臍帶間充質干細胞制劑放行技術規(guī)范

1臍帶間充質干細胞制劑放行技術規(guī)范本文件規(guī)定了臍帶間充質干細胞制劑放行的要求、檢驗方法、檢驗規(guī)則和包裝、貯存、運輸。本文件適用于臍帶間充質干細胞制劑(以下簡稱干細胞制劑)的放行、檢驗。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T39729細胞純度測定通用要求流式細胞測定法GB/T39730細胞計數通用要求流式細胞測定法WS273梅毒診斷WS293艾滋病和艾滋病病毒感染診斷《中華人民共和國藥典》《全國臨床檢驗操作規(guī)程》3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1臍帶間充質干細胞umbilicalcordmesenchymalstemcell從人類臍帶結締組織中分離得到的，具有多向分化潛力，非造血干細胞的成體干細胞。[來源：《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則（試行）》，有修改]3.2干細胞制劑stemcellpreparation用于治療疾病或改善健康狀況的、以不同類型干細胞為主要成分、符合相應質量及安全標準，且具有明確生物學效應的細胞制劑。[來源：《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則（試行）》]4縮略語下列縮略語適用于本文件。CD：細胞膜表面分化抗原簇（ClusterofDifferentiation）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR：人類白細胞抗原DR等位基因（HumanLeukocyteAntigenDR）TP：梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）5要求5.1干細胞質量屬性5.1.1基本生物學屬性干細胞基本生物學屬性要求見表1。2表1干細胞基本生物學屬性細胞貼壁生長，亮度高，伸展呈長梭形，形態(tài)均一6>955.1.2微生物安全性干細胞微生物安全性要求見表2。表2干細胞微生物安全性5.1.3生物學有效性干細胞生物學有效性要求見表3。表3干細胞生物學有效性>955.2干細胞制劑配制干細胞制劑配制應符合附錄A的規(guī)定。6檢驗方法6.1基本生物學屬性6.1.1細胞形態(tài)貼壁培養(yǎng)條件下，使用倒置顯微鏡，在物鏡10倍或20倍下觀察。6.1.2細胞計數按照GB/T39730規(guī)定的方法檢測。6.1.3細胞活率按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》白細胞計數的方法檢測。6.2微生物安全性6.2.1細菌按照《中華人民共和國藥典》四部，通則1101無菌檢測法檢測。36.2.2真菌按照《中華人民共和國藥典》四部，通則1101無菌檢測法檢測。6.2.3支原體按照《中華人民共和國藥典》四部，通則3301支原體檢查法檢測。6.2.4內毒素按照《中華人民共和國藥典》四部，通則1143細菌內毒素檢查法檢測。6.2.5病毒6.2.5.1TP按照WS273附錄A.3規(guī)定的方法檢測。6.2.5.2HCV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢測。6.2.5.3HBV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢測。6.2.5.4HIV按照WS293附錄B.3規(guī)定的方法檢測。6.2.5.5新冠病毒參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》病毒核酸法檢測。6.3生物學有效性6.3.1細胞表型參照GB/T39729規(guī)定的方法檢測。6.3.2三系分化能力參照附錄B的方法檢測。7檢驗規(guī)則7.1放行檢驗7.1.1產品出廠前，應由制備機構的質量檢驗部門按本標準規(guī)定對每個干細胞制劑產品進行檢驗，檢驗合格，方可出廠。7.1.2檢驗項目：干細胞基本生物學屬性、微生物安全性和細胞表型。7.2型式檢驗7.2.1檢驗項目：5.1全部要求。7.2.2型式檢驗至少每年進行一次。有下列情況之一者，亦應進行：——原輔材料有較大變化時；——更換設備或停產后，重新恢復生產時；——出廠檢驗與上次型式檢驗結果有較大差異時；——國家市場監(jiān)督檢驗機構提出抽檢要求時。7.3判定規(guī)則任何一項指標檢驗不合格時，判該產品為不合格。8包裝、貯存、運輸8.1干細胞制劑應貯存于-150℃及以下的氣相或液相液氮中。8.2干細胞制劑運輸和轉運容器的材質應防漏、抗震、抗壓力變化。8.3運輸和轉運容器應定期進行驗證，并保持其處于有效運行狀態(tài)。8.4干細胞制劑在不同運輸時間條件下應符合以下要求：——2h內常溫運輸；——2h以上冷藏（2℃~8℃)運輸；——最長運輸時間不得超過24h。（規(guī)范性）干細胞制劑配制要求A.1用于配制干細胞制劑的中間細胞產品，代數應不少于四代，不超過六代。A.2干細胞制劑重懸液應按照經批準的配方進行配制和灌裝，其中白蛋白含量不得低于2%。6三系分化能力檢驗方法B.1成脂分化檢驗（油紅O染色法）B.1.1儀器和設備B.1.1.1二氧化碳培養(yǎng)箱。B.1.1.2顯微鏡。B.1.1.3血球計數板。B.1.1.4離心機。B.1.2試劑B.1.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.1.2.2消化酶。B.1.2.3間質干細胞完全培養(yǎng)基。B.1.2.4成脂誘導培養(yǎng)基。B.1.2.5油紅O染色液試劑盒。B.1.3檢測步驟B.1.3.1細胞消化將干細胞置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞融合度達到80%～90%。采用消化酶，根據消化酶說明書消化細胞。收集消化后的干細胞使用血球計數板及顯微鏡進行細胞計數，按照1×104個/cm2的細胞密度接種在事先包被基質膠的T25培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度100%。B.1.3.2細胞誘導吸除培養(yǎng)瓶中的干細胞完全培養(yǎng)基，按照成脂誘導培養(yǎng)基說明書的使用方法及誘導時間，誘導分化干細胞。B.1.3.3脂滴染色根據油紅O染色液試劑盒說明書進行脂滴染色。B.1.4結果分析顯微鏡下可見橙紅色的大小不等的脂滴。B.2成骨分化檢驗（茜素紅S染色法）B.2.1儀器和設備B.2.1.1二氧化碳培養(yǎng)箱。B.2.1.2血球計數板。B.2.1.3顯微鏡。B.2.1.4離心機B.2.2試劑B.2.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.2.2.2消化酶。7B.2.2.3間質干細胞完全培養(yǎng)基。B.2.2.4成骨誘導培養(yǎng)基。B.2.2.5茜素紅S染色液試劑盒。B.2.3檢測步驟B.2.3.1細胞消化將干細胞置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞融合度達到80%～90%。采用消化酶，根據消化酶說明書消化細胞。收集消化后的干細胞使用血球計數板及顯微鏡進行細胞計數，按照1×105個/cm2的細胞密度接種在事先包被基質膠的T25培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度60%～70%。B.2.3.2細胞誘導吸除培養(yǎng)瓶中的干細胞完全培養(yǎng)基，按照成骨誘導培養(yǎng)基說明書的使用方法及誘導時間，誘導分化干細胞。B.2.3.3鈣結節(jié)染色根據茜素紅S染色液試劑盒說明書進行鈣結節(jié)染色。B.2.4結果分析顯微鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結節(jié)。B.3成軟骨分化檢驗（阿爾新藍染色法）B.3.1儀器和設備B.3.1.1二氧化碳培養(yǎng)箱。B.3.1.2血球計數板。B.3.1.3顯微鏡。B.3.1.4離心機。B.3.2試劑B.3.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.3.2.2消化酶。B.3.2.3成軟骨誘導培養(yǎng)基。B.3.2.4阿爾新藍染色液試劑盒。B.3.3檢測步驟B.3.3.1細胞消化采用消化酶，根據消