分子生物學實驗原理課件

分子生物學實驗原理分子生物學實驗原理第一節(jié)分子生物學發(fā)展概述分子生物學實驗原理分子生物學molecularbiology是在分子水平上研究生物的結構、組織和功能的科學。1950年，Astbury在一次學術報告中，首次提出并使用了分子生物學這一名詞術語。廣義和狹義之分醫(yī)學分子生物學是應用分子生物學技術和理論來闡明人體正常生理活動和病理過程及其調控的分子機理。分子生物學實驗原理分子生物學理論與實際應用的成就理論方面1.關于腫瘤的發(fā)生：提出了腫瘤起源于細胞增殖和分化調控的失常和細胞同它周圍組織關系的紊亂。癌基因：100多種；抑癌基因：20多種細胞周期調控系統細胞凋亡端粒酶分子生物學實驗原理2.關于艾滋病AcquiredImmuneDeficiencySyndromeHIV序列；疫苗3.關于慢性病chronicdisease，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨質疏松，發(fā)現了相關基因及其多態(tài)性。4.關于生長、發(fā)育與進化的統一理論，也深入到了分子水平。分子生物學實驗原理實際應用方面1.轉基因植物目前已鑒定和克隆化的用于轉基因植物的基因有100多個。抗除草劑、抗昆蟲、抗病毒、抗不良環(huán)境因素（抗寒、抗鹽堿地、抗旱、抗?jié)常?、提高作物的產量、提高蛋白質含量、改善氨基酸構成等。分子生物學實驗原理2.轉基因動物

1983年，超級小白鼠，體重是正常鼠的2倍。隨后出現轉基因豬、羊、雞、兔、牛、鯉魚等。我國目前研究了金魚、鯉魚、圓頭魴。3.基因工程多肽藥物與疫苗

主要指DNA體外重組技術所研制的產品，轉基因動物和植物所研制的產品，以及蛋白質工程技術所研制或改進的產品。分子生物學實驗原理

4.基因診斷與基因治療

基因診斷genediagnosis是指通過直接探查基因的存在狀態(tài)或缺陷，從而對疾病作出診斷的方法。

目的物：DNA或RNA

方法：核酸分子雜交技術、PCR技術、

DNA芯片技術

疾病：遺傳性疾??；傳染病或感染性疾病分子生物學實驗原理基因治療genetherapy

指將正常的外源基因導入生物體靶細胞內，以彌補所缺失的基因，關閉或降低異常表達的基因，以達到治療疾病的目的。治療疾?。?/p>

遺傳病惡性腫瘤傳染病分子生物學實驗原理5.環(huán)境監(jiān)測與凈化areasurveyanddepollution

監(jiān)測：可檢測環(huán)境中的病毒和細菌凈化：改造細菌分解環(huán)境中的石油、殘留的農藥和有毒金屬6.克隆動物Cloneanimal1997年“多利”克隆羊

克隆器官（干細胞stemcell技術）分子生物學實驗原理7.人類基因組計劃humangenomeproject;HGP1990年，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）和美國能源部聯合發(fā)表了人類基因組計劃。30億個堿基對，估計有3萬～4萬個人類基因。2000年6月26日，首次繪成人類基因組“工作框架圖”。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6國科學家及領導人宣布人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計劃的所有目標全部實現。

分子生物學實驗原理

意義與“阿波羅”登月計劃相媲美1996年諾貝爾化學獎得主羅伯特·柯特認為，20世紀是物理學和化學的世紀，21世紀將是生物學的世紀。推動分子生物學更加快速地發(fā)展：蛋白質組學、代謝蛋白質組學、藥物蛋白質組學、毒物蛋白質組學、營養(yǎng)蛋白質組學及各種計劃分子生物學實驗原理對其他相關學科的影響1.向其他學科滲透2.形成了許多新興的邊緣學科

基礎醫(yī)學方面：腫瘤分子生物學、免疫分子生物學、神經分子生物學等

預防醫(yī)學方面：分子營養(yǎng)學、分子毒理學、分子流行病學、遺傳流行病學、人類基因組流行病學、公共衛(wèi)生遺傳學分子生物學實驗原理在預防醫(yī)學中的應用及發(fā)展方向1.慢性病的研究慢性病的發(fā)病原因絕大多數是基因與外界環(huán)境因素相互作用的結果。2.環(huán)境因素對人類遺傳物質損傷的研究及“三致”毒性的研究：生物標志物的研究和評價方法的建立3.環(huán)境監(jiān)測與污染物的凈化。分子生物學實驗原理4.遺傳病的產前診斷（基因型預防）及早期診斷（表型預防）。5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。6.對環(huán)境因素敏感基因及易感人群的研究環(huán)境基因組計劃（環(huán)境基因組學）

