ICH《M10：生物分析方法驗證及樣品分析》

國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會

ICH協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則

生物分析方法驗證及樣品分析

M10

終稿

2022年5月24日采納

在ICH進程第2階段，ICH大會將相應(yīng)ICH專家工作組已達成共識的文本或指導(dǎo)原則

草案遞交給1CH區(qū)域監(jiān)管機構(gòu),用以按照相應(yīng)國家或地區(qū)的程序-征求內(nèi)部和外部意見。

MIO

指導(dǎo)原則進程

編碼進程日期

ICH大會成員第二階段發(fā)布征求意見稿（2019年1月

M1O2019年2月26日

15日版）

M1OICH大會監(jiān)管機構(gòu)成員第四階段采納2022年5月24日

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ICH協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則

生物分析方法驗證及樣品分析

M10

ICH共識指導(dǎo)原則

目錄

1.弓I言.................................................................7

1.1目的.............................................................7

1.2背景.............................................................7

1.3范圍.............................................................7

2.一般原則.............................................................8

2.1方法開發(fā).........................................................8

2.2方法驗證.........................................................8

2.2.1完整驗證...............................................8

2.2.2部分驗證...............................................9

2.2.3交叉驗證...............................................9

3.色譜法...........................................................9

3.1對照標(biāo)準(zhǔn)品.................................................10

3.2方法驗證...................................................10

3.2.1選擇性................................................10

3.2.2特異性................................................11

3.2.3基質(zhì)效應(yīng)..............................................11

3.2.4校準(zhǔn)曲線和范圍........................................12

3.2.5準(zhǔn)確度和精密度........................................13

3.2.6殘留..................................................14

3.2.7稀釋可靠性............................................14

3.2.8穩(wěn)定性................................................14

3.2.9進樣重現(xiàn)性............................................17

3.3研究樣品分析...............................................17

3.3.1分析批................................................17

3.3.2分析批接受標(biāo)準(zhǔn)........................................18

3.3.3校正范圍..............................................19

3.3.4研究樣品重分析........................................20

3.3.5研究樣品重進樣........................................21

3.3.6色譜圖積分............................................21

4.配體結(jié)合分析..................................................21

4.1主要試劑...................................................21

4.1.1對照標(biāo)準(zhǔn)品............................................21

4.1.2關(guān)鍵試劑..............................................21

4.2方法驗證...................................................22

4.2.1特異性................................................22

4.2.2選擇性................................................23

4.2.3校準(zhǔn)曲線和范圍........................................23

4.2.4準(zhǔn)確度和精密度........................................24

4.2.5殘留..................................................25

4.2.6稀釋線性和鉤狀效應(yīng)....................................25

4.2.7穩(wěn)定性................................................26

4.3研究樣品分析...............................................27

4.3.1分析批................................................27

4.3.2分析批接受標(biāo)準(zhǔn)........................................27

4.3.3校正范圍..............................................28

4.3.4研究樣品重分析........................................28

5.已測樣品再分析(ISR)...................................................................................29

6.部分驗證和交叉驗證............................................31

6.1部分驗證...................................................31

6.2交叉驗證...................................................32

7.相關(guān)考慮.......................................................32

7.1待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)的分析方法.............................32

7.1.1待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的質(zhì)控樣品................33

7.1.2待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的選擇性、回收率和基質(zhì)效應(yīng).34

7.1.3待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的平行性..................35

7.1.4待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的準(zhǔn)確度和精密度..........35

7.1.5待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的穩(wěn)定性..................35

7.2平行性.....................................................35

7.3回收率.....................................................36

7.4最低需求稀釋度.............................................36

7.5商品化與診斷試劑盒.........................................36

7.6新技術(shù)或備選技術(shù)...........................................37

7.6.1干基質(zhì)方法............................................37

8.文檔資料.......................................................38

8.1摘要信息...................................................38

8.2驗證和生物分析報告的文件...................................39

9.專業(yè)術(shù)語.......................................................44

1.引言

1.1目的

本指導(dǎo)原則旨在為化學(xué)藥物和生物藥物生物分析方法驗證及其在研究樣品

分析中的應(yīng)用提供建議，以確保用于支持化學(xué)藥物和生物藥物研發(fā)及注冊申請中

生物分析結(jié)果的質(zhì)量和一致性。

生物分析方法驗證旨在證明所采用的生物分析方法適用于預(yù)期目的o也可采

用本指導(dǎo)原則建議以外的方法進行驗證，但需要提供適當(dāng)?shù)目茖W(xué)依據(jù)。采用或擬

采用不同方法驗證時，建議申請人就驗證方法的重大變更咨詢監(jiān)管機構(gòu)。

1.2背景

生物基質(zhì)中化學(xué)藥物和生物藥物及其代謝物的濃度測定是藥物開發(fā)過程中

的重要內(nèi)容，研究結(jié)果有助于支持藥物安全性和有效性相關(guān)監(jiān)管決策。因此，所

使用的生物分析方法必須經(jīng)過充分表征、適當(dāng)驗證和記錄，以確保獲得可靠數(shù)據(jù)

以支持監(jiān)管決策。

某些情況下，本指南還可促進藥物研發(fā)過程中依據(jù)3Rs（減少、優(yōu)化、替代）

原則進行動物研究。

1.3范圍

本指導(dǎo)原則描述了用于支持監(jiān)管決策的生物樣品（例如血液、血漿、血清、

其他體液或組織）分析方法驗證及研究樣品分析。本指導(dǎo)原則適用于測定生物樣

品（如全血、血漿、血清、其他體液或組織）中化藥和生物藥及其代謝產(chǎn)物濃度

的檢測方法，上述生物樣品來自于：根據(jù)GLP原則進行的非臨床毒代動力學(xué)（TK）

研究、可替代臨床研究的非臨床藥代動力學(xué)（PK）研究以及各期臨床試驗，包

括向監(jiān)管機構(gòu)提交的生物利用度比較和生物等效性（BA/BE）研究。對擬提交注

冊申請的研究中涉及的主要基質(zhì)，應(yīng)進行完整的方法驗證，必要時，還應(yīng)對其他

基質(zhì)進行部分驗證。

對不用于注冊申請、藥物安全有效性評估或說明書內(nèi)容的試驗（如探索性研

究），申請人可根據(jù)其支持內(nèi)部決策的強度水平自行決定分析方法驗證的程度。

本指導(dǎo)原則適用于配體結(jié)合分析法（LBAs）和色譜分析法［例如通常與質(zhì)譜

檢測器聯(lián)用的液相色譜（LC）或氣相色譜（GC）］的定量分析。

對于必須遵循藥物非臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）或藥物臨床試驗質(zhì)量管

理規(guī)范（GCP）的研究，研究樣品的生物分析也應(yīng)符合其相關(guān)要求。

本指導(dǎo)原則不適用于生物標(biāo)志物和免疫原性分析方法。

2.一般原則

2.1方法開發(fā)

生物分析方法開發(fā)的目的是確定方法的設(shè)計、操作條件、局限性和適用性以

達到預(yù)期目的，并確保分析方法可用于驗證。

在生物分析方法開發(fā)之前或進行中，如果可行，申請人應(yīng)充分了解目標(biāo)待測

物（例如藥物的理化性質(zhì)、體內(nèi)外代謝、紅細胞/血漿分布以及蛋白結(jié)合情況），

并考慮可能適用的任何現(xiàn)有分析方法的各個方面。

方法開發(fā)涉及明確待測物定量檢測相關(guān)的過程和條件，包括以下要素的充分

表征：

?標(biāo)準(zhǔn)品/對照品

?關(guān)鍵試劑

?校準(zhǔn)曲線

?質(zhì)控樣品（QCs）

?選擇性和特異性

?靈敏度

?準(zhǔn)確度

?精密度

?回收率

?待測物穩(wěn)定性

?最低需求稀釋度（MRD）

生物分析方法開發(fā)不需要保存大量的記錄或注釋。方法開發(fā)一旦完成，需經(jīng)

