菌桿菌結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、炭疽芽胞桿菌大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、擬桿菌、梭桿菌其他放線菌（衣氏放線菌、諾卡菌）標(biāo)本采集開(kāi)放性膿腫：先用無(wú)菌NS清洗表面，再用無(wú)菌棉拭子采取病灶深部的膿液及分泌物。閉鎖性膿腫：選用2.5％碘酊或75％酒精消毒周?chē)つw，再用注射器穿刺抽取采集。如果沒(méi)有得到抽吸物，也可以用拭子在傷口深部采集滲出物。創(chuàng)面分泌物：大面積燒傷可用無(wú)菌棉拭子采集多部位創(chuàng)面分泌物，或?qū)⒄从心撘旱淖顑?nèi)層敷料放入無(wú)菌容器送檢。厭氧菌感染的膿液：常有腐臭，最好用注射器穿刺抽取采集。特別要注意避免正常菌群污染以及由采集至接種前盡量避免接觸空氣。細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)程序找到G+c/G-b細(xì)菌檢出**菌或48h無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)臨床意義由創(chuàng)傷、手術(shù)、侵入性器械操作等外科治療引起的感染最為常見(jiàn)。細(xì)菌造成傷口感染一般認(rèn)為需每克組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量在105～106個(gè)以上。外傷性創(chuàng)傷感染以葡萄球菌和鏈球菌多見(jiàn)，且易發(fā)生混合感染。燒傷創(chuàng)面最常見(jiàn)革蘭陰性桿菌感染，如銅綠假單胞菌等，其次為革蘭陽(yáng)性球菌感染，可單獨(dú)也可混合細(xì)菌感染。急性化膿性骨關(guān)節(jié)炎常由金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌感染所致。放線菌感染可發(fā)生在免疫功能下降時(shí)或由于拔牙、口腔黏膜損傷時(shí)。臨床標(biāo)本微生物學(xué)檢驗(yàn)

尿液標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)

學(xué)習(xí)目標(biāo)１熟悉尿液標(biāo)本中常見(jiàn)的病原體

２熟悉尿液標(biāo)本采集３掌握尿標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)蛞簶?biāo)本的檢驗(yàn)正常人體膀胱中的尿液是無(wú)菌的。當(dāng)尿液從尿道口排出，受到尿道中的正常菌群污染而混有細(xì)菌，但中段尿中細(xì)菌數(shù)不會(huì)超過(guò)104cfu/ml。尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)

尿液中的細(xì)菌數(shù)超過(guò)104~

105cfu/ml。尿路感染每年850萬(wàn)例尿路感染，90%為女性。1/2.5個(gè)婦女在一生中會(huì)得UTI。下行性感染：血流腎臟膀胱（金黃色葡萄球菌，酵母菌，結(jié)核分枝桿菌）。上行性感染：尿道膀胱腎盂血流。尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)一、尿路感染常見(jiàn)病原菌尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)二、標(biāo)本采集

1.標(biāo)本采集（1）中段尿：晨起清潔后中段尿標(biāo)本10～20ml于無(wú)菌容器中，加蓋立即送檢。（2）導(dǎo)尿采集法（3）膀胱穿刺法：厭氧菌（4）24h尿收集法：結(jié)核分枝桿菌

2.標(biāo)本運(yùn)送尿液標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢、及時(shí)接種，室溫下保存不得超過(guò)2h。尿液運(yùn)輸方法無(wú)需冷藏尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)?zāi)蛞簶?biāo)本的檢驗(yàn)（一）檢驗(yàn)程序三、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)（一）檢驗(yàn)程序三、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)（一）檢驗(yàn)程序三、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)?zāi)蛞簶?biāo)本的檢驗(yàn)（二）檢驗(yàn)方法1.涂片鏡檢以3000r/m離心30分鐘，取沉淀物涂片，根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牡牟煌扇〔煌娜旧椒ㄧR檢。尿液革蘭染色-革蘭陰性桿菌尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)（1）一般細(xì)菌及淋病奈瑟菌：革蘭染色鏡檢。（2）念珠菌：濕片鏡檢，亦可革蘭染色鏡檢。（3）結(jié)核分枝桿菌：抗酸染色鏡檢。尿液篩查試驗(yàn)?zāi)蛞簶?biāo)本的檢驗(yàn)2.分離培養(yǎng)與鑒定（1）一般細(xì)菌培養(yǎng)：取標(biāo)本分區(qū)劃線接種于血平板和麥康凱平板上，35℃培養(yǎng)18～24h。根據(jù)菌落特征和形態(tài)染色，進(jìn)一步做生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，同時(shí)做AST。

