臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑放行技術(shù)規(guī)范

1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑放行技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑放行的要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則和包裝、貯存、運(yùn)輸。本文件適用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑(以下簡(jiǎn)稱(chēng)干細(xì)胞制劑)的放行、檢驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T39729細(xì)胞純度測(cè)定通用要求流式細(xì)胞測(cè)定法GB/T39730細(xì)胞計(jì)數(shù)通用要求流式細(xì)胞測(cè)定法WS273梅毒診斷WS293艾滋病和艾滋病病毒感染診斷《中華人民共和國(guó)藥典》《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞umbilicalcordmesenchymalstemcell從人類(lèi)臍帶結(jié)締組織中分離得到的，具有多向分化潛力，非造血干細(xì)胞的成體干細(xì)胞。[來(lái)源：《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》，有修改]3.2干細(xì)胞制劑stemcellpreparation用于治療疾病或改善健康狀況的、以不同類(lèi)型干細(xì)胞為主要成分、符合相應(yīng)質(zhì)量及安全標(biāo)準(zhǔn)，且具有明確生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞制劑。[來(lái)源：《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》]4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。CD：細(xì)胞膜表面分化抗原簇（ClusterofDifferentiation）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV：人類(lèi)免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR：人類(lèi)白細(xì)胞抗原DR等位基因（HumanLeukocyteAntigenDR）TP：梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）5要求5.1干細(xì)胞質(zhì)量屬性5.1.1基本生物學(xué)屬性干細(xì)胞基本生物學(xué)屬性要求見(jiàn)表1。2表1干細(xì)胞基本生物學(xué)屬性細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，亮度高，伸展呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)均一6>955.1.2微生物安全性干細(xì)胞微生物安全性要求見(jiàn)表2。表2干細(xì)胞微生物安全性5.1.3生物學(xué)有效性干細(xì)胞生物學(xué)有效性要求見(jiàn)表3。表3干細(xì)胞生物學(xué)有效性>955.2干細(xì)胞制劑配制干細(xì)胞制劑配制應(yīng)符合附錄A的規(guī)定。6檢驗(yàn)方法6.1基本生物學(xué)屬性6.1.1細(xì)胞形態(tài)貼壁培養(yǎng)條件下，使用倒置顯微鏡，在物鏡10倍或20倍下觀察。6.1.2細(xì)胞計(jì)數(shù)按照GB/T39730規(guī)定的方法檢測(cè)。6.1.3細(xì)胞活率按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)。6.2微生物安全性6.2.1細(xì)菌按照《中華人民共和國(guó)藥典》四部，通則1101無(wú)菌檢測(cè)法檢測(cè)。36.2.2真菌按照《中華人民共和國(guó)藥典》四部，通則1101無(wú)菌檢測(cè)法檢測(cè)。6.2.3支原體按照《中華人民共和國(guó)藥典》四部，通則3301支原體檢查法檢測(cè)。6.2.4內(nèi)毒素按照《中華人民共和國(guó)藥典》四部，通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢測(cè)。6.2.5病毒6.2.5.1TP按照WS273附錄A.3規(guī)定的方法檢測(cè)。6.2.5.2HCV按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》核酸法檢測(cè)。6.2.5.3HBV按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》核酸法檢測(cè)。6.2.5.4HIV按照WS293附錄B.3規(guī)定的方法檢測(cè)。6.2.5.5新冠病毒參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》病毒核酸法檢測(cè)。6.3生物學(xué)有效性6.3.1細(xì)胞表型參照GB/T39729規(guī)定的方法檢測(cè)。6.3.2三系分化能力參照附錄B的方法檢測(cè)。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1放行檢驗(yàn)7.1.1產(chǎn)品出廠前，應(yīng)由制備機(jī)構(gòu)的質(zhì)量檢驗(yàn)部門(mén)按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定對(duì)每個(gè)干細(xì)胞制劑產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格，方可出廠。7.1.2檢驗(yàn)項(xiàng)目：干細(xì)胞基本生物學(xué)屬性、微生物安全性和細(xì)胞表型。7.2型式檢驗(yàn)7.2.1檢驗(yàn)項(xiàng)目：5.1全部要求。7.2.2型式檢驗(yàn)至少每年進(jìn)行一次。有下列情況之一者，亦應(yīng)進(jìn)行：——原輔材料有較大變化時(shí)；——更換設(shè)備或停產(chǎn)后，重新恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)；——出廠檢驗(yàn)與上次型式檢驗(yàn)結(jié)果有較大差異時(shí)；——國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)提出抽檢要求時(shí)。