過方法驗證，證明該方法適用于研究樣品分析。

如果在分析非臨床或臨床研究樣品期間遇到需要停止分析的問題，則應(yīng)記錄

檢測方法的任何變更及其理由。

2.2方法驗證

2.2.1完整驗證

為確保分析性能的可接受性和分析結(jié)果的可靠性，必須對生物分析方法進行

驗證。生物分析方法是用于測定生物樣品中待測物濃度的一系列操作步驟。在建

立用于臨床和關(guān)鍵非臨床研究中待測物定量分析方法時，應(yīng)對生物分析方法進行

全面驗證。藥物研發(fā)過程中采用文獻報道的分析方法和商品試劑盒用于生物樣品

分析時，也應(yīng)進行完整驗證。通常情況下僅需測定一個待測物，但有時需檢測多

個待測物，可能涉及兩種不同的藥物、原形藥物及其代謝物、或藥物的對映體或

異構(gòu)體。此時，所有目標(biāo)待測物的方法學(xué)驗證和樣品分析都應(yīng)符合本指導(dǎo)原則。

除另有說明外，色譜分析法的完整方法驗證應(yīng)包括以下內(nèi)容：選擇性、特異性、

基質(zhì)效應(yīng)、校準(zhǔn)曲線（響應(yīng)函數(shù)）、范圍（定量下限（LLOQ）至定量上限（ULOQ））、

準(zhǔn)確度、精密度、殘留、稀釋可靠性、穩(wěn)定性和進樣重現(xiàn)性。

除另有說明外，LBA的方法驗證應(yīng)包括以下內(nèi)容：特異性、選擇性、校準(zhǔn)曲

線（響應(yīng)函數(shù)）、范圍（LLOQ至ULOQ）、準(zhǔn)確度、精密度、殘留、稀釋線性

和穩(wěn)定性。必要時，如可獲得合適的研究樣品，還應(yīng)進行平行性考察。

方法學(xué)驗證期間開展的各項評估應(yīng)與研究樣品的分析工作流程相關(guān)。用于分

析方法驗證的基質(zhì)（包括抗凝劑和添加劑）應(yīng)與研究樣品相同。在難以獲得與研

究樣品相同基質(zhì)（例如，組織、腦脊液、膽汁等稀有基質(zhì)）或檢測游離藥物的情

況下，可采用替代基質(zhì)開展分析方法驗證。

替代基質(zhì)的選擇應(yīng)科學(xué)合理。通常認為，同一物種內(nèi)不同基質(zhì)間的差異（如

年齡、種族、性別）不會影響方法驗證。

應(yīng)事先建立詳細具體描述生物分析方法及驗證過程的書面文件，可采用研究

方案、研究計劃、報告、記錄或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）的形式。

2.2.2部分驗證

對經(jīng)完全驗證的分析方法的修改可以通過部分驗證進行評估。部分驗證的內(nèi)

容應(yīng)根據(jù)方法變更的范圍和性質(zhì)來確定，驗證內(nèi)容可從僅一項準(zhǔn)確度和精密度驗

證到幾乎完整驗證（參見第61節(jié)）。

2.2.3交叉驗證

當(dāng)涉及多種分析方法和/或多個生物分析實驗室時，需采用交叉驗證評估報

告數(shù)據(jù)間的相關(guān)性（參見第6.2節(jié)）。

3.色譜法

3.1對照標(biāo)準(zhǔn)品

分析方法驗證和研究樣品分析時，需將含有目標(biāo)待測物的對照標(biāo)準(zhǔn)品溶液加

入空白基質(zhì)中，以制備校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品。校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品應(yīng)采用不同的

儲備液配制。但是，如果儲備液的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性已得到驗證，校正標(biāo)樣和質(zhì)控

樣品可采用相同的儲備液配制。

應(yīng)在所有校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品和研究樣品處理過程中加入適宜的內(nèi)標(biāo)（IS）O

若不加內(nèi)標(biāo)，應(yīng)提供相應(yīng)的支持性證據(jù)。

對照標(biāo)準(zhǔn)品具有良好性質(zhì)至關(guān)重要，其質(zhì)量會影響分析結(jié)果，從而影響研究

數(shù)據(jù)，因此要確保其質(zhì)量（純度、鑒別）和內(nèi)標(biāo)的適用性。方法驗證和研究樣品

分析過程中使用的對照標(biāo)準(zhǔn)品的來源應(yīng)可靠并可追溯，并且其化學(xué)形式應(yīng)與待測

物相同。如果無法獲得與待測物相同的對照標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用質(zhì)量可控的其他

化學(xué)形式的物質(zhì)（例如鹽或水合物）。

適宜的對照標(biāo)準(zhǔn)品包括藥典標(biāo)準(zhǔn)品、商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品或經(jīng)充分驗證的內(nèi)部或外

部組織制備的標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)提供分析證書（CoA）或同等的其他材料來證明對照標(biāo)

準(zhǔn)品的質(zhì)量，應(yīng)包含有關(guān)純度、儲存條件、重新標(biāo)定/失效日期和批號的相關(guān)信

息。

內(nèi)標(biāo)不需要提供分析證書，只要證明其適用性即可，例如能夠證明該物質(zhì)本

身或其相關(guān)的任何雜質(zhì)對于待測物的檢測不會產(chǎn)生干擾。

使用質(zhì)譜檢測時，建議盡可能使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)。同位素內(nèi)標(biāo)必須

具有足夠高的同位素純度，并且不會發(fā)生同位素交換反應(yīng)。應(yīng)檢查是否存在未標(biāo)

記待測物，如果檢測到未標(biāo)記待測物，則應(yīng)在方法驗證期間評估其潛在影響。

儲備液和工作液應(yīng)當(dāng)使用分析證書所標(biāo)明的穩(wěn)定期內(nèi)（即有效期或重新標(biāo)定

日期）的對照標(biāo)準(zhǔn)品制備。

3.2方法驗證

3.2.1選擇性

選擇性是分析方法在空白生物基質(zhì)中存在潛在干擾物質(zhì)的情況下區(qū)分和測

定待測物的能力。

應(yīng)使用至少6個不同個體來源/批次（非溶血和非高脂）的空白基質(zhì)（不含待

測物或內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)樣品）證明選擇性。在不同來源的基質(zhì)難以獲得的情況下，可

以使用更少來源的基質(zhì)。還應(yīng)評估內(nèi)標(biāo)的選擇性。

選擇性的評估應(yīng)證明空白樣品中待測物或內(nèi)標(biāo)的保留時間處沒有干擾組分

引起的顯著響應(yīng)。每個基質(zhì)中，干擾組分的響應(yīng)不應(yīng)高于待測物定量下限響應(yīng)的

20%,并且不高于定量下限樣品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%。

高脂基質(zhì)選擇性的評價應(yīng)使用至少一種來源的高脂基質(zhì)。為保證科學(xué)目的，

用于驗證的基質(zhì)應(yīng)盡可能代表預(yù)期研究樣品。應(yīng)盡量從甘油三酯水平異常高的受

試者中獲得。如果難以獲得，也可以使用加入甘油三酯的基質(zhì)，雖然其并不能完

全代表實際研究樣品。如果藥物影響脂質(zhì)代謝或預(yù)期的患者是高脂血癥群體，則

不建議使用加入甘油三醋制備的高脂基質(zhì)。高脂基質(zhì)的選擇性驗證對于臨床前研

究來說不是必需的，除非藥物影響脂質(zhì)代謝或者在特定的高脂血癥動物中應(yīng)用。

溶血基質(zhì)選擇性的評價應(yīng)使用至少一種來源的溶血基質(zhì)，可通過向基質(zhì)中加

入溶血全血（至少2%V/V）獲得，以形成明顯可見的溶血樣品。

3.2.2特異性

特異性是生物分析方法檢測和區(qū)分待測物與其他物質(zhì)的能力，包括相關(guān)物質(zhì)