（2）奈瑟菌培養(yǎng)：疑淋病奈瑟感染時(shí)，取標(biāo)本接種于含藥巧克力平板上，置35℃5%~10%CO2培養(yǎng)24~48h。根據(jù)菌落特征、形態(tài)染色、生化試驗(yàn)等進(jìn)行淋病奈瑟菌鑒定。

尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)

（4）厭氧菌培養(yǎng)：疑為厭氧菌感染時(shí)，取標(biāo)本接種于厭氧培養(yǎng)基，按厭氧菌檢驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定。

（3）真菌培養(yǎng)：疑為真菌感染時(shí)，取標(biāo)本接種于沙保弱培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，按真菌檢驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定。

（5）結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)：疑結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，取標(biāo)本接種于羅-琴或米氏7H-10培養(yǎng)基，按結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定。尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)傳統(tǒng)的尿培養(yǎng)使用校準(zhǔn)過(guò)的接種環(huán)（0.001or0.01ml）垂直插入裝有尿液的無(wú)菌容器中在瓊脂平板上分區(qū)劃線：血平皿，麥康凱平皿或CLED平皿（胱氨酸乳糖無(wú)電解質(zhì)培養(yǎng)基）。大多數(shù)尿路病原菌能在血平皿上生長(zhǎng)。麥康凱平皿有鑒別功能，為革蘭陰性桿菌的選擇性培養(yǎng)基。血平皿麥康凱平皿尿培養(yǎng)的劃線方式第一區(qū)=50,000cfu/ml第二區(qū)=75,000cfu/ml第三區(qū)=100,000cfu/ml沿中心線向下=50,000cfu/ml長(zhǎng)向邊緣=100,000cfu/ml尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)?zāi)蛞簶?biāo)本的檢驗(yàn)2.尿液細(xì)菌計(jì)數(shù)—菌落計(jì)數(shù)的意義正常尿道口有細(xì)菌存在尿液容易受少量細(xì)菌污染＜104cfu/ml尿路感染時(shí)細(xì)菌數(shù)量巨大＞105cfu/ml菌落計(jì)數(shù)＞104cfu/ml、＜105cfu/ml建議：重復(fù)檢查影響計(jì)數(shù)的原因已用抗生素治療；使用利尿藥物；尿頻，尿液在膀胱中停留時(shí)間短；細(xì)菌種類：平板上有三種或三種以上細(xì)菌生長(zhǎng)，判為標(biāo)本污染，不必計(jì)數(shù)。尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)變形桿菌生長(zhǎng)不能計(jì)數(shù)，應(yīng)改用CLED或MacConkey平板

尿液標(biāo)本的檢驗(yàn)3.報(bào)告方式培養(yǎng)48h無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，報(bào)告“2天無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)”。查見(jiàn)細(xì)菌，報(bào)告菌名及其菌落計(jì)數(shù)（菌落數(shù)/ml）和藥敏結(jié)果。臨床標(biāo)本微生物學(xué)檢驗(yàn)

糞便標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)

學(xué)習(xí)目標(biāo)１熟悉糞便標(biāo)本中常見(jiàn)的病原體

２熟悉糞便標(biāo)本采集３掌握糞便標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)胃腸道正常菌群糞便標(biāo)本中常見(jiàn)的病原體糞便標(biāo)本中常見(jiàn)的病原體(續(xù))腸毒素為主的病原菌侵襲性為主的病原菌病毒霍亂弧菌、志賀菌（福氏、宋內(nèi)）、大腸埃希菌（ETEC、EHEC、EAEC）、金黃色葡萄球菌、難難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌沙門(mén)菌、大腸埃希菌（EPEC、EIEC）、志賀菌（鮑氏、志賀）、彎曲菌、副溶血弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、結(jié)核分枝桿菌、白假絲酵母菌輪狀病毒、?？刹《尽orwolk病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、腺病毒學(xué)習(xí)目標(biāo)１熟悉糞便標(biāo)本中常見(jiàn)的病原體