（1）環(huán)境應答反應基因（2）篩選多態(tài)性及易感性（3）根據易感性制定不同的干預計劃分子生物學實驗原理一、分子生物學一些重要的理論知識1.分子生物學發(fā)展史上一些重要的事件（1）1865年，“遺傳學之父”G.Mendel根據豌豆雜交試驗結果，創(chuàng)立了遺傳因子學說，即遺傳的分離律和自由組合律。（2）1903年W.Sutton提出染色體是Mendel遺傳單位的載體的概念。（3）1909年，W.Johannsen將這種在染色體上的遺傳單位定名為基因（gene）。分子生物學實驗原理（4）1910年，現代實驗遺傳學奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蠅的遺傳規(guī)律時發(fā)現了基因的連鎖律和交換律。（5）1944年，OT.Avery等人（3人）分離出細菌DNA，并發(fā)現DNA是攜帶生命遺傳物質的分子。（6）1950年，Astbury在一次演講中，首次使用了“分子生物學”術語。（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA結構的雙螺旋模型，揭示了遺傳物質自我復制的機制。分子生物學實驗原理（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick等人破譯了DNA遺傳密碼，1966年破譯了64個遺傳密碼。提出了遺傳信息由DNA→RNA→蛋白質傳遞的中心法則。

（9）1969年，JonathanBeckwith及其同事在哈佛大學成功分離出第一個基因。（10）1970年，發(fā)現了逆轉錄酶。（11）1961年，F.Jacob和J.Monod提出了乳糖操縱子學說。分子生物學實驗原理（12）自1946年起的20年當中，陸續(xù)發(fā)現了許多質粒；1968年至1970年又發(fā)現了許多限制性內切酶，為DNA體外重組提供了有利工具。（13）1973年，重組DNA技術問世。（14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技術（15）1990年，人類基因組計劃。分子生物學實驗原理

2.三個重要理論importanttheory(1)DNA的結構、復制、中心法則基本構成單位是核苷酸核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸構成。堿基分別是腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。相鄰的兩個核苷酸以磷酸二酯鍵相連進一步盤旋、折疊，形成三級或四級結構分子生物學實驗原理RNA與DNA有如下不同點：五碳糖為核糖(不是脫氧核糖)；堿基中有尿嘧啶U(uracil)而沒有胸腺嘧啶RNA為單鏈，不是雙鏈，但RNA單鏈之間相鄰的堿基可由氫鍵作用形成局部雙鏈。DNA存在于細胞核的染色體、線粒體以及染色體以外的質粒中(質粒是一些雙鏈，閉環(huán)的DNA分子)。分子生物學實驗原理

DNA(或RNA)結構給我們的啟示

①DNA(或RNA)是水溶性的。這是由于含有磷酸基因、羥基和氨基。在核酸提取過程中，我們保留的是水相、而不是有機相。②核酸是兩性電離，既帶正電荷，又帶負電荷。它的等電點(PI)為2～2.5。在中性溶液中帶負電荷。對核酸進行電泳時，點樣時應點在負極；雜交時選擇尼龍膜時，最好選擇帶正電荷的尼龍膜。(核酸帶負電荷，容易吸附到帶正電荷的膜上，牢固，不掉)

分子生物學實驗原理③DNA在細胞中存在部位不同(細胞核、線粒體、質粒)，所以應注意提取方法的不同

④由于DNA空間構象不同，在電泳時遷移率不同。⑤根據堿基互補配對原則，可設計引物和探針雜交。⑥由于DNA的雙螺旋結構和RNA易由于分子內氫鏈作用形成二級結構，所以在進行雜交等反應時，首先應加熱變性，破壞二級結構。分子生物學實驗原理

在解旋酶的作用下，打開DNA雙鏈在特定的復制起始點以每條DNA鏈為模板在DNA聚合酶的催化下以4種脫氧核苷酸為前體物，合成一條互補DNA鏈。DNA的復制雙稱為半保留復制。DNA的復制分子生物學實驗原理DNA半保留復制分子生物學實驗原理DNA在復制起始點，由解旋酶打開雙鏈，形成復制叉，合成新鏈的方向為5’-3’端前導鏈與后隨鏈后隨鏈的合成是不連續(xù)的。先合成RNA引物再合成不連續(xù)的小片段(岡崎片段，100～1000核苷酸長度)

最后在DNA連接酶作用下，將小片段連接起，形成完整的DNA鏈。

分子生物學實驗原理DNA半不連續(xù)復制分子生物學實驗原理DNA的復制給了我們一些啟示①PCR技術的原理：在體外要靠溫度(90℃以上)打雙鏈，而不是解旋酶，也是以DNA為模，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP為前體。PCR與體內(細胞內)DNA復制的最大差異是溫度。②檢測核分裂指數：在細胞培養(yǎng)中，加入3H標記的dNTP前體物，被細胞攝取后，參與DNA復制，復制速度越快，參入的3H標記的dNTP越多，可用液閃計數儀檢測放射性強度，據此判斷。分子生物學實驗原理遺傳信息的傳遞是：

DNA→RNA→多肽(蛋白質)在逆轉錄酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA→蛋白質以上就是完整的中心法則理論，亦可稱為基因的表達(expression)。中心法則分子生物學實驗原理中心法則分子生物學實驗原理

轉錄(transcription)

以DNA為模板，合成RNA的過程。

非模板鏈稱為有意義鏈，而模板常稱為反義鏈。轉錄的過程大致是這樣的：以DNA一條鏈為模板，誘導RNA聚合酶活性、RNA聚合酶識別并結合在轉錄起始位點以ATP、GTP、CTP和UTP為前體，合成(轉錄)RNA