（例如與待測物結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)、代謝物、異構(gòu)體、雜質(zhì)、樣品制備過程中形成

的降解產(chǎn)物，或預(yù)期目標(biāo)適應(yīng)癥患者的合并用藥）。

如果生物基質(zhì)中預(yù)計存在相關(guān)物質(zhì)，則應(yīng)在方法驗證期間或者在給藥前研究

樣品中評估其影響。當(dāng)采用LC-MS方法時，特異性的考察包括比較待測物與潛在

相關(guān)干擾物質(zhì)的分子量以及將相關(guān)物質(zhì)與待測物色譜分離。

干擾組分的響應(yīng)不應(yīng)超過待測物定量下限響應(yīng)的20%,并不高于定量下限樣

品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%。

在分析檢測過程中（包括提取過程或進入離子源以后），還應(yīng)評估代謝物回

復(fù)轉(zhuǎn)化為母體待測物的可能性（即潛在不穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，如酯待測物到醇/酸

代謝物、不穩(wěn)定的N-氧化物或葡萄糖昔酸代謝物、內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)）。在新化學(xué)實體

藥物開發(fā)的早期階段尚未對代謝物進行研究時，這種評估通常無法實現(xiàn)。但建議

考慮以上情形，并在必要時進行部分驗證。如存在上述情況，則應(yīng)該在生物樣品

分析報告中評估回復(fù)轉(zhuǎn)化程度，并討論對研究結(jié)果的影響。

3.2.3基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指由于生物基質(zhì)中的干擾物質(zhì)和通常未識別的成分引起的待測

物響應(yīng)的改變。在方法驗證過程中，需要考察不同來源/批次間的基質(zhì)效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)應(yīng)通過分析至少3個重復(fù)的低和高濃度質(zhì)控樣品進行評估，每個重

復(fù)使用至少6個不同來源/批次的基質(zhì)制備。對于每一個來源/批次的基質(zhì)，準(zhǔn)確度

應(yīng)在標(biāo)示濃度的±15%以內(nèi)，并且精密度（變異系數(shù)百分比，％CV）不應(yīng)大于15%。

如果基質(zhì)難以獲得，可以允許使用更少來源/批次的基質(zhì)。

如有可能，基質(zhì)效應(yīng)也應(yīng)在相關(guān)的患者群體或特殊人群（例如肝功能不全或

腎功能不全患者）中評估。當(dāng)預(yù)計試驗中會出現(xiàn)溶血或高脂基質(zhì)時，建議在方法

驗證期間根據(jù)具體情況使用溶血或高脂基質(zhì)進行額外的基質(zhì)效應(yīng)考察。

3.2.4校準(zhǔn)曲線和范圍

校準(zhǔn)曲線用于描述待測物的標(biāo)示濃度與分析響應(yīng)之間的關(guān)系。通過在空白基

質(zhì)中加入已知濃度待測物制備校正標(biāo)樣，涵蓋相應(yīng)的濃度范圍并組成校準(zhǔn)曲線。

配制校正標(biāo)樣的基質(zhì)應(yīng)與研究樣品基質(zhì)相同。校準(zhǔn)曲線的濃度范圍由定量下限

（LLOQ,校正標(biāo)樣的最低濃度）和定量上限（ULOQ,校正標(biāo)樣的最高濃度）

來決定。在方法驗證和每一分析批中，每個待測物都應(yīng)隨行一條校準(zhǔn)曲線。

校準(zhǔn)曲線應(yīng)包括空白樣品、零濃度樣品（僅加入內(nèi)標(biāo)的空白樣品）和至少6

個濃度水平的校正標(biāo)樣（包括定量下限和定量上限）。

應(yīng)使用簡單的回歸模型來充分描述濃度-響應(yīng)關(guān)系?；貧w模型的選擇應(yīng)該有

書面的操作規(guī)程指導(dǎo)。應(yīng)在方法驗證期間確定回歸模型、數(shù)據(jù)加權(quán)和轉(zhuǎn)換方案。

空白樣品和零濃度樣品不應(yīng)該包含在校準(zhǔn)曲線回歸方程當(dāng)中。校正標(biāo)樣可以重復(fù)

分析，在這種情況下，所有可接受的重復(fù)數(shù)據(jù)都應(yīng)納入校準(zhǔn)曲線回歸分析。

報告中應(yīng)包括校準(zhǔn)曲線參數(shù)（例如線性擬合時的斜率和截距）、校正標(biāo)樣的

回算濃度和計算的平均準(zhǔn)確度、精密度。應(yīng)提交在驗證過程中所有可接受的校準(zhǔn)

曲線，其中包括不同天內(nèi)考察的至少3個獨立分析批的校準(zhǔn)曲線。在定量下限水

平，校正標(biāo)樣的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示濃度的±20%以內(nèi)，其他水平應(yīng)在標(biāo)示值的

±15%以內(nèi)。至少有75%的校正標(biāo)樣且至少6個濃度水平應(yīng)符合上述標(biāo)準(zhǔn)。

在使用重復(fù)測定的情況下，對于每個濃度水平，至少50%的校正標(biāo)樣應(yīng)滿足

接受標(biāo)準(zhǔn)（LLOQ±20%,其他濃度±15%）。如果不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)拒絕該

校正標(biāo)樣，并重新擬合去除該點后的校準(zhǔn)曲線，包括回歸分析。對于準(zhǔn)確度和精

密度考察的批次，如果分析批定量下限或定量上限校正標(biāo)樣的所有重復(fù)數(shù)據(jù)都不

合格，則應(yīng)拒絕該批次結(jié)果，確定分析批失敗的可能原因，并在必要時修改方法。

如果下一個驗證批次也失敗，則應(yīng)在重新啟動驗證之前修改該方法。

應(yīng)至少在一次評估中采用新鮮配制的校正標(biāo)樣制備校準(zhǔn)曲線。隨后，可在規(guī)

定的穩(wěn)定期內(nèi)使用冷凍的校正標(biāo)樣。

3.2.5準(zhǔn)確度和精密度

3.2.5.1質(zhì)控樣品配制

質(zhì)控樣品旨在模擬研究樣品，通過將已知濃度的待測物加入到空白基質(zhì)中來

配制，并在與研究樣品相同預(yù)期條件下儲存和檢測，以評估分析方法的有效性。

校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品應(yīng)采用不同的儲備液配制，以避免出現(xiàn)與分析方法性能

無關(guān)的偏差。如果儲備液的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性已得到驗證，則可使用相同的儲備液

配制校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品。如果不存在干擾或基質(zhì)效應(yīng)，也可以使用單一來源的

空白基質(zhì)，詳見第3.2.3節(jié)。

在方法驗證過程中，應(yīng)配制在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)至少4個濃度水平的質(zhì)控樣品：

LLOQ、在LLOQ濃度三倍以內(nèi)（低濃度質(zhì)控）、約為校準(zhǔn)曲線范圍的30-50%（中

濃度質(zhì)控）和至少ULOQ的75%（高濃度質(zhì)控）。

對于非準(zhǔn)確度和精密度驗證的分析批，可重復(fù)分析低、中和高濃度QC樣品。

這些QC樣品連同校正標(biāo)樣將為接受或拒絕分析批提供依據(jù)。

3.2.5.2準(zhǔn)確度和精密度評估

準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過分析每一個分析批（批內(nèi)）和不同分析批間（批間）