２熟悉糞便標(biāo)本采集３掌握糞便標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)2、標(biāo)本采集與運(yùn)送自然排便法：用藥前自然排便，采集膿血、黏液部分2～3g，外觀無(wú)異常的糞便應(yīng)從糞便的表面不同部位取材，液體便取絮狀物1～2ml,置無(wú)菌容器內(nèi)送檢。直腸拭子法：如排便困難或嬰幼兒患者，可用此法采集標(biāo)本。對(duì)住院的腹瀉成人患者，應(yīng)采集住院3日內(nèi)糞便標(biāo)本送檢。標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送檢，如不能立即送檢，提倡使用Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基或pH7.0PBS甘油緩沖液運(yùn)送和保存。檢驗(yàn)方法--涂片鏡檢：霍亂弧菌檢查染色鏡檢動(dòng)力試驗(yàn)制動(dòng)試驗(yàn)酵母菌檢查檢驗(yàn)方法--涂片鏡檢：糞便優(yōu)勢(shì)菌檢查糞便涂片查菌群報(bào)告單內(nèi)容描述正常參考值細(xì)菌總數(shù)約300500-5000/油鏡革蘭陽(yáng)性桿：革蘭陰性桿：革蘭陽(yáng)性球：革蘭陰性球：10：40：45：5革蘭陽(yáng)性桿：50.2-74%革蘭陰性桿：35.29-44%革蘭陽(yáng)性球：2-10%革蘭陰性球：0.5-5%優(yōu)勢(shì)菌革蘭陽(yáng)性球菌及酵母樣菌革蘭陽(yáng)性桿菌其他（特征菌變化酵母樣菌明顯增多印象診斷：Ⅲ度腸道菌群失調(diào)改變細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)-分離培養(yǎng)與鑒定沙門(mén)菌及志賀菌培養(yǎng)霍亂弧菌培養(yǎng)副溶血弧菌培養(yǎng)致病性大腸埃細(xì)菌培養(yǎng)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌培養(yǎng)空腸彎曲菌培養(yǎng)艱難梭菌培養(yǎng)真菌培養(yǎng)糞便標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法和操作流程1、沙門(mén)菌及志賀菌分離培養(yǎng)與鑒定直接劃線接種于腸道選擇性培養(yǎng)基；用接種針挑選不發(fā)酵乳糖菌落，分別接種于三糖鐵瓊脂（KIA)和尿素-動(dòng)力-靛基質(zhì)培養(yǎng)基；生化反應(yīng)，A-F多價(jià)“O”血清或因子血清進(jìn)行鑒定。沙門(mén)菌培養(yǎng)與鑒定沙門(mén)菌分離培養(yǎng)與鑒定沙門(mén)菌血清凝集試驗(yàn)多價(jià)O抗血清(A-F)；O抗血清；H因子血清；注意事項(xiàng)：與多價(jià)抗血清不凝集時(shí)，可在玻璃試管內(nèi)用NS將細(xì)菌制成濃菌液，放入沸水中加熱15-30分鐘，以破壞菌體表面Vｉ抗原，冷卻后再做凝集試驗(yàn)。如僅出現(xiàn)單相H，需用位相分離方法誘導(dǎo)出另一相抗原后再進(jìn)行檢查。志賀菌分離培養(yǎng)與鑒定志賀菌分離培養(yǎng)與鑒定初步鑒定：可疑菌落：EMB無(wú)色或不透明的琥珀色；MAC上無(wú)色不透明；SS上不透明或透明；XLD上呈紅色?；旧磻?yīng)：TSIA：產(chǎn)酸／產(chǎn)氣，枸櫞酸鹽-，脲酶-，動(dòng)力-，VP-最終鑒定：全面生化反應(yīng)血清學(xué)試驗(yàn)志賀菌分離培養(yǎng)與鑒定定群：４種多價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn)；定型：分型：3、霍亂弧菌分離培養(yǎng)與鑒定霍亂弧菌是烈性傳染病，凡在流行季節(jié)和地區(qū)有腹瀉癥狀的患者均應(yīng)快速準(zhǔn)確地作出病原學(xué)診斷。可取”米泔水”樣便，或采取嘔吐物或其它標(biāo)本進(jìn)行檢查；采取的標(biāo)本最好就地接種堿性胨水增菌；不能及時(shí)接種者可用棉拭子挑取標(biāo)本或?qū)⒏亻T(mén)拭子直接插入卡－布運(yùn)送培養(yǎng)基中；送檢標(biāo)本應(yīng)密封，專人運(yùn)送。3、霍亂弧菌分離培養(yǎng)與鑒定霍亂弧菌分離培養(yǎng)與鑒定涂片染色鏡檢：動(dòng)力和制動(dòng)試驗(yàn)：熒光抗體染色：霍亂毒素(CT)測(cè)定：改良ELISA：以GM1包被，捕獲標(biāo)本中的CT．乳膠凝集法測(cè)定CTPCR法分離、培養(yǎng)與鑒定堿性胨水增菌轉(zhuǎn)種TCBS平板＼４號(hào)瓊脂平板或慶大霉素瓊脂平板初步鑒定：TCBS平板－黃色菌落４號(hào)瓊脂平板或慶大霉素瓊脂平板－灰褐色菌落O1群和O139群多價(jià)和單價(jià)血清凝集試驗(yàn)最后鑒定：全面生化試驗(yàn)+血清學(xué)分群、分型大腸埃希菌分離培養(yǎng)與鑒定致病性大腸埃希菌的腸道感染菌株侵襲部位疾病與癥狀致病機(jī)制ETEC小腸旅行者腹瀉、嬰幼兒腹瀉、水樣便、腹痛等LT、STEPEC小腸嬰幼兒腹瀉、水樣便發(fā)熱、嘔吐病菌黏附、破壞細(xì)胞EIEC結(jié)腸志賀樣腹瀉，膿血便黏附、內(nèi)毒素破壞細(xì)胞EHEC結(jié)腸出血性結(jié)腸炎等志賀樣毒素(VERO毒素)EAEC小腸嬰兒腹瀉、水樣便、脫水黏附、毒素致病性大腸埃希菌的鑒定ETEC：生化反應(yīng)+血清分型+腸毒素(ST\LT)測(cè)定EPEC：生化反應(yīng)+血清分型(O\H)EIEC：生化反應(yīng)+血清分型(O\H)+豚鼠眼角膜毒力測(cè)定多數(shù)EIEC動(dòng)力-，乳糖不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵EHEC：生化反應(yīng)+血清分型O157:H7不發(fā)酵(或遲緩)山梨醇，可用SMAC直接篩選不發(fā)酵山梨醇的菌落。臨床意義細(xì)菌性痢疾