7.3判定規(guī)則任何一項(xiàng)指標(biāo)檢驗(yàn)不合格時(shí)，判該產(chǎn)品為不合格。8包裝、貯存、運(yùn)輸8.1干細(xì)胞制劑應(yīng)貯存于-150℃及以下的氣相或液相液氮中。8.2干細(xì)胞制劑運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)容器的材質(zhì)應(yīng)防漏、抗震、抗壓力變化。8.3運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)容器應(yīng)定期進(jìn)行驗(yàn)證，并保持其處于有效運(yùn)行狀態(tài)。8.4干細(xì)胞制劑在不同運(yùn)輸時(shí)間條件下應(yīng)符合以下要求：——2h內(nèi)常溫運(yùn)輸；——2h以上冷藏（2℃~8℃)運(yùn)輸；——最長(zhǎng)運(yùn)輸時(shí)間不得超過(guò)24h。（規(guī)范性）干細(xì)胞制劑配制要求A.1用于配制干細(xì)胞制劑的中間細(xì)胞產(chǎn)品，代數(shù)應(yīng)不少于四代，不超過(guò)六代。A.2干細(xì)胞制劑重懸液應(yīng)按照經(jīng)批準(zhǔn)的配方進(jìn)行配制和灌裝，其中白蛋白含量不得低于2%。6三系分化能力檢驗(yàn)方法B.1成脂分化檢驗(yàn)（油紅O染色法）B.1.1儀器和設(shè)備B.1.1.1二氧化碳培養(yǎng)箱。B.1.1.2顯微鏡。B.1.1.3血球計(jì)數(shù)板。B.1.1.4離心機(jī)。B.1.2試劑B.1.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.1.2.2消化酶。B.1.2.3間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。B.1.2.4成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。B.1.2.5油紅O染色液試劑盒。B.1.3檢測(cè)步驟B.1.3.1細(xì)胞消化將干細(xì)胞置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%。采用消化酶，根據(jù)消化酶說(shuō)明書(shū)消化細(xì)胞。收集消化后的干細(xì)胞使用血球計(jì)數(shù)板及顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照1×104個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種在事先包被基質(zhì)膠的T25培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度100%。B.1.3.2細(xì)胞誘導(dǎo)吸除培養(yǎng)瓶中的干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，按照成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基說(shuō)明書(shū)的使用方法及誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)分化干細(xì)胞。B.1.3.3脂滴染色根據(jù)油紅O染色液試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行脂滴染色。B.1.4結(jié)果分析顯微鏡下可見(jiàn)橙紅色的大小不等的脂滴。B.2成骨分化檢驗(yàn)（茜素紅S染色法）B.2.1儀器和設(shè)備B.2.1.1二氧化碳培養(yǎng)箱。B.2.1.2血球計(jì)數(shù)板。B.2.1.3顯微鏡。B.2.1.4離心機(jī)B.2.2試劑B.2.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.2.2.2消化酶。7B.2.2.3間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。B.2.2.4成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。B.2.2.5茜素紅S染色液試劑盒。B.2.3檢測(cè)步驟B.2.3.1細(xì)胞消化將干細(xì)胞置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%。采用消化酶，根據(jù)消化酶說(shuō)明書(shū)消化細(xì)胞。收集消化后的干細(xì)胞使用血球計(jì)數(shù)板及顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照1×105個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種在事先包被基質(zhì)膠的T25培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度60%～70%。B.2.3.2細(xì)胞誘導(dǎo)吸除培養(yǎng)瓶中的干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，按照成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基說(shuō)明書(shū)的使用方法及誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)分化干細(xì)胞。B.2.3.3鈣結(jié)節(jié)染色根據(jù)茜素紅S染色液試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色。B.2.4結(jié)果分析顯微鏡下可見(jiàn)散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。B.3成軟骨分化檢驗(yàn)（阿爾新藍(lán)染色法）B.3.1儀器和設(shè)備B.3.1.1二氧化碳培養(yǎng)箱。B.3.1.2血球計(jì)數(shù)板。B.3.1.3顯微鏡。B.3.1.4離心機(jī)。B.3.2試劑B.3.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.3.2.2消化酶。B.3.2.3成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。B.3.2.4阿爾新藍(lán)染色液試劑盒。B.3.3檢測(cè)步驟B.3.3.1細(xì)胞消化采用消化酶，根據(jù)消