的質(zhì)控樣品來確定。應(yīng)使用相同批次的數(shù)據(jù)考察準(zhǔn)確度和精密度。

批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過在每一分析批、對每個濃度水平的質(zhì)控樣品進行

至少5個樣品分析來評估。批間準(zhǔn)確度和精密度需要通過對每個濃度水平質(zhì)控在

至少兩天內(nèi)考察的至少3個分析批結(jié)果進行評價。為了能夠評估一個分析批內(nèi)隨

時間變化的任何趨勢，建議至少在一個分析批中證明質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精密

度，該分析批的大小應(yīng)與研究樣品預(yù)期分析批大小相當(dāng)。報告的方法驗證數(shù)據(jù)以

及準(zhǔn)確度和精密度的測定應(yīng)包括所有獲得的結(jié)果，包括不符合接受標(biāo)準(zhǔn)的單個質(zhì)

控樣品，已被記錄的明顯錯誤情況除外。同時還要提交每個分析批的批內(nèi)準(zhǔn)確度

和精密度數(shù)據(jù)。如果不是所有分析批的批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度均滿足標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)計

算每個濃度水平質(zhì)控樣品的批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度的總體估計值。批間精密度和準(zhǔn)

確度應(yīng)合并所有批次的數(shù)據(jù)進行計算。

用于這些考察的分析批中，至少一個分析批的校準(zhǔn)曲線應(yīng)采用新鮮配制的校

正標(biāo)樣制備。如果其他分析批未使用新鮮配制的校準(zhǔn)曲線，則需證明凍存校正標(biāo)

樣的穩(wěn)定性。

除LLOQ外，每個濃度水平質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±15%以內(nèi)，

LLOQ的準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%以內(nèi)。除LLOQ外，每個濃度水平質(zhì)控樣品的

精密度（％CV）不應(yīng)超過15%,LLOQ的精密度不應(yīng)超過20%。

對于非準(zhǔn)確度和精密度驗證的分析批，至少2/3的QC樣品、每個濃度水平的

至少50%應(yīng)在標(biāo)示值的±15%以內(nèi)。

3.2.6殘留效應(yīng)

殘留效應(yīng)是指前一個樣品保留在分析儀器上的殘余物而引起測定濃度變化。

在方法開發(fā)過程中應(yīng)當(dāng)評估并盡量減少殘留。在驗證期間，通過在ULOQ樣

品之后分析空白樣品來考察殘留效應(yīng)。在ULOQ之后的空白樣品中的殘留應(yīng)不超

過LLOQ樣品中待測物響應(yīng)的20%和內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%。如果殘留不可避免，則研

究樣品不能隨機進樣，應(yīng)考慮具體措施，在方法驗證時檢驗并在研究樣品分析時

應(yīng)用這些措施，以確保殘留不影響準(zhǔn)確度和精密度。包括在分析預(yù)期高濃度樣品

之后，下一個研究樣品之前，進樣空白樣品。

3.2.7稀釋可靠性

稀釋可靠性是在必要時對樣品稀釋過程的評估，以確保不會對待測物濃度的

準(zhǔn)確度和精密度造成影響，應(yīng)使用與配制質(zhì)控樣品相同物種來源的空白基質(zhì)進行

樣品稀釋。

稀釋質(zhì)控樣品的濃度應(yīng)大于ULOQ,采用空白基質(zhì)對樣品進行稀釋，每個稀

釋因子至少5個測定值，并在同一批次進行檢測，以確保檢測濃度在校準(zhǔn)曲線范

圍內(nèi)被準(zhǔn)確、精密地測量。研究樣品分析過程中所用稀釋因子和濃度應(yīng)該處于方

法學(xué)驗證的稀釋因子和濃度范圍內(nèi)。稀釋質(zhì)控的平均準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±15%

之內(nèi)，精密度（%CV）不應(yīng)超過15%。

當(dāng)試驗基質(zhì)難以獲得時，在證明不影響精密度和準(zhǔn)確度的情況下可以使用替

代基質(zhì)進行稀釋。

3.2.8穩(wěn)定性

應(yīng)進行穩(wěn)定性考察，以確保樣品在制備、處理和分析過程中采取的每一步操

作以及使用的儲存條件都不會影響待測物的濃度。

用于穩(wěn)定性試驗的儲存和分析條件，如樣品儲存時間和溫度、樣品基質(zhì)、抗

凝劑和容器材料等，都應(yīng)與實際研究樣品相同。文獻報道的數(shù)據(jù)不足以證明穩(wěn)定

性結(jié)果。穩(wěn)定性考察中質(zhì)控樣品的儲存時間不應(yīng)比研究樣品儲存時間短。

采用低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品考察基質(zhì)中待測物的穩(wěn)定性。低濃度和

高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)分別在零時和考察條件下放置后進行評價。應(yīng)在每個濃

度水平下制備一批QC樣品。對于每個濃度水平，應(yīng)將這批QC樣品分為至少3等

份，以進行儲存、處理和分析。

由新鮮制備的校正標(biāo)樣獲得校準(zhǔn)曲線，根據(jù)校準(zhǔn)曲線分析穩(wěn)定性質(zhì)控樣品，

同批次隨行檢測新鮮制備的質(zhì)控樣品或穩(wěn)定性已被證明的質(zhì)控樣品。每一濃度的

均值應(yīng)在標(biāo)示濃度的±15%范圍內(nèi)。如果研究樣品的濃度持續(xù)高于校準(zhǔn)曲線的

ULOQ,則應(yīng)調(diào)高穩(wěn)定性質(zhì)控樣品的濃度，以反映這些較高濃度樣品的穩(wěn)定性結(jié)

果。由于溶解度的限制，這種情況在非臨床研究中很難出現(xiàn)。

對固定復(fù)方制劑或特定藥物治療方案相關(guān)研究，應(yīng)使用含所有給藥化合物的

基質(zhì)進行各待測物在基質(zhì)中的凍融、前處理過程中和長期穩(wěn)定性的考察。

通常應(yīng)該進行下列穩(wěn)定性考察：

1）基質(zhì)中的穩(wěn)定性

凍融穩(wěn)定性

為了評估從冷凍儲存條件中反復(fù)取出樣品的影響，應(yīng)在多次冷凍和解凍循環(huán)

后考察待測物的穩(wěn)定性。應(yīng)采用與研究樣品相同的處理過程，對低和高濃度穩(wěn)定

性質(zhì)控樣品進行解凍和分析。穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)在解凍循環(huán)之間保持至少12小時

的冷凍。用于凍融穩(wěn)定性考察的質(zhì)控樣品應(yīng)使用新鮮制備的校準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品

或已證明穩(wěn)定的質(zhì)控樣品進行評估。經(jīng)驗證的冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)應(yīng)不少于研究