簡(jiǎn)稱菌痢，主要是指由志賀菌引起的腸道傳染病，是腸道感染性腹瀉最常見(jiàn)的病種。細(xì)菌、真菌、病毒引起的胃腸炎此癥最為常見(jiàn)，由多種病原體感染所致，臨床常表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、高熱等癥狀。胃腸炎的病毒感染常見(jiàn)于輪狀病毒等，常引起幼兒腹瀉。細(xì)菌性食物中毒

?？晌＜吧?，常見(jiàn)于沙門(mén)菌、副溶血弧菌、致病性大腸埃希菌、葡萄球菌、肉毒梭菌、臘樣芽胞桿菌食物中毒。多發(fā)生在夏秋季，以暴發(fā)和集體發(fā)病為特征，是一種嚴(yán)重的病癥。臨床意義致病性大腸埃希菌的腸道感染菌株侵襲部位疾病與癥狀致病機(jī)制ETEC小腸旅行者腹瀉、嬰幼兒腹瀉、水樣便、腹痛等LT、STEPEC小腸嬰幼兒腹瀉、水樣便發(fā)熱、嘔吐病菌黏附、破壞細(xì)胞EIEC結(jié)腸志賀樣腹瀉，膿血便黏附、內(nèi)毒素破壞細(xì)胞EHEC結(jié)腸出血性結(jié)腸炎等志賀樣毒素(VERO毒素)EAEC小腸嬰兒腹瀉、水樣便、脫水黏附、毒素臨床標(biāo)本微生物學(xué)檢驗(yàn)

痰液標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)

學(xué)習(xí)目標(biāo)１熟悉痰液標(biāo)本中常見(jiàn)的病原體

２熟悉痰液標(biāo)本采集３掌握痰液標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)正常人體下呼吸道是無(wú)菌的，但上呼吸道有正常菌群寄居，下呼吸道分泌物（俗稱痰）通過(guò)上呼吸道排出時(shí)會(huì)受到正常菌群的污染。經(jīng)口腔咳出的痰帶有多種上呼吸道的正常寄生菌（如草綠色鏈球菌）。若從患者痰標(biāo)本中查見(jiàn)致病菌或條件致病菌，提示有呼吸道感染。