當遇到轉錄終止信號時，轉錄即停止。分子生物學實驗原理有意義鏈反義鏈分子生物學實驗原理轉錄后的初級產物剪切掉內含子，并將外顯子連接起來，這樣才能變成成熟的RNA分子還需要在5’-端加一個特殊的核苷酸，7-甲基鳥嘌呤核苷酸，這個過程叫戴帽另外，mRNA的，這一過程又叫穿靴，3’-端還要加上一串腺苷酸(AMP)poly(A)或多聚腺苷酸化。同一機體不同的細胞具有相同的DNA或基因，但基因在不同細胞的表達是不同的，具有組織特異性，使不同的細胞具有不同的功能分子生物學實驗原理由RNA→蛋白質的過程，又叫翻譯。只有聚合酶II催化的反應產物是mRNA，而只有mRNA才翻譯成蛋白質。基因(DNA)上三個相鄰的堿基組成一個密碼子，一個密碼子決定一種特定的氨基酸，共有43=64個密碼子。在轉錄過程中，基因上的三聯密碼子轉錄成mRNA上的三聯密碼子。mRNA由核內轉移至細胞漿中的核糖體上，以三聯密碼子指導合成蛋白質。翻譯后的蛋白質需要加工修飾。分子生物學實驗原理中心法則給了我們一些啟示：①遺傳信息由DNA上的基因決定。一旦基因發(fā)生突變，將最終導致所翻譯的蛋白質發(fā)生改變，從而導致生理功能改變，甚至出現疾病，如癌癥、肥胖等。②mRNA更能準確簡便地反映DNA上基因所攜帶的遺傳信息。因此對基因序列的分析，常分析mRNA的序列即可。分子生物學實驗原理

③基因的表達有組織特異性，且受許多因素的影響，使mRNA的表達增強、降低甚至關閉，從而影響機體正常生理功能，甚至出現疾病。因此常需要檢測mRNA的表達的豐度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Realtime)PCR等。這里需要特別強調：在檢測mRNA(或蛋白)表達時，一定要先弄清該基因在某種組織中是否有表達。分子生物學實驗原理

④根據中心法則，可以RNA為模板，在逆轉錄酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。⑤根據mRNA的3’端有poly(A)的特點，在進行反轉錄時，就以poly(A)為模板設計了引物。并且純化mRNA的方法，也是根據poly(A)的原理設計的。⑥根據最后的翻譯蛋白質去向的不同，建立不同的蛋白質提取方法，如在線粒體，在細胞核、在細胞漿、分泌到血液中。分子生物學實驗原理（2）基因表達調控以乳糖操縱子學說為例

乳糖操縱子的基本組成元件

調節(jié)基因結構基因

I

P

O

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ抑制基因(I)：是阻遏物編碼區(qū)啟動基因(P)：有cAMP受體蛋白(CRP)和RNA聚合酶的結合位點操縱基因(O)：是阻遏物結合位點Ⅰ

：β-半乳糖苷酶結構基因Ⅱ：透過酶結構基因Ⅲ：轉乙酰酶的結構基因分子生物學實驗原理調節(jié)方式

當乳糖↑時,cAMP含量增高↑→cAMP與CAP(分解產物激活劑蛋白)結合成CRP該復合物與啟動基因上對應的位點結合后使DNA雙鏈不穩(wěn)定；隨后RNA聚合酶則容易與啟動基因緊密結合；若此時操縱基因上無阻遏物，則基因被打開RNA聚合酶從DNA的5’端開始滑動，即開始轉錄，并合成了3種酶。分子生物學實驗原理當葡萄糖↑→cAMP↓→CRP↓RNA聚合酶則不能與啟動基因結合，也就不能轉錄和合成3種酶。抑制基因轉錄和翻譯成阻礙蛋白，并與操縱基因結合,阻止RNA聚合酶滑動而抑制轉錄。這種情況又稱為負調節(jié)如果阻遏蛋白與誘導物結合(此處為乳糖)。則這個復合物不能與操縱基因結合，轉錄和翻譯就能進行。

分子生物學實驗原理操縱子學說擴大了基因的概念。即結構基因和調節(jié)基因調節(jié)基因發(fā)揮正、負調節(jié)受細胞內外環(huán)境因素的影響。形成了基因調控和表達的概念。基因表達調控理論，不僅有助于理解生命現象的本質，而且對基因工程的建立是至關重要。

分子生物學實驗原理

（3）DNA重組(基因工程)基因工程的兩個重要工具：一是內切酶，能特異地識別DNA的堿基序列，并在DNA鏈當中將DNA切開。二是載體，如質粒、噬菌體、病毒。載體的共同特點：

環(huán)狀DNA；都能專一感染某一類細胞；具有某種選擇性標記；都具有一些內切酶位點；都能隨著染色體的復制而復制，隨著細胞分裂而擴增。

分子生物學實驗原理基因工程的基本程序：①取得所需要的目的基因；②將目的基因同載體連接；③再將這個重組環(huán)狀DNA引入受體細胞(或稱寄主細胞)；④使目的基因得以表達，即基因轉錄和翻譯成蛋白質。分子生物學實驗原理第二節(jié)核酸的提取技術

extractivetechniqueofnucleicacid

分子生物學實驗原理

1.結合狀態(tài)

