生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)三-血清γ-球蛋白的分離、純化及鑒定(七年制)2015

血清γ球蛋白的

分離純化李立勝【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．學(xué)習(xí)鹽析法、凝膠層析和離子交換層析等分離純化蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用2．了解蛋白質(zhì)分離純化的總體思路實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分離純化的重要意義蛋白質(zhì)分離純化的基本依據(jù)溶解度分子量等電點(diǎn)3分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析在分離純化時(shí)，根據(jù)情況選用幾種方法，相互配合才能達(dá)到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的。本次實(shí)驗(yàn)方法一、鹽析法粗分γ-球蛋白分離依據(jù)：溶解度二、凝膠過濾方法脫鹽分離依據(jù)：分子量三、離子交換層析方法純化γ-球蛋白分離依據(jù)：等電點(diǎn)5定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:

破壞蛋白質(zhì)兩個(gè)穩(wěn)定因素：

水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)不變性，常用。實(shí)驗(yàn)一、鹽析法鹽析法粗分γ-球蛋白分離依據(jù)：不同蛋白在高濃度中性鹽溶液中溶解度不同半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白溶解，球蛋白將沉淀析出7鹽析步驟取離心管一支加入血清2ml加入2ml0.9%氯化鈉搖勻邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和(NH4)2SO44ml上清液（主要含清蛋白）傾去靜置10min，再離心（5000轉(zhuǎn)/分）10min沉淀用1ml0.9%氯化鈉攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO42ml,搖勻靜置10min，再離心（5000轉(zhuǎn)/分）10min傾棄上清液（主要含α、β球蛋白）沉淀即為初步純化的γ－球蛋白加入0.0175mol/L磷酸緩沖液（pH=6.3)1ml溶解γ－球蛋白粗提液實(shí)驗(yàn)二、葡聚糖凝膠柱層析（P31）原理:按混合物各組分分子量大小不同隨流動(dòng)相經(jīng)過層析柱的時(shí)間不同而被分離的技術(shù)。9葡聚糖凝膠柱層析脫鹽

本試驗(yàn)采用葡聚糖凝膠——SephadexG25層析方法除去球蛋白粗提液中的鹽硫酸銨，以便下一步用離子交換層析方法進(jìn)一步提純球蛋白。▲SephadexG-25的準(zhǔn)備▲裝柱（15~20cm）操作步驟：1、層析柱保持垂直。2、放蒸餾水，排出空氣，關(guān)閉出口。3、加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液，靜止2分鐘，調(diào)節(jié)流速10滴/min，使凝膠均勻沉降，不斷補(bǔ)充，直至18cm。4、上留1-2mm的液體，關(guān)閉出口。

注意：★柱床面上要保持少許液體，防止膠床露出液面。

★膠面不平，用玻棒輕輕攪動(dòng)，讓凝膠自然沉降，使表面平整。▲加樣與洗脫1、加樣：用滴管將鹽析后樣品緩緩地加入柱床面，打開出口使樣品溶液滲入凝膠，并用少量洗脫液清洗。2、洗脫：緩緩地加入洗脫液，打開出口，保持流速10滴/min，收集洗脫液，每管收集15滴。注意柱床面不要干燥。3、檢測(cè)：20%璜基水楊酸溶液檢測(cè)洗脫液的蛋白質(zhì)，并用奈氏試劑檢測(cè)NH4+，保存含量高且無NH4+的進(jìn)一步純化▲凝膠的再生

不斷加洗脫液，使NH4+全部流出，為下次實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備脫鹽

12345678910②上樣γ－球蛋白，粗提液①裝柱葡聚糖凝膠G-25，柱高18-20cm流速：每分鐘10滴左右

③加入洗脫劑④收集15滴換一支試管▲層析后洗脫液檢測(cè)白色比色板和載玻片,洗凈備用。白色比色板各個(gè)樣品滴加奈氏試劑（檢測(cè)NH4+）,載玻片各個(gè)樣品滴加20%璜基水楊酸（檢測(cè)蛋白質(zhì)）。用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺▲

回收凝膠注意事項(xiàng)：

1.凝膠柱的制備質(zhì)量決定分離效果的好壞。

2.加樣分離時(shí)，滴速越慢，分離效果越好?！?/p>

以管號(hào)為橫軸，蛋白質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫曲線，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離子交換劑達(dá)到分離純化目的的層析方法。

DEAE（二乙基氨基乙基）－纖維素含有可離子化的堿基，可與氫離子結(jié)合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。離子交換劑類型帶電荷吸附離子陽離子交換劑負(fù)電陽離子陰離子交換劑正電陰離子實(shí)驗(yàn)三、DEAE－纖維素離子交換層析(P34)

蛋白質(zhì)的電離示意圖

血清中蛋白的等電點(diǎn)18清蛋白α2球蛋白

β球蛋白γ球蛋白等電點(diǎn)pI4.645.065.127.3pH=6.3負(fù)電負(fù)電負(fù)電正電操作裝柱、上樣、洗脫、收集及蛋白質(zhì)檢查等操作步驟同凝膠層析。用20%磺基水楊酸溶液檢查蛋白質(zhì)分布情況，收集含量最高的部分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來的是γ－球蛋白。實(shí)驗(yàn)四、γ－球蛋白純化液的濃縮

利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大分子蛋白進(jìn)入微孔的特性，在樣品溶液中加少量凝膠，離心，濃縮蛋白。

每ml純化γ－球蛋白溶液加SephadexG-250.25g，搖動(dòng)2～3分鐘，離心3000r/min，5分鐘，上清即為濃縮γ-球蛋白注意事項(xiàng)211.裝柱時(shí)檢查是否漏水。2.裝柱后凝膠