樣品所經(jīng)歷的凍融循環(huán)次數(shù)，至少應(yīng)進行三次循環(huán)。

前處理穩(wěn)定性（短期穩(wěn)定性）

應(yīng)設(shè)計考察基質(zhì)中待測物前處理過程中的穩(wěn)定性實驗，以模擬研究樣品的實

驗室處理條件。

低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)采用與研究樣品相同的方式解凍，并在前

處理過程中保持與研究樣品相同的溫度和至少相同的持續(xù)時間。

在前處理過程中的總時間應(yīng)該是一致的；不接受額外暴露于前處理條件下的

時間累加（即不包括每次凍融考察的時間累加）。

長期穩(wěn)定性

應(yīng)考察基質(zhì)中的待測物在冰箱中儲存的長期穩(wěn)定性。低濃度和高濃度穩(wěn)定性

質(zhì)控樣品應(yīng)在與研究樣品相同的冰箱儲存條件下保存至少相同的持續(xù)時間。

對于化學(xué)藥物，可以接受將一個溫度（例如-20C）的穩(wěn)定性外推到較低溫

度（例如-70/80C）o

對于生物藥物，可以采用括號法，例如，在-70/8（rc和-2（rc條件下的穩(wěn)定性

已經(jīng)被證明的情況下，若研究樣品儲存溫度在此范圍之間，則不必額外考察研究

樣品儲存溫度下的長期穩(wěn)定性。

2）處理后樣品中的待測物穩(wěn)定性

應(yīng)考察處理后樣品穩(wěn)定性，包括分析完成前（在自動進樣器/儀器中）的時

間。如：

?處理后樣品（干燥提取物或在進樣階段）在研究樣品分析時存放條件下

的穩(wěn)定性。

?處理后樣品在儀器或自動進樣器溫度下的穩(wěn)定性。

處理后樣品的總存儲時間應(yīng)該是同期的（即自動進樣器存儲時間和其他存儲

時間不能相加）。

3）儲備液和工作液中待測物和內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定性

應(yīng)根據(jù)分析研究樣品期間使用的儲存條件，確定待測物和內(nèi)標(biāo)的儲備液和工

作液的穩(wěn)定性，采用溶液的最低和最高濃度進行考察?？紤]到檢測器的線性和檢

測范圍，應(yīng)通過適當(dāng)稀釋，通過檢測器的響應(yīng)來考察儲備液和工作液的穩(wěn)定性。

如果穩(wěn)定性隨濃度而變化，則需要考察所有濃度儲備液和工作液的穩(wěn)定性。如果

穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)在與待測物相同的儲存條件下不發(fā)生同位素交換，則內(nèi)標(biāo)不

需要進行額外的穩(wěn)定性考察。如果對照標(biāo)準(zhǔn)品過期或已超過重新標(biāo)定日期，之前

使用該批對照標(biāo)準(zhǔn)品配制的儲備液的穩(wěn)定性由儲備液的有效期或重新標(biāo)定日期

決定。僅為了延長對照標(biāo)準(zhǔn)品的使用效期而將其配制成儲備液或工作液的做法是

不被接受的。

此外，如果適用，也應(yīng)該進行下列考察:

4）全血穩(wěn)定性

樣品從受試者采集之后到儲存之前，應(yīng)該充分關(guān)注樣品基質(zhì)（全血）中待測

物的穩(wěn)定性，以確保通過分析方法獲得的濃度能夠反映樣品采集時受試者血液中

待測物的濃度。

如果使用的基質(zhì)是血漿，則應(yīng)在方法開發(fā)（例如在全血中使用探索性方法）

或方法驗證期間考察全血中待測物的穩(wěn)定性。其結(jié)果應(yīng)在方法驗證報告中提供。

3.2.9進樣重現(xiàn)性

方法的重現(xiàn)性通過重復(fù)測定質(zhì)控樣品來考察，通常包含在精密度和準(zhǔn)確度考

察中。但如果樣品可以重新進樣（例如在儀器中斷或其他原因如設(shè)備故障的情況

下），應(yīng)評估重新進樣的重現(xiàn)性，以確定處理過的樣品的可行性，并支持它們在

重新進樣前的儲存。

重新進樣的重現(xiàn)性通過由儲存后的校正標(biāo)樣和至少5個低濃度和高濃度QC

組成的分析批重新進樣來評估，以重新進樣的QC樣品的精密度和準(zhǔn)確度確定處

理后樣品重新進樣的可行性。

應(yīng)當(dāng)考察并將其結(jié)果納入方法驗證報告或在生物分析報告中提交。

3.3研究樣品分析

方法驗證完進樣重現(xiàn)性成之后可進行研究樣品分析，然而部分驗證內(nèi)容可以

在后續(xù)階段完成（如長期穩(wěn)定性）。提交注冊申請時生物分析方法驗證應(yīng)已全部

完成。根據(jù)已驗證的分析方法處理研究樣品、質(zhì)控樣品和校正標(biāo)樣。如果考察系

統(tǒng)適用性，則應(yīng)參照預(yù)先規(guī)定的具體研究計劃、方案或SOP進行。系統(tǒng)適用性包

括設(shè)備適應(yīng)和儀器性能，采用獨立于當(dāng)前批次校正標(biāo)樣和質(zhì)控的樣品進行考察，

受試者樣品不能用于考察系統(tǒng)適用性。同時應(yīng)監(jiān)測研究樣品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)，以確定

是否存在系統(tǒng)性內(nèi)標(biāo)變異。有關(guān)內(nèi)容請參考表1。

3.3.1分析批

一個分析批由1個空白樣品（不含待測物和內(nèi)標(biāo)的處理后樣品）、1個零濃度

樣品（含內(nèi)標(biāo)的處理后基質(zhì)）、至少6個濃度水平的校正標(biāo)樣、至少3個濃度水平

的質(zhì)控樣品（低、中、高濃度雙樣品，或至少研究樣品總數(shù)的5%,兩者中取數(shù)

目更多者）以及待分析的研究樣品。質(zhì)控樣品應(yīng)該分散到整個分析批中，以保證

整個分析批的準(zhǔn)確度和精密度。質(zhì)控樣品應(yīng)始終與研究樣品同樣處理。

校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品應(yīng)使用單獨配制的儲備液分別配制，除非儲備液的準(zhǔn)確

度和穩(wěn)定性已得到驗證。所有樣品（校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品和研究樣品）應(yīng)按照擬

分析順序在同一處理批中處理和提取。應(yīng)避免在同一分析批檢測的樣品在多個單

獨處理批中處理。以上情況無法避免時，例如由于前處理穩(wěn)定性限制，則每個處

理批應(yīng)包括低、中、高濃度質(zhì)控樣品。

對于比較BA/BE研究，建議每例受試者的全部樣品在同一分析批中檢測，以

減少結(jié)果的變異。

應(yīng)評估和報告研究樣品分析過程中發(fā)生的任何殘留影響（見第326節(jié)）。如

檢測到殘留，則應(yīng)減輕其對測定濃度的影響（例如研究樣品的非隨機化、在預(yù)期

高濃度樣品后進樣空白樣品）或在生物樣品分析報告中證明報告濃度的有效性。

3.3.2分析批接受標(biāo)準(zhǔn)

應(yīng)在方案、研究計劃或SOP中規(guī)定接受或拒絕分析批的標(biāo)準(zhǔn)。若一個分析批

包含多個處理批，則整個分析批及單獨處理批均應(yīng)滿足接受標(biāo)準(zhǔn)。即使分析批中

一個處理批因不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)被拒絕，分析批也存在滿足接受標(biāo)準(zhǔn)的可能。失敗

處理批中的校正標(biāo)樣不能用于支持在該分析批中接受其他處理批。

除LLOQ外，校正標(biāo)樣的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示值的士15%以內(nèi)，LLOQ應(yīng)在±20%

范圍內(nèi)。至少75%且不少于6個濃度水平的校正標(biāo)樣應(yīng)滿足該標(biāo)準(zhǔn)。如果采用的

校正標(biāo)樣濃度超過6個且其中一個不滿足標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)該拒絕該校正標(biāo)樣，重新計