2.形態(tài)：分線形和環(huán)形；分雙鏈和單鏈

3.分布：

DNA分布在細胞核和細胞；

RNA分布在細胞質、細胞核和細胞器（一）核酸在細胞中的存在狀態(tài)和分布分子生物學實驗原理（二）核酸分離提取的原則、要求

1.原則：(1)應保證核酸一級結構的完整性；

(2)排除其它分子的污染，純度要高。

2.對于核酸純度的要求：

(1)對于核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；

(2)其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子污染應降低到最低程度；

(3)排降其它核酸分子的污染，如提取DNA時，應去除RNA，反之亦然。

分子生物學實驗原理3.注意事項

(1)盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞(2)減少化學因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進行。分子生物學實驗原理(3)減少物理因素對核酸的降解。物理因素主要是機械剪切力，其次是高溫。機械剪切力主要來源于溶液的快速振蕩，攪拌等。常規(guī)操作溫度為0～4℃。(4)避免生物因素對核酸的降解。細胞內外均存在核酸酶，尤其是RNA酶存在廣泛、穩(wěn)定，極易降解核酸。因此提取過程中，應注意采用核酸酶抑制劑和破壞方法。分子生物學實驗原理

(三)DNA的提取、純化

真核細胞染色體DNA的制備(提取、純化)

根據不同的實驗要求，可有不同的DNA提取方法，如酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃棒纏繞法，異丙醇沉淀法等。但這些方法在基本原理及大致步驟上是基本相同的。而且酚抽提法比較經典常用，下面就以此方法為例進行介紹。分子生物學實驗原理

酚抽提法

酚抽提法的基本原理：用SDS和蛋白酶K破壞和消化細胞用酚去除水相中的蛋白質等大分子物質通過鹽和乙醇沉淀獲得DNA。

分子生物學實驗原理試劑：

1磷酸鹽緩沖液PBS2DNA抽提緩沖液：

10mmol/LTris.cl(緩沖溶液的pH值，pH8.0)。

0.1mol/LEDTA(金屬離子絡合劑，可抑制DNA聚合酶活性)。

20μg/ml胰RNA酶(破壞降解RNA)0.5%SDS(表面活性劑，破壞細胞)

。蛋白酶K(消化細胞、破壞細胞)分子生物學實驗原理3．20mg/ml蛋白酶K，消化細胞，破壞細胞4．酚（用0.5mol/LTris·Cl，pH8.0飽和），主要作用是沉淀蛋白質等5．10mol/LNH4Ac，其作用是沉淀DNA6．乙醇，其作用是沉淀DNA7．TE（Tris和EDTA混合液），是溶解保存DNA的最好溶液8．透析液：

50mmol/LTris·Cl，pH8.010mmol/LEDTA，pH8.0分子生物學實驗原理

樣品前處理

(1)生物組織：新鮮的生物組織，先用剪切刀清除組織中筋膜等結締組織，吸干血液。若不能馬上進行DNA提取，可將生物組織貯存于液氮中或-70℃冰箱中。a.取1～3g左右的組織，用8層紗布包好，外層再包多層牛皮紙，浸入液氮中使組織結凍，取出后用木錘將其敲碎。b.將敲碎的組織放入搪瓷研缽中，加入少許液氮，用研杵碾磨。需反復添加液氮。分子生物學實驗原理C.在離心管中加入10mlDNA抽提液，用玻璃棒邊攪動邊加入組織粉末，然后37℃保溫1小時。(先加抽提液，后加組織粉末，有利于充分溶解，用玻璃棒而不用金屬棒，減小損傷DNA的機率，37℃保溫1小時，一方面有利于SDS破壞細胞，更主要是為了使溶液平衡溫度達到37℃，為下一步反應準備適宜條件)。

分子生物學實驗原理(2)培養(yǎng)的細胞

a.收集細胞，懸浮培養(yǎng)(生長)的細胞；可以直接經1500g離心(4℃,10分鐘)，以收集細胞；貼壁生長的細胞，用胰酶消化后再離心收集。細胞數應在5×107左右。

b.漂洗細胞，將離心沉淀的細胞用冰預冷的PBS液或生理鹽水，漂洗1次再離心，棄上清收集細胞。可重復漂洗1-2次(目的去除培養(yǎng)液成分和細胞分泌的蛋白)

c.保溫，再用10mlDNA抽提液將細胞沉淀懸浮，并在37℃保溫1小時。分子生物學實驗原理

(1)消化向上述預處理好的樣品溶液中(樣品溶解在DNA抽提液并保溫1小時)，加入20mg/ml的蛋白酶K，至終濃度為100μg/ml，邊加邊用玻璃棒輕輕攪拌，使溶液至粘稠狀(細胞破裂，蛋白、核酸釋放)。將反應液在50℃水浴上，保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應不時輕輕搖勻反應液。

DNA提取步驟分子生物學實驗原理(2)加酚混勻將反應液冷卻至室溫，加入等容積已飽和的酚溶液，輕輕地上下轉動離心管，混勻兩相，反復該動作10min，直至水相與酚相混勻并成乳狀液。若沒有達到這種效果，可用多角度振蕩器溫和地混勻1小時(3)離心室溫5000g，離心15min，使兩相分開(水相在上層，酚相在下層)，(DNA在水相，因水溶性，帶負電荷)。(4)取上層水相用酚重復抽提兩次，取上層水相時，應用大口徑(0.3cm)吸管，因水相粘稠