一、痰液標(biāo)本的常見(jiàn)細(xì)菌革蘭陽(yáng)性細(xì)菌化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌白喉棒狀桿菌、結(jié)核分支桿菌厭氧菌、放線菌、奴卡菌痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)革蘭陰性細(xì)菌腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌二、標(biāo)本采集（1）自然咳痰法：冷開(kāi)水漱口清洗咽喉，咳出痰，置于無(wú)菌容器。無(wú)痰或痰量極少者可用3%～5%氯化鈉5ml霧化5分鐘進(jìn)行導(dǎo)痰。痰標(biāo)本于2h內(nèi)送到并接種。痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)

1.采集方法采集晨痰為最佳。需避免上呼吸道正常菌群的污染。（2）氣管鏡下采集（3）氣管或環(huán)甲膜穿刺痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)

2.標(biāo)本運(yùn)送與保存痰液標(biāo)本采集后立即送檢，做結(jié)核分枝桿菌和真菌培養(yǎng)時(shí)，標(biāo)本不能及時(shí)送檢時(shí)，可置4℃保存。痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)（一）檢驗(yàn)程序三、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)（二）檢驗(yàn)方法1.涂片鏡檢不合格痰液標(biāo)本大量鱗狀上皮細(xì)胞未見(jiàn)吞噬細(xì)胞合格痰液標(biāo)本大量吞噬細(xì)胞未見(jiàn)鱗狀上皮細(xì)胞涂片檢查其一依據(jù)100×鏡下觀察白細(xì)胞和上皮細(xì)胞數(shù)目多少來(lái)評(píng)定(如表)；其二是初步判定是否有病原存在。分級(jí)白細(xì)胞（個(gè)）上皮細(xì)胞（個(gè)）A>25<10B>25<25C<10>25痰標(biāo)本鏡下分類注：A、B兩種情況的痰標(biāo)本適合做培養(yǎng)，C不合適，應(yīng)重新留標(biāo)本。痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)有意義的細(xì)菌濃度值（CFU/ml）標(biāo)本有意義的濃度CFU/ml自然咳痰107誘導(dǎo)痰不確定氣管內(nèi)吸取物106支氣管肺泡灌洗液104保護(hù)性毛刷103支氣管灌洗液不做培養(yǎng)痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)2.分離培養(yǎng)與鑒定（1）痰標(biāo)本培養(yǎng)前處理：用無(wú)菌鹽水將痰洗滌3次，加入等量的1%胰酶溶液（PH7.6)，37oC水浴90min，使痰液均質(zhì)化后備用。（2）普通細(xì)菌的培養(yǎng)：將洗凈的痰標(biāo)本接種于血平板、巧克力平板、麥康凱平板，置35℃培養(yǎng)18～24h，根據(jù)菌落特征和形態(tài)染色，進(jìn)一步做生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，同時(shí)做AST。

痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)2.分離培養(yǎng)與鑒定（3）結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)：將處理后的標(biāo)本接種于改良羅氏培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)，于第1周觀察2次，以后每周1次，觀察菌落出現(xiàn)的時(shí)間與特征，按結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)進(jìn)行鑒定。（4）厭氧菌的培養(yǎng)：將標(biāo)本接種于厭氧培養(yǎng)基上，在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)后對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)（5）嗜肺軍團(tuán)菌的培養(yǎng)：將均質(zhì)化的痰標(biāo)本接種于血平板、巧克力平板和BCYE平板，置35℃5%～10%CO2培養(yǎng)48h。根據(jù)血平板、巧克力平板不生長(zhǎng)、BCYE平板上的菌落特征、形態(tài)染色、生化試驗(yàn)等進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌鑒定。2.分離培養(yǎng)與鑒定氣管內(nèi)吸取物加等量的N-乙酰-L-半胱氨酸或溶痰劑漩渦震蕩30s加0.01ml標(biāo)本至1.0ml的TSB每個(gè)平板涂0.01ml血平皿巧克力平皿麥康凱平皿1：100稀釋1：2稀釋生長(zhǎng)出>50個(gè)菌落痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)支氣管肺泡灌洗液將所有標(biāo)本裝入50ml離心管內(nèi)離心20min，混勻10ml沉淀液，漩渦震蕩30s每個(gè)平板涂0.01ml血平皿巧克力平皿麥康凱平皿Usepipette.用吸管吸取0.1ml至1mlTSB（1：10稀釋）生長(zhǎng)出>10個(gè)菌落制作涂片（細(xì)胞離心)痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)保護(hù)性毛刷將毛刷置于1ml稀釋液中震蕩30s每個(gè)平板涂0.01ml血平皿巧克力平皿麥康凱平皿生長(zhǎng)出>10個(gè)菌落UsePRASifanaerobic若懷疑厭氧菌則使用PRAS制作涂片（細(xì)胞離心)痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)菌落半定量判斷標(biāo)準(zhǔn)1+：原始區(qū)＜10個(gè)菌落2+：原始區(qū)＞10個(gè)菌落，第二區(qū)＜