算不含該點的校準(zhǔn)曲線并進行新的回歸分析。

如果拒絕的校正標(biāo)樣是LLOQ,則該分析批新的LLOQ是校準(zhǔn)曲線下一個可

接受的最低濃度校正標(biāo)樣；新的LLOQ應(yīng)滿足其原來的接受標(biāo)準(zhǔn)（即±15%）。

如果最高濃度校正標(biāo)樣被拒絕，則該分析批的ULOQ是校準(zhǔn)曲線下一個可接受的

最高濃度校正標(biāo)樣。重新擬合后的校準(zhǔn)曲線范圍應(yīng)覆蓋至少3個濃度水平（低、

中、高）的質(zhì)控樣品。對于重新擬合校準(zhǔn)曲線范圍以外的研究樣品應(yīng)重新進行分

析。如果使用多樣品校正標(biāo)樣，其中僅有一個LLOQ或ULOQ標(biāo)樣不滿足接受標(biāo)

準(zhǔn)，則校正范圍不變。

至少2/3且每一濃度水平至少50%質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度值應(yīng)該在標(biāo)示值的士15%

范圍內(nèi)。若不滿足這一標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)拒絕該分析批。需要將失敗分析批中的所有研

究樣品制備新的分析批次，以便進行后續(xù)分析。如果批次失敗是由可歸結(jié)的技術(shù)

原因引起的，則樣品可以重新進樣。

含有稀釋復(fù)測樣品的分析批應(yīng)包含稀釋質(zhì)控，以驗證研究樣品分析過程中稀

釋方法的準(zhǔn)確度和精密度。稀釋質(zhì)控的濃度應(yīng)大于需稀釋研究樣品（或ULOQ）

的濃度，并采用相同的稀釋因子進行稀釋。如果在一次分析批中使用多個稀釋因

子，則稀釋QC只需按最高和最低稀釋因子稀釋。稀釋質(zhì)控的批內(nèi)接受標(biāo)準(zhǔn)僅影

響稀釋研究樣品的接受情況，不影響分析批的結(jié)果。

在同時檢測多個待測物的情況下，每個待測物都要有一條校準(zhǔn)曲線。如果分

析批其中一個待測物的結(jié)果可以接受，而另一個待測物的結(jié)果被拒絕，則可以采

用接受待測物的數(shù)據(jù)，被拒絕的待測物應(yīng)重新處理和分析。只需要報告重新分析

的待測物的數(shù)據(jù)。

報告中應(yīng)包含接受批的校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的回算濃度。對于所有接受的分

析批，應(yīng)計算每個濃度水平質(zhì)控樣品的總體（批間）準(zhǔn)確度和精密度，并在分析

報告中提交（參見第8節(jié)和表1）。若總體平均準(zhǔn)確度和/或精密度不滿足15%的

接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)進行調(diào)查以確認出現(xiàn)偏差的原因。在比較BA/BE研究中出現(xiàn)這種

情況，可能會導(dǎo)致結(jié)果被拒絕。

3.3.3校正范圍

如果在研究樣品分析開始前，已知或預(yù)測研究樣品中的待測物濃度范圍較

窄，則建議縮窄校準(zhǔn)曲線范圍、調(diào)整質(zhì)控樣品濃度或適當(dāng)添加不同濃度新的質(zhì)控

樣品，以充分反映研究樣品的濃度。

在預(yù)期的治療劑量下，如果在樣品分析開始后，出現(xiàn)研究樣品向校準(zhǔn)曲線一

端非預(yù)期聚集的情況，應(yīng)停止分析，在繼續(xù)進行研究樣品分析之前，縮窄校準(zhǔn)曲

線范圍（即部分驗證）、調(diào)整現(xiàn)有質(zhì)控樣品濃度，或者在觀察到的范圍內(nèi)增加額

外濃度的質(zhì)控樣品。在優(yōu)化校準(zhǔn)曲線范圍或質(zhì)控濃度之前已分析過的樣品，沒有

必要進行重新分析。

以上要求同樣適用于大量研究樣品的分析濃度高于ULOQ的情況。如果可

能，應(yīng)調(diào)整校準(zhǔn)曲線范圍，并增加質(zhì)控樣品或調(diào)整濃度。如無法調(diào)整校準(zhǔn)曲線范

圍或濃度超過ULOQ的樣品數(shù)量不多，則應(yīng)采用經(jīng)驗證的稀釋方法對樣品進行稀

釋。

至少2個質(zhì)控樣品濃度水平應(yīng)在研究樣品的濃度范圍內(nèi)。如果校準(zhǔn)曲線范圍

被調(diào)整，則應(yīng)重新驗證生物分析方法（部分驗證），以驗證響應(yīng)函數(shù)并確保準(zhǔn)確

度和精密度。

3.3.4研究樣品重分析

研究樣品分析開始前，應(yīng)該在方案、研究計劃或SOP中預(yù)先規(guī)定重新分析研

究樣品的理由、重復(fù)次數(shù)以及報告值的選擇標(biāo)準(zhǔn)。對于正在分析多種待測物的研

究樣品，如果其中一種待測物不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，不應(yīng)拒絕另一種待測物的有效結(jié)

果。

應(yīng)在生物樣品分析報告中提供并討論重分析樣品的數(shù)量（以及占樣品總數(shù)的

百分比）。對于比較BA/BE研究，應(yīng)使用單獨的表格報告拒絕的分析批的濃度值。

研究樣品重分析可能基于下列理由：

?由于校正標(biāo)樣的準(zhǔn)確度和/或質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精密度不滿足接受標(biāo)

準(zhǔn)，導(dǎo)致分析批被拒絕；

?研究樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)與校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)差異顯著（在

SOP中預(yù)先規(guī)定）；

?測得的濃度高于ULOQ；

?測得的濃度低于調(diào)整后的LLOQ,而該批校準(zhǔn)曲線中最低濃度校正標(biāo)樣

已被拒絕，導(dǎo)致LLOQ比其他分析批高；

?進樣不當(dāng)或設(shè)備故障；

?稀釋后的研究樣品濃度低于LLOQ；

?在給藥前樣品、對照或安慰劑樣品中測得可定量的待測物；

?色譜圖不佳（SOP中預(yù)先規(guī)定）。

對于比較BA/BE研究，通常不接受由于藥代動力學(xué)原因（例如樣品濃度與預(yù)

期曲線不符）重分析研究樣品，因為這樣可能會影響研究結(jié)果。

應(yīng)在生物樣品分析報告中提供包含所有重分析樣品的初始值、重分析原因、

重分析結(jié)果、采用結(jié)果及理由的匯總表。止匕外，應(yīng)提供針對每種原因重新分析的

樣本總數(shù)的匯總表。在首次分析結(jié)果無法報告的情況下，認為單次重分析是足夠

的（例如濃度高于ULOQ或儀器故障）。在需要對檢測結(jié)果進行確認情況下（例

如給藥前樣品具有可測量濃度），如果樣品體積足夠，則可以進行重復(fù)測定。

受試者的安全性應(yīng)優(yōu)先于試驗中的任何其他方面。因此,可能還有其他情況,

需要因調(diào)查安全性而重新分析特定的研究樣品。

3.3.5研究樣品重進樣

如果已經(jīng)在方法驗證時證明了進樣重現(xiàn)性或在生物樣品分析報告中提供了

進樣重現(xiàn)性的結(jié)果，在儀器故障的情況下，可以將已經(jīng)處理的樣品重新進樣分析。

僅僅因為校正標(biāo)樣或質(zhì)控樣品失敗，而沒有任何確定的分析原因，就重新進樣一

個完整的分析批或個別校正標(biāo)樣或質(zhì)控樣品是不可接受的。

3.3.6色譜圖積分

在研究計劃、方案或SOP中應(yīng)規(guī)定色譜圖積分以及重積分的要求。任何與規(guī)

定要求不符的偏離都應(yīng)在生物樣品分析報告中討論，止匕外，生物分析報告中還應(yīng)