分子生物學實驗原理(5)又分兩種情況

a.透析處理：為提取大分子量DNA(200Kb以上)，在第3次酚抽提后，將DNA溶液裝入透析袋中，并放入4℃透析液中。每次透析液1升，換4次透析液，直至透析物OD270小于0.05，才算透析完畢。b.沉淀處理，對于100～150Kb大小的DNA提取，在第三次酚抽提后，將上層水相移入一個新的離心管中，加入0.2倍容積的10mol/L乙酸銨和2倍容積95%乙醇。室溫下輕輕搖動，立刻就可看到乳白色絲狀沉淀出現，用一個前端為鉤狀的玻璃棒(挑)出DNA纖維，立即放入70%乙醇中漂洗2次。室溫5000g，離心5min，棄上清。室溫下揮發(fā)殘留乙醇。但注意不要使DNA沉淀完全干燥。然后加TE(pH8.0)溶解DNA12～24h

。分子生物學實驗原理(6)測定樣品在260nm和280nm的OD值，計算DNA含量和A260/A280比值。

260nm處，是核酸的最大吸收波長，在280nm處是蛋白質最大吸收波長。在260nm紫外線下，1OD的光密度值相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA或RNA為40μg/ml。因此根據核酸的OD值，計算核酸樣品的濃度或含量。分子生物學實驗原理根據A260/A280比值，可判斷所提取核酸(DNA)的純度。DNA純度比較理想的比值是1.8，RNA比值是2.0。若DNA比值高于1.8，說明有RNA的污染，低于1.8或1.75，則認為是蛋白質或酚污染。RNA比值小于2.0，則認為也是蛋白質或酚的污染。DNA樣品純度不符合要求(尤其是A260/A280比值小于1.8時)

可用酚或酚/氯仿和氯仿抽提2-3次，用乙醚除去殘留氯仿，再揮掉乙醚。最后用鹽和乙醇沉淀，用TE溶解。分子生物學實驗原理

本方法需要說明的幾點：(1)5×107細胞提取產量為200μg左右。(2)對于上層水相比較粘稠，吸取上層水相時，會牽動兩相之間的蛋白質沉淀層。此時可用吸管插到管底吸取酚相(采用負壓)，至蛋白質層時，停止。并離心(5000g,20分鐘)，沉淀蛋白質，吸取上清液。(3)由于0.5%SDS的存在，可抑制部分胰RNA酶活性，故應加大該酶用量，一般為20μg/ml(4)所用酚，應重蒸酚，并用水飽和。分子生物學實驗原理（四）RNA的分離與純化1.創(chuàng)造一個無RNA酶(RNase)的環(huán)境RNA酶在環(huán)境中無處不在：空氣中灰塵、微生物，人體汗液、唾液，以及各種器皿和試劑等，均存在RNase。RNase非常穩(wěn)定，耐熱、耐酸，耐堿。蛋白質變性劑可使之暫時失活。RNase活性不需要輔助因子，因此EDTA對此酶無抑制作用。分子生物學實驗原理

(1)去除外源性RNase的污染①空氣中的細菌、霉菌等微生物都含有RNase，所以整個操作過程應在比較清潔的環(huán)境中進行。因此有必要對操作場所的空氣進行消毒。②操作者操作應戴口罩和手套、帶帽子。③玻璃器皿常規(guī)洗凈后，應用0.1%DEPC(二乙基焦碳酸鹽)浸泡處理(37℃，2h)，再用滅菌去離子水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4h以上或200℃干烤過夜。分子生物學實驗原理④塑料器材最好使用滅菌的一次性塑料用品。Eppendorf管，微量加樣吸頭最好是新的，使用前進行高壓消毒。⑤所有溶液應加DEPC至0.05-0.1%，室溫過夜，然后高壓消毒。以去除殘留的DEPC。⑥RNA提取所用的酚，應單獨配制和使用。配制飽和酚鹽溶液時，使用的水應預先以DEPC處理且高壓消毒，酚飽和以后，加入8-羥基喹啉至0.1%。8-羥喹啉不但抗氧化，而且有一定的RNA酶抑制作用。

分子生物學實驗原理DEPC的分子式為C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5二乙基焦碳酸鹽。是一種粘性液體，對核酸酶有很強的抑制作用。作用機制是通過與蛋白質中的組氨酸結合，使蛋白質變性。DEPC又能與RNA或單鏈DNA反應，破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤，但它破壞單鏈核酸的濃度要比使蛋白質變性的濃度大100-1000倍。使用DEPC的一個原則是，在達到使用目的后，一般要高溫處理以便破壞除掉DEPC，使DEPC不與RNA接觸。分子生物學實驗原理DEPC可與Tris發(fā)生反應，分解成CO2和乙醇，使pH值下降（所以要去除）配制Tris溶液時，先將所用水用DEPC處理高壓消毒配完Tris溶液后，再經高壓消毒。DEPC與肝素聯合使用，增強使用效果。DEPC應在4℃或液氮中保存，以防降解。分子生物學實驗原理

(2)抑制內源性RNase的活性。細胞裂碎的同時，RNase釋放出來。原則上應盡早去除細胞內蛋白，加入RNase抑制劑，力爭在提取的起始階段對RNase活力進行有效地抑制。不同組織細胞中內源性RNase的數量不同，胰腺、脾組織細胞中RNase的含量極為豐富，在對這些組織提取RNA時，更要使用強有力的RNase抑制劑。