5個(gè)菌落3+：原始區(qū)＞

10個(gè)菌落，第二區(qū)＞

5個(gè)菌落，第三區(qū)＜

5個(gè)菌落4+：原始區(qū)＞

10個(gè)菌落，第二區(qū)＞

5個(gè)菌落，第三區(qū)＞

5個(gè)菌落，第四區(qū)＞

5個(gè)菌落優(yōu)勢(shì)菌定義為3+或4+以上痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)痰液標(biāo)本的檢驗(yàn)3.結(jié)果報(bào)告草綠色鏈球菌、表皮葡萄球菌、類白喉?xiàng)U菌和奈瑟球菌可報(bào)告為“正常菌群”。查出的致病菌，報(bào)告菌名和藥敏結(jié)果，同時(shí)報(bào)告細(xì)菌的量化指標(biāo)。臨床標(biāo)本微生物學(xué)檢驗(yàn)

血液及骨髓液標(biāo)本微生物學(xué)檢驗(yàn)

學(xué)習(xí)目標(biāo)１熟悉血液及骨髓液標(biāo)本中常見(jiàn)的病原體

２熟悉血液及骨髓液標(biāo)本采集３掌握血液及骨髓液標(biāo)本微生物學(xué)檢驗(yàn)正常人的血液和骨髓是無(wú)菌的。血液標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)是診斷菌血癥、敗血癥或膿毒血癥的基本方法。如從患者血液中檢出細(xì)菌，一般應(yīng)視為病原菌。血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)一、常見(jiàn)的菌血癥或膿毒血癥1．葡萄球菌菌血癥2．腸球菌菌血癥3．革蘭陰性桿菌菌血癥4．厭氧菌菌血癥5．真菌菌血癥血培養(yǎng)的臨床重要性診斷重要性陽(yáng)性的血培養(yǎng)結(jié)果，不僅能確定證實(shí)病人的疾病是由于感染病原菌引起，更重要的是還可以提供病原菌對(duì)抗菌藥物的敏感性結(jié)果，從而優(yōu)化抗感染治療。預(yù)后重要性血培養(yǎng)中一個(gè)臨床重要的病原菌，表明宿主原發(fā)感染部位的抵抗力下降，機(jī)體不能清除病原菌或根除感染灶。從血液中培養(yǎng)得到病原菌的種類，同樣也對(duì)預(yù)后有重要的意義。CLSIM47A-Principleandproceduresforbloodcultures血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)陽(yáng)性的血培養(yǎng)報(bào)告應(yīng)被視為潛在的醫(yī)療緊急狀態(tài)（危急值）。發(fā)展為敗血癥的比率高達(dá)40%～90%。

血培養(yǎng)陽(yáng)性的患者應(yīng)盡可能快地給予其適當(dāng)?shù)目垢腥局委?。?xì)菌血癥和真菌血癥

--直接威脅患者生命的感染性疾病血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)二、標(biāo)本采集血培養(yǎng)采集指征發(fā)熱（≥38oC）或低溫（≤36oC）寒戰(zhàn)白細(xì)胞增多（計(jì)數(shù)>10，000

109/L，特別有“核左移”現(xiàn)象出現(xiàn)，即可見(jiàn)未成熟的白細(xì)胞或桿狀核白細(xì)胞）血液病患者出現(xiàn)粒細(xì)胞減少（成熟的多形核白細(xì)胞<1000

