《真核表達(dá)系統(tǒng)》課件

真核表達(dá)系統(tǒng)歡迎來(lái)到真核表達(dá)系統(tǒng)的深入探討。本課程將帶您了解基因表達(dá)的復(fù)雜機(jī)制，從基本概念到先進(jìn)應(yīng)用。讓我們開始這場(chǎng)分子生物學(xué)的奇妙旅程。什么是真核表達(dá)系統(tǒng)？定義真核表達(dá)系統(tǒng)是指在真核生物細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的復(fù)雜過(guò)程。組成部分包括DNA、RNA、核糖體以及各種調(diào)控因子。特點(diǎn)具有高度組織化和精細(xì)調(diào)控的特點(diǎn)，能夠產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)。真核基因結(jié)構(gòu)概述啟動(dòng)子控制基因轉(zhuǎn)錄的起始。外顯子編碼蛋白質(zhì)的序列。內(nèi)含子非編碼序列，在成熟mRNA中被剪切。終止子標(biāo)志轉(zhuǎn)錄結(jié)束的序列。基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程1起始RNA聚合酶II結(jié)合到啟動(dòng)子上。2延伸RNA聚合酶II沿DNA模板鏈移動(dòng)，合成RNA。3終止RNA聚合酶II遇到終止信號(hào)，釋放新生RNA。轉(zhuǎn)錄后修飾5'加帽在mRNA5'端加上甲基化的鳥嘌呤核苷酸。剪接去除內(nèi)含子，連接外顯子。3'多聚腺苷酸化在mRNA3'端添加多個(gè)腺嘌呤核苷酸。翻譯機(jī)制1起始小亞基識(shí)別起始密碼子。2延伸氨基酸按mRNA序列連接。3終止遇到終止密碼子，肽鏈釋放。mRNA結(jié)構(gòu)5'帽子保護(hù)mRNA免受降解，協(xié)助翻譯起始。編碼區(qū)包含蛋白質(zhì)編碼信息的序列。3'尾巴多聚A尾巴，增加mRNA穩(wěn)定性。核糖體結(jié)構(gòu)與功能大亞基包含肽基轉(zhuǎn)移酶活性中心，負(fù)責(zé)形成肽鍵。小亞基負(fù)責(zé)mRNA解碼，確保翻譯精確性。蛋白質(zhì)折疊與修飾1一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列。2二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋和β折疊。3三級(jí)結(jié)構(gòu)單體蛋白空間構(gòu)象。4四級(jí)結(jié)構(gòu)多個(gè)亞基組裝。蛋白質(zhì)分選與定位信號(hào)肽識(shí)別特定序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)定位?？缒み\(yùn)輸通過(guò)膜孔或載體蛋白運(yùn)輸。細(xì)胞器定位蛋白質(zhì)到達(dá)特定細(xì)胞器。細(xì)胞色素P450系統(tǒng)1定義一類重要的單加氧酶超家族。2功能參與藥物代謝、激素合成等。3機(jī)制通過(guò)氧化還原反應(yīng)修飾底物。4應(yīng)用藥物開發(fā)、毒理學(xué)研究。免疫球蛋白的表達(dá)基因重排V(D)J重組形成多樣性。B細(xì)胞分化從前體B細(xì)胞到漿細(xì)胞。分泌大量產(chǎn)生并分泌抗體。基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制1轉(zhuǎn)錄水平啟動(dòng)子活性、增強(qiáng)子、沉默子。2轉(zhuǎn)錄后水平RNA剪接、穩(wěn)定性調(diào)控。3翻譯水平翻譯起始效率、mRNA定位。4蛋白質(zhì)水平修飾、降解、亞細(xì)胞定位。逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)1病毒入侵病毒粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞。2逆轉(zhuǎn)錄RNA基因組轉(zhuǎn)化為DNA。3整合病毒DNA整合入宿主基因組。4表達(dá)利用宿主機(jī)制表達(dá)病毒蛋白?；蚬こ碳夹g(shù)概述DNA重組將外源基因插入載體。轉(zhuǎn)化將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。篩選鑒定含有目的基因的轉(zhuǎn)化體。表達(dá)誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。重組蛋白的表達(dá)策略選擇表達(dá)系統(tǒng)根據(jù)蛋白特性選擇合適宿主。優(yōu)化基因序列提高表達(dá)效率。設(shè)計(jì)表達(dá)載體包含強(qiáng)啟動(dòng)子和調(diào)控元件。優(yōu)化培養(yǎng)條件提高產(chǎn)量和質(zhì)量。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)生長(zhǎng)快速操作簡(jiǎn)單成本低廉局限性翻譯后修飾有限可能形成包涵體不適合復(fù)雜蛋白酵母表達(dá)系統(tǒng)快速生長(zhǎng)相對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，生長(zhǎng)周期短。翻譯后修飾能進(jìn)行糖基化等復(fù)雜修飾。分泌能力強(qiáng)可分泌表達(dá)目的蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)最接近人體的翻譯后修飾。應(yīng)用適合復(fù)雜蛋白和抗體生產(chǎn)。挑戰(zhàn)培養(yǎng)成本高，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。細(xì)胞株常用CHO、HEK293等細(xì)胞系。無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1提取物制備從細(xì)胞中提取轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)器。2反應(yīng)設(shè)計(jì)添加DNA模板和必要成分。3蛋白合成在體外環(huán)境中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯。4產(chǎn)物分析檢測(cè)和純化合成的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)活性檢測(cè)酶活性測(cè)定測(cè)量酶促反應(yīng)速率。結(jié)合實(shí)驗(yàn)評(píng)估蛋白質(zhì)與配體的相互作用。細(xì)胞功能分析觀察蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞的影響。蛋白質(zhì)純化技術(shù)沉淀分離利用溶解度差異初步分離。色譜分離基于分子大小、電荷等特性分離。親和層析利用特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)高純度分離。電泳分離基于分子量和電荷進(jìn)行分析和純化。蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)分子量分離蛋白質(zhì)。質(zhì)譜分析高精度測(cè)定蛋白質(zhì)確切分子量，可檢測(cè)修飾。結(jié)構(gòu)分析技術(shù)X射線晶體衍射提供高分辨率的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。核磁共振(NMR)分析溶液中蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡觀察大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。圓二色譜分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。真核表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用前景生物制藥生產(chǎn)復(fù)雜治療性蛋白和抗體?；蛑委熼_發(fā)新型基因遞送系統(tǒng)。合成生物學(xué)構(gòu)建人工細(xì)胞和組織。環(huán)境保護(hù)開發(fā)生物降解和污染處理技術(shù)。表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展趨勢(shì)1基因編輯CRISPR技術(shù)優(yōu)化宿主細(xì)胞。2合成生物學(xué)設(shè)計(jì)全新的表達(dá)系統(tǒng)。3人工智能優(yōu)化表達(dá)條件和蛋白設(shè)計(jì)。4微流控技術(shù)高通量篩選和優(yōu)化。案例分享重組人胰島素使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，改變了糖尿病治療。單克隆抗體利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，應(yīng)用于癌癥免疫治療。