提供需要重積分的色譜圖列表，包括所有手動積分情況以及重積分的理由。應(yīng)保

留原始和重積分色譜圖以及初始和重復(fù)積分結(jié)果以供參考，并在比較BA/BE研究

的生物樣品分析報告中提交。

4.配體結(jié)合分析

4.1主要試劑

4.1.1對照標(biāo)準(zhǔn)品

對照標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)進行充分表征并提供充足的證明性文件（例如，檢驗分析證書

和來源）。生物藥物具有高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其與用于生物樣品分析的結(jié)合試劑的

反應(yīng)活性可能會受藥品生產(chǎn)工藝變化影響。因此用于配制校正標(biāo)樣和質(zhì)控的對照

標(biāo)準(zhǔn)品批次應(yīng)盡可能與非臨床試驗和臨床試驗中使用的批次保持一致。如果用于

生物樣品分析的標(biāo)準(zhǔn)品批次發(fā)生變化，則應(yīng)在使用前用原始批次和新批次的質(zhì)控

樣品進行評估，以確保方法學(xué)的性能符合接受標(biāo)準(zhǔn)。

4.1.2關(guān)鍵試劑

關(guān)鍵試劑包括結(jié)合試劑（例如結(jié)合蛋白、適配子、抗體或偶聯(lián)抗體）和含酶

試劑，對分析結(jié)果有直接影響，因此必須確保關(guān)鍵試劑的質(zhì)量。關(guān)鍵試劑通過與

待測物結(jié)合，發(fā)生相互作用以產(chǎn)生與待測物濃度相關(guān)的儀器響應(yīng)。應(yīng)在分析方法

中對關(guān)鍵試劑進行鑒定和規(guī)定。

在方法開發(fā)的早期應(yīng)考慮關(guān)鍵試劑的可靠采購方式，無論是自制還是購買商

品化試劑。關(guān)鍵試劑的數(shù)據(jù)表應(yīng)至少包括試劑標(biāo)識、來源、批次/批號，純度（如

適用）、濃度（如適用）和穩(wěn)定性/復(fù)測日期/儲存條件（參考表1）。也有可能需

要提供額外的表征數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵試劑生命周期管理程序是必要的，以確保關(guān)鍵試劑的原始批次和新批次

的一致性。試劑性能應(yīng)通過生物分析方法來評估。一般關(guān)鍵試劑的微小變化不會

影響分析性能，而重大變化可能會顯著影響其性能。如果變化較?。ɡ?，其中

一種試劑來源發(fā)生變化），則進行一個對比性的準(zhǔn)確度和精密度分析批驗證即可。

但如果變化較大，則有必要進行額外的驗證試驗。理想情況下，直接對新試劑和

舊試劑的分析結(jié)果進行比較即可。重大變化包括但不限于以下方面：抗體生產(chǎn)工

藝的改變，從動物采集的額外血樣用于制備多克隆抗體和新克隆、新供貨商的單

克隆抗體。

應(yīng)記錄復(fù)驗日期和驗證參數(shù)，以支持延長使用或更換關(guān)鍵試劑。試劑的穩(wěn)定

性試驗應(yīng)基于生物分析方法中試劑的性能表現(xiàn)和儲存條件的一般指導(dǎo)原則，考察

時間可延長至超過供應(yīng)商提供的效期范圍。同時應(yīng)記錄性能參數(shù)，來支持關(guān)鍵試

劑效期延長或更換。

4.2方法驗證

LBA大部分情況下使用微孔板，每個研究樣品可使用單孔或多孔的方式進行

分析。分析方式應(yīng)在方案、研究計劃或SOP中進行規(guī)定。如果在方法學(xué)開發(fā)和驗

證中每個樣品使用單孔或多孔進行分析，那么樣品分析中也應(yīng)該每個樣品相應(yīng)地

分別使用單孔或多孔進行分析。如果每個樣品采用多孔方式進行分析，可以采用

復(fù)孔響應(yīng)的平均值來報告樣品濃度或分別計算每個孔的濃度值，再取復(fù)孔濃度平

均值的方法報告結(jié)果。數(shù)據(jù)評估應(yīng)基于可報告的濃度值。

4.2.1特異性

特異性與LBA中的交叉反應(yīng)性概念有關(guān)。重要的是，結(jié)合試劑與目標(biāo)待測物

特異性結(jié)合，但不與共存的結(jié)構(gòu)相關(guān)分子（例如，內(nèi)源性化合物、異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)

相關(guān)的伴隨藥物）發(fā)生交叉反應(yīng)?？刹捎迷诳瞻谆|(zhì)樣品中添加研究樣品中最大

濃度的預(yù)期相關(guān)干擾物質(zhì)來考察。

應(yīng)考察加入最大濃度相關(guān)干擾物質(zhì)時，目標(biāo)待測物在LLOQ和ULOQ水平的

準(zhǔn)確度。添加相關(guān)干擾物質(zhì)的空白樣品的響應(yīng)應(yīng)低于LLOQ。存在相關(guān)干擾物質(zhì)

的情況下，目標(biāo)待測物的準(zhǔn)確度不應(yīng)超過標(biāo)示值的±25%。

當(dāng)存在非特異性干擾的情況下，應(yīng)在空白基質(zhì)中添加遞增濃度的相關(guān)干擾物

質(zhì)，考察目標(biāo)待測物在LLOQ和ULOQ水平的準(zhǔn)確度，來評估相關(guān)干擾物質(zhì)對分

析方法的影響。存在干擾時，需確定發(fā)生干擾時相關(guān)干擾物質(zhì)最低濃度。在生物

樣品分析過程中，應(yīng)采取適當(dāng)措施避免，例如，可能需要相應(yīng)地調(diào)整LLOQ/ULOQ

或考慮新方法。

在方法學(xué)開發(fā)和早期分析驗證期間，這些“相關(guān)干擾物質(zhì)”通常不可獲得。可

以在最初的方法學(xué)驗證完成后，再補充特異性驗證。

4.2.2選擇性

選擇性是指在樣品基質(zhì)中存在非特異性干擾成分時，分析方法檢測和區(qū)分目

標(biāo)待測物的能力?；|(zhì)中可能含有干擾目標(biāo)待測物檢測的非特異性成分，如降解

酶、異嗜性抗體或類風(fēng)濕因子。

應(yīng)評估低濃度水平的選擇性，因為在很多案例中，低濃度水平的分析會存在

選擇性的問題，但也建議在較高的待測物濃度水平下評估選擇性。因此，應(yīng)通過

向至少10個不同來源的空白基質(zhì)中，分別加入LLOQ和高濃度質(zhì)控水平的目標(biāo)待

測物來考察選擇性。在稀有基質(zhì)的情況下，可接受使用較少不同來源的空白基質(zhì)。

至少80%不同來源的空白樣品的響應(yīng)應(yīng)低于LLOQ的響應(yīng)。

至少80%不同來源中，目標(biāo)待測物標(biāo)樣樣品的LLOQ的準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的

±25%范圍內(nèi)，高濃度水平質(zhì)控的準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。

應(yīng)評估高脂基質(zhì)和溶血樣品中的選擇性（參考第321節(jié)）。對于高脂和溶血

樣品，可以使用單一來源的基質(zhì)分析一個批次來評估選擇性。應(yīng)在相關(guān)患者人群

（如腎或肝功能損傷患者、炎癥或免疫腫瘤患者，如適用）的樣品中評估選擇性。

在這種情況下，至少需要使用5名患者不同來源的基質(zhì)。

4.2.3校準(zhǔn)曲線和范圍

校準(zhǔn)曲線反映了待測物濃度與分析平臺響應(yīng)值之間的關(guān)系。校準(zhǔn)曲線由已知

濃度的待測物加入基質(zhì)中配制得到的構(gòu)成一定濃度范圍的校正標(biāo)樣組成。校正標(biāo)