109/L）血小板減少血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)皮膚粘膜出血血壓降低昏迷多器官衰竭呼吸加快降鈣素原升高（PCT）C反應(yīng)蛋白升高（CRP）血培養(yǎng)采集指征1.采集時(shí)間

chillsBlooodculture寒戰(zhàn)或發(fā)熱初期采集。超過(guò)發(fā)熱峰值后，病原菌的檢出率會(huì)隨之降低。CLSIM47A-Principleandproceduresforbloodcultures血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)每次采集2～3套標(biāo)本，每套應(yīng)包括一個(gè)需養(yǎng)培養(yǎng)瓶和一個(gè)厭養(yǎng)培養(yǎng)瓶一個(gè)靜脈穿刺點(diǎn)只能采集一套血培養(yǎng)，采集第二套血培養(yǎng)應(yīng)該選擇第2個(gè)靜脈穿刺點(diǎn)成人病人決不能只采集1瓶血培養(yǎng)標(biāo)本，采血量不足和只做1套血培養(yǎng)所得結(jié)果是不易正確解釋的2.采血套數(shù)及血量CLSIM47A-Principleandproceduresforbloodcultures

（1）血培養(yǎng)采集套數(shù)：同時(shí)從不同部位采集2～3套。注意：1“套”是指一次靜脈穿刺盡可能短時(shí)間內(nèi)采集2～3套。此后的2～5天內(nèi)不必重復(fù)采集。CLSIM47A-Principleandproceduresforbloodcultures血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)血培養(yǎng)采集套數(shù)例外：感染性心內(nèi)膜炎：持續(xù)性菌血癥間隔30～60分，連續(xù)采集3套；監(jiān)測(cè)24小時(shí)，如陰性，則再采集2套。

血培養(yǎng)結(jié)果對(duì)診斷和治療感染性心內(nèi)膜炎的患者至關(guān)重要。

Bacillussubtilis

血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)每次采集血培養(yǎng)的間隔時(shí)間？每份血培養(yǎng)間隔應(yīng)不超過(guò)5分鐘，因?yàn)榫W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)于一過(guò)性菌血癥和間歇性菌血癥在15～30分鐘內(nèi)可清除（CLSI規(guī)定每份血培養(yǎng)應(yīng)同時(shí)獲得，或盡可能短的時(shí)間內(nèi)）。對(duì)懷疑亞急性感染性心內(nèi)膜炎，間隔1小時(shí)，連續(xù)采集3份血培養(yǎng)。血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)（2）采集血量成人患者，每套采集20～30ml（病原菌的陽(yáng)性培養(yǎng)率與血量成正比）。嬰幼兒患者，采血量不超過(guò)患者總血量的1％。

CLSIM47A-Principleandproceduresforbloodcultures血量分布

1個(gè)需氧瓶+1個(gè)厭氧瓶=1套

2個(gè)需氧瓶=1套無(wú)厭氧瓶時(shí)采血量不足，保證需氧瓶的量，剩余注厭氧瓶保證需氧瓶？厭氧菌感染較少使用厭氧瓶？需養(yǎng)和厭氧瓶搭配的培養(yǎng)可以培養(yǎng)出更多的葡萄球菌、鏈球菌、腸桿菌科細(xì)菌和厭氧菌。

CLSIM47A-Principleandproceduresforbloodcultures血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)3．采集方法無(wú)菌操作，肘靜脈采血。幾種常見(jiàn)皮膚消毒液乙醇、異丙醇（作用30s）葡糖酸氯已啶（作用30s）過(guò)氧化氫（作用30s）碘酊（作用30s）碘伏（作用1.5-2min）含有碘的消毒劑需要足夠的時(shí)間消毒表面皮膚消毒方法血培養(yǎng)瓶消毒：70％異丙醇（或酒精）消毒血培養(yǎng)瓶橡膠塞，自然干燥。

血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)皮膚消毒：先用70％異丙醇（或酒精）清潔，空氣中晾干，接著使用主要消毒劑并采用推薦的消毒時(shí)間＞2個(gè)月兒科患者：葡萄糖酸洗必泰＜2個(gè)月兒科患者：70％異丙醇*不管選擇哪種皮膚消毒劑，必須保證足夠的消毒時(shí)間CLSIM47A-Principleandproceduresforbloodcultures血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)（一）檢驗(yàn)程序三、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)與孵育7天相比，只有0.3%有臨床意義的陽(yáng)性血培養(yǎng)在5天內(nèi)不能檢出。因此設(shè)定5天為孵育周期是最為有效的（Huang,etal.,EuropeanJournalofClinicalMicrobiology17:637.1998）血液與骨髓標(biāo)本的檢驗(yàn)1.血培養(yǎng)瓶孵育儀器對(duì)于絕大