分子生物學實驗原理抑制劑可分為以下幾類：

①低特異性RNase抑制劑，如皂土、復合硅酸鹽、肝素、多胺等，因作用較弱，現已不大使用。②去除蛋白質物質

蛋白質變性劑，蛋白K、陰離子去污劑，常與RNA酶抑制劑聯合使用，以加強對RNase的抑制作用。凡能破壞蛋白質的物質，對RNase均有一定作用，因為酶本身就是蛋白質。

分子生物學實驗原理a.酚、氯仿這類有機溶劑不但能使核蛋白與核酸解聚(但不能破壞核酸)，而且對蛋白質有變性作用。因而對酶(RNase)有抑制作用。酚不能完全抑制RNase活性，但酚一般都加入了8－羥基喹啉(一種抗氧化劑，一種指示劑)，因而加強了對RNase的抑制效果。氯仿的抑制效果比較強，因此酚與氯仿常聯合使用。

蛋白酶K也能抑制RNase活性。有一種情況挺特殊，即該酶在1－2％的SDS存在下，其活性反而會增加。分子生物學實驗原理

b.去污劑包括SDS(十二烷基硫酸鈉)，十二烷酰肌氨酸鈉，脫氧膽酸鈉等陰離子去污劑。這些陰離子去污劑可使核酸與蛋白質解聚，并可與蛋白質側鏈上帶正電荷的基團結合，在高濃度KCl存在下，形成SDS－蛋白質復合物而沉淀。

c.解偶劑（胍類）鹽酸胍，異硫氰酸胍，作用非常強的一種蛋白變性劑，可完全破壞蛋白質二級結構，從而使細胞結構降解，核酸與核蛋白分離，所以又稱解偶劑。分子生物學實驗原理

③RNase的特異抑制劑a.RNase阻抑蛋白(RNasin)，是一種酸性糖蛋白可與RNase以非共價鍵的形式結合，從而抑制RNase活性，RNasin最好不與蛋白質變性劑一同使用，因變性劑亦可破壞RNasin，從而使其喪失作用。但可與二巰基乙醇一同使用，可增強RNasin的使用效果。b.氧釩核糖核苷復合物，這也是一種RNase特異性抑制劑，幾乎可完全抑制RNase的活性。為達到完全、徹底抑制RNase活性的目的，常聯合使用，而且有些抑制劑(去除蛋白質物質)一般有4種作用；破壞細胞膜，使核酸與蛋白質分離，沉淀蛋白質、抑制RNase活性。因此幾乎包括了RNA提取、分離、純化的所有目的。分子生物學實驗原理

2.RNA的分離、提取方法步驟：

(1)創(chuàng)造一個無RNase環(huán)境；

(2)組織或細胞的勻漿，同時得加入RNase抑制劑

(3)裂解細胞；

(4)去除蛋白、DNA等大分子物質；

(5)沉淀RNA；

(6)漂洗；

(7)溶解RNA。

分子生物學實驗原理

酚：使核酸與核蛋白分離、變性沉淀蛋白質，抑制RNase活性。異硫氰酸胍：破壞裂解細胞，使核酸與核蛋白分離，變性沉淀蛋白質，同是具有很強的RNase抑制作用。這是一個關鍵的試劑，由于它是萬能的，所以實驗步驟變得簡單。Trizol試劑盒所提供的試劑：分子生物學實驗原理自己需要配制的試劑氯仿：蛋白質變性作用，增強對RNase抑制作用。異丙醇：沉淀RNA。75％乙醇：漂洗、去除鹽、殘留有機溶劑等雜質。無RNase水或0.5%SDS溶液(后者較好)(必須用DEPC處理)。分子生物學實驗原理

①勻漿化

a.組織：取50-100mg組織放在勻漿管中，加1mlTrizol試劑，然后進行勻漿，此時裂解細胞和RNase抑制同時進行。

b.貼壁生長細胞：倒掉培養(yǎng)液，然后直接向培養(yǎng)瓶(皿)中加入Trizol試劑(按10cm2加1mlTrizol試劑計算加入量)。

c.懸浮生長細胞：離心收集細胞，然后加入Trizol試劑（按5～10×106或1×107細菌加入1ml比例計算加入量)。操作步驟分子生物學實驗原理②兩相分離將勻漿化的樣品在15℃～30℃環(huán)境中放置5min，以便核酸蛋白復合物充分解聚。（加Trizol試劑之前，樣品一定要保持低溫，防止RNase

發(fā)揮作用，在研磨過程中可加液氮）然后按每1mlTrizol試劑加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿。蓋緊試管蓋，用手劇烈振蕩15秒，之后在15

～30℃條件保溫2～3min。離心：12000g離心15min，離心時溫度要控制在2℃～8℃。（12000g離心是一個關鍵步驟，也是該方法獨到之處，可將蛋白質，DNA等大分子沉淀)。離心之后，就會形成三相：下層是紅色的酚和氯仿（含有蛋白質和DNA）；中間層是白色的DNA和蛋白質沉淀；上層是水相，RNA就在此層，水相大約占總體積的60％分子生物學實驗原理