樣應(yīng)使用與研究樣品相同的生物基質(zhì)制備。定量范圍由最低濃度的校正標(biāo)樣

LLOQ和最高濃度的校正標(biāo)樣ULOQ來定義。在方法學(xué)驗證期間，每一個待測物

的每一個分析批都應(yīng)有一條校準(zhǔn)曲線。如有需要，應(yīng)說明使用替代基質(zhì)的合理性。

校準(zhǔn)曲線應(yīng)至少由6個濃度水平的校正標(biāo)樣建立，包括LLOQ和ULOQ,以及

一個空白樣品?？瞻讟悠凡粦?yīng)參與校準(zhǔn)曲線參數(shù)的計算?？梢允褂脻舛鹊陀跇?biāo)準(zhǔn)

曲線LLOQ和高于ULOQ的錨定點樣品來改善曲線的擬合。如果上下漸近線附近

有數(shù)據(jù)點，則校準(zhǔn)曲線的響應(yīng)和濃度之間的關(guān)系通常由四參數(shù)或五參數(shù)logistic

模型來擬合，如果有合理的理由，也可采用其他模型進行擬合。

應(yīng)該在不同天內(nèi)評估至少6個獨立批次，以考察批次間的變異性。

每個校正標(biāo)樣回算濃度的準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)滿足：LLOQ和ULOQ水平的準(zhǔn)

確度和精密度在標(biāo)示值的±25%范圍內(nèi)，其他所有濃度水平的準(zhǔn)確度和精密度在

標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。在不包括錨定點的情況下，應(yīng)至少有75%,且至少6個濃

度水平的校正標(biāo)樣（包括LLOQ和ULOQ）符合上述標(biāo)準(zhǔn)。錨定點因超出校準(zhǔn)曲

線的定量范圍，可不要求滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。

建議校準(zhǔn)曲線采用新鮮配制的校正標(biāo)樣。如果不使用新鮮配制的校正標(biāo)樣，

則可在規(guī)定的穩(wěn)定期內(nèi)使用凍存的校正標(biāo)樣。

4.2.4準(zhǔn)確度和精密度

4.2.4.1質(zhì)控樣品的配制

質(zhì)控樣品旨在模擬研究樣品，通過在基質(zhì)中加入已知量的待測物來配制，并

在與預(yù)期研究樣品相同的條件下儲存和檢測，以評估分析方法的有效性。

用于配制質(zhì)控樣品的稀釋系列應(yīng)完全獨立于用于配制校正標(biāo)樣的稀釋系列。

如果儲備液的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性已得到驗證，，則可使用同一份儲備液（或工作儲

備液）來配制校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品。在校準(zhǔn)曲線定量范圍內(nèi)質(zhì)控樣品應(yīng)至少配制

5個濃度水平：LLOQ、LLOQ的三倍以內(nèi)（低濃度質(zhì)控）、校準(zhǔn)曲線定量范圍

幾何平均值附近（中濃度質(zhì)控）、ULOQ的75%以上（高濃度質(zhì)控）以及ULOQ。

對于非準(zhǔn)確度和精密度驗證分析批，可分析兩組低、中和高濃度QC樣品。

這些QC樣品連同校正標(biāo)樣將為接受或拒絕分析批提供依據(jù)。

4.2.4.2準(zhǔn)確度和精密度評估

準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過分析每一個分析批內(nèi)（批內(nèi)）和不同分析批間（批間）

的質(zhì)控樣品來確定。準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)使用同樣的分析批和數(shù)據(jù)來進行評估。

準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過在2天或2天以上的至少6個分析批中，對每一個質(zhì)控

濃度水平（LLOQ、低、中、高、ULOQ）至少重復(fù)分析3次來確定。報告的方法

驗證數(shù)據(jù)和準(zhǔn)確度及精密度的測定應(yīng)包括所有可獲得的結(jié)果，但明顯錯誤且記錄

在案的情況除外。應(yīng)報告每個分析批的批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度數(shù)據(jù)。如果不是所有

的分析批均符合批內(nèi)準(zhǔn)確度或精密度的接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)計算每一個濃度水平質(zhì)控

樣品的批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度的總體估計值。分析批之間（批間）精密度和準(zhǔn)確度

應(yīng)結(jié)合所有分析批的數(shù)據(jù)來計算。

除LLOQ和ULOQ（應(yīng)在標(biāo)示值的±25%范圍內(nèi)）外，每個濃度水平下的批內(nèi)

和批間總體準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。除LLOQ和ULOQ不應(yīng)超過25%

外，每一濃度水平質(zhì)控的批內(nèi)和批間精密度均不應(yīng)超過20%。

對于非準(zhǔn)確度和精密度驗證分析批，至少2/3的總質(zhì)控樣品和每個濃度水平

至少50%的質(zhì)控樣品應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。

止匕外，還應(yīng)評估總誤差（即準(zhǔn)確度（％）和精密度（％）誤差絕對值的總和））。

總誤差不應(yīng)超過30%（LLOQ和ULOQ的總誤差不應(yīng)超過40%）。

4.2.5殘留效應(yīng)

LBA一般不會出現(xiàn)殘留效應(yīng)的問題。但是，如果分析平臺有出現(xiàn)殘留的趨勢,

應(yīng)通過在ULOQ的校正標(biāo)樣之后放置空白樣品來考察殘留效應(yīng)的可能性?？瞻讟?/p>

品的響應(yīng)應(yīng)低于LLOQ。

4.2.6稀釋線性和鉤狀效應(yīng)

由于很多LBA的分析范圍狹窄，因此研究樣品的濃度可能需要稀釋后才能處

于定量范圍內(nèi)。對稀釋線性進行評估，以確定：（i）測量濃度在校準(zhǔn)曲線范圍

內(nèi)不受稀釋的影響，以及（ii）高于校準(zhǔn)曲線ULOQ的樣品濃度的準(zhǔn)確性不受鉤

狀效應(yīng)（即由高濃度待測物引起的信號抑制）的影響，以免產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。

應(yīng)使用與研究樣品相同的基質(zhì)來制備稀釋用質(zhì)控樣品。

稀釋線性采用稀釋質(zhì)控來驗證，即在基質(zhì)中加入高于ULOQ濃度的待測物，

分析未稀釋的樣品（用于鉤狀效應(yīng)），同時用空白基質(zhì)稀釋該樣品（至少3個不

同稀釋因子）至校準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)。至少用3個獨立配制的稀釋系列來考察每

一個稀釋因子，復(fù)孔數(shù)與樣品分析中的復(fù)孔數(shù)保持一致。通過稀釋質(zhì)控樣品驗證

是否存在響應(yīng)抑制現(xiàn)象（鉤狀效應(yīng)），如果觀察到該現(xiàn)象且不能通過合理的方式

來消除，則應(yīng)在研究樣品分析過程中采取措施減輕響應(yīng)抑制。

經(jīng)稀釋因子校正后，每個稀釋質(zhì)控樣品的計算平均濃度應(yīng)在標(biāo)示值的士20%

范圍內(nèi)，精密度不應(yīng)超過20%。

在研究樣品分析過程中應(yīng)用的稀釋因子應(yīng)在經(jīng)驗證合格的稀釋因子范圍內(nèi)。

4.2.7穩(wěn)定性

應(yīng)進行穩(wěn)定性評估，以確保樣品制備、處理和分析過程中的每一步驟以及儲

存條件不會影響待測物的濃度。

穩(wěn)定性試驗的儲存和分析條件，如樣品儲存時間和溫度、樣品基質(zhì)、抗凝劑

和容器材料，都應(yīng)反映實際研究樣品條件。僅用參考文獻報道的數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定