③RNA沉淀將水相轉移到一個新的試管中，并加入異丙醇混勻，加入量按每mlTrizol試劑加0.5ml異丙醇計。在15～30℃條件下，保溫10min。然后在2～8℃條件下，12000g離心10min，此時就會在管底或底部邊上出現RNA沉淀，離心之前，RNA沉淀通常看不見，離心之后常常可看見膠樣沉淀。④RNA漂洗移去上清液，加入75％乙醇至少1ml，渦旋振動幾次，然后以7500g離心5min(溫度2

～8℃)，又可形成RNA沉淀，并移去上清液。分子生物學實驗原理

⑤重新溶解RNA

將RNA沉淀在空氣中放量5～10min，以便揮發(fā)掉殘留的乙醇。注意干燥時間不宜太長，以防RNA完全干燥。完全干燥的RNA很難溶解。最后用無RNase水或0.5％SDS溶液溶解RNA，并用移液管吹打幾次，并在55℃

～60℃保溫10min，以便使RNA完全溶解。

分子生物學實驗原理⑥判定純度和計算含量，用紫外分光光度計測量溶液的吸光度質（A）。A260/280在1.6～1.8之間表明比較純凈，符合實驗要求。1OD值＝40μgRNA,據此再計算RNA含量。分子生物學實驗原理

一般來講，該方法可從1mg組織中提取的RNA含量分別為：肝和脾為6～10μg；腎3～4μg，肌肉和腦為1～5μg，胎盤1～4μg。對培養(yǎng)的細胞來講，1×106個上皮細胞中可提取8～15μg，成纖維細胞5～7μg。用Trizol試劑盒法提取的RNA，基本上可滿足所有實驗的需要，如Northernblot，斑點雜交，mRNA分離、體外翻譯，分子克隆等。該方法操作簡便，提取的RNA完整，整個提取過程僅需1h，故現在廣泛使用。分子生物學實驗原理第三節(jié)核酸分子雜交技術

分子生物學實驗原理

1.探針的概念：在化學及生物學意義上的探針(Probe)，是指能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用的分子，并可被特殊的方法所探知(檢測到)。所謂核酸分子探針則是指特定的已知核酸片段，并帶有標記物，能與互補核酸序列退火雜交，因此可以用于待測核酸樣品中特定基因順序的探測（可定性、定量）。(一)探針的概念、種類及其選擇、探針的標記分子生物學實驗原理2.探針的種類、選擇及特點種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針選擇：寡核苷酸探針寡核苷酸探針是指人工合成的短鏈核苷酸片段，并帶有標記物特點：人為控制，雜交時間短，特異性高，可以用于點突變檢測；缺點是靈敏度低

分子生物學實驗原理

設計寡核苷酸探針應遵循的（以下）幾個原則：

①探針長度：一般要求10～50bP。過短則特異性降低，過長，則合成困難、雜交時間延長，亦會出現非特異性雜交。應不短不長。（一般20bp）

②

G：C堿基對含量應占40～60％；過少，則不易雜交，或雜交雙鏈不穩(wěn)定；過多，則會產生非特異性雜交，應不多也不少。（一般AT、GC各占50%）

③探針內部的互補堿基對不應大于4bP，否則會形成探針內部的“發(fā)夾”結構。

④同一堿基的連續(xù)出現次數不應超過4次。

⑤探針設計完后，最好利用基因庫軟件進行分析，并與已知的各種基因序列進行同源性比較，如果該探針與非目的基因序列有70％以上的同源性，或連續(xù)有8個以上的堿基序列相同，則應重新設計探針序列。分子生物學實驗原理3.探針的標記物與標記

標記物：放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I

非放射性標記物：半抗原（生物素、地高辛）；配體；熒光素；化學發(fā)光物分子生物學實驗原理

根據待測核酸分子存在的部位不同，可分固相雜交（膜上印跡雜交、細胞原位雜交）和液相雜交。其中膜上印跡雜交應用廣泛。

膜上印跡雜交是指將待測核酸序列片段結合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標記的核酸探針進行雜交的過程。

（二）雜交分子生物學實驗原理

首先用凝膠電泳方法將待測核酸片段分離，然后用印跡技術將分離的核酸片段轉移到特異的固相支持物上（轉移后的核酸片段將保持其原來的相對位置不變）。再用標記的核酸探針與固相支持物上的核酸片段進行雜交。最后洗去未雜交的游離的探針分子，通過放射自顯影等檢測方法顯示標記的探針的位置及量的多少。概括起來，雜交主要包括三個步驟：印跡、雜交和檢測。膜上印跡雜交的基本操作流程分子生物學實驗原理1.印跡技術

印跡技術是指將待測核酸分子轉移并結合到一定的固相支持物上的方法。印跡技術主要包括兩個關鍵因素：選擇良好的固相支持物；有效的轉移方法。

分子生物學實驗原理⑴固相支持物的選擇

①具有良好的機械性能，如柔軟性好，韌性強，以便操作時不易損壞；②具有較強的結合核酸分子的能力；③與核酸分子結合后，應不影響其與探針分子的雜交反應；④與核酸分子的結合穩(wěn)定、牢固，能經受雜交、洗膜等操作過程，而不會脫落或脫落極少；⑤非特異性吸附較少，即使有，在洗膜時也易被洗脫掉。

分子生物學實驗原理硝酸纖維素濾膜尼龍膜化學活化膜濾紙其中前2種更為常用

目前常用的固相支持物分子生物學實驗原理硝酸纖維素濾膜

具有較強的吸附結合單鏈DNA和RNA的能力，特別是在高鹽濃度，其結合力可達80μg/cm2～100μg/cm2。這種結合主要靠疏水作用。非特異性吸附核酸（探針）能力較弱，因此雜交信號本底值較低。常用于Southern、Northern斑點印跡及克隆篩選等實驗。分子生物學實驗原理缺點：①與核酸的結合力較弱（因為是靠疏水作用），在雜交及洗脫的進程中，核酸會慢慢脫落，特別是在高溫情況下，更容易脫落，從而使雜交率下降。另外硝酸纖維素膜對于小分子量DNA片段結合力更弱，因此不太適合小分子DNA片段的雜交。②硝酸纖維素膜質地較脆，特別是經烘烤后更易破損，因此操作不方便，須特別小心。另外值得注意的是，硝酸纖維素膜與核酸的結合，有賴于高鹽濃度，而高鹽溶液又不適合于電轉印跡法（電流大，產熱）。分子生物學實驗原理尼龍膜

尼龍膜是目前較理想的一種核酸固相支持物，它有多種類型。有的尼龍膜未經特殊處理，叫普通尼龍膜。有些則是經過了正電荷基團的修飾，又叫特殊尼龍膜。特殊尼龍膜帶有正電荷，核酸帶有負電荷，因此二者可靠靜電吸引牢固結合。因此尼龍膜對核酸的結合力要比硝酸纖維素膜強好多倍。特別是經短波紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的帶正電荷的氨基相互交聯，從而使結合更加牢固。因此特別適用于小分子核酸片段的雜交。另外堿處理也可使核酸牢固地結合在尼龍膜上，因此使DNA的變性、吸附和固定可一步完成，特別適用于菌落原位印跡法。分子生物學實驗原理

尼龍膜質地堅韌，不易損壞，操作方便，可進行多次重復雜交。另外，在低離子強度條件下，也可與核酸牢固結合，因此適用于電轉印跡法。缺點：由于結合力強，非特異性吸附較多，雜交信號本底較高，應注意封閉。分子生物學實驗原理⑵印跡方法

轉移方法不同，可分為①斑點或狹縫印跡，即直接將核酸樣品點樣于固相支持物上；②虹吸印跡法，利用毛細管虹吸作用，由轉移緩沖液帶動核酸分子轉移到固相支持物上；③電轉印跡法，即利用電場力的作用將核酸帶到固相支持物上；④真空轉移法，即利用真空抽濾作用，將核酸分子帶到固相支持物上。分子生物學實驗原理

根據要轉印核酸品種的不同，又可分為

Southern印跡法：是指將電泳分離的DNA從凝膠中轉移到固相支持物上的過程。

Northern印跡法：是指RNA的印跡過程。分子生物學實驗原理

步驟：

a.DNA分子經限制內切酶酶切。酶切變成合適長度的DNA片段（根據實驗目的而定，突變檢測則短，定性定量則長）。一般理想的是0.5～10Kb，因片段大小直接影響轉移效率。

b.在瓊脂糖凝膠中進行電泳。分離DNA片段，經EB（溴化乙錠）染色后觀察DNA片段大小，并與DNA分子量標準參照物比較（Marker）。記錄或照像各DNA片段位置。尤其留意我們所感興趣的DNA片段。（瓊脂糖電泳常用于核酸，一般為水平板電泳

SDS電泳常用于蛋白質，一般為垂直板電泳）Southern印跡法分子生物學實驗原理

c.將凝膠浸泡于適量的變性液中(1.5mol/LNacl和0.5mol/LNaOH)室溫1h，其目的使DNA變性，即將雙鏈DNA變成單鏈DNA。如果DNA片段較大(大于15kb)，可在變性前，用稀鹽酸（0.2mol/L）處理10min，脫嘌呤后，再進行堿變性處理，使之降解為小片段，因為片段的大小直接影響轉移速率。小于15Kb，轉移1h，大于15Kb則需要18h。

d.印跡(轉移)方法：虹吸印跡法，電轉印跡法和真空印跡法。其中常用的是后兩種，本教研室常用后一種，真空印跡法。不論采用哪種方法，均是將DNA從凝膠轉移到固相支持物上（硝酸纖維素膜、尼龍膜）。

e.固定，上一步驟雖然將DNA轉移到固相支持物上，但結合還不牢固，需進一步固定。方法有：對于硝酸纖維膜，可真空下80℃烘烤2h(亦可無真空)，對尼龍膜還可用短波紫外線（波長254nm）照射幾分鐘進行固定，固定后方可進行下一步的雜交。分子生物學實驗原理

Northern印跡法是指將RNA變性及電泳分離后，將其轉移到固相支持物上的過程。從而可用于雜交反應以鑒定其中特定mRNA的豐度?；驹砼cSouthern印跡相同，但RNA變性方法與DNA不同，不能用堿變性，因為堿導致RNA水解。RNA的變性常與電泳同時進行，常有3種方法，即聚乙醛和二甲基亞砜變性電泳；甲醛變性凝膠電泳和甲基氧化汞電泳，常用的是第二種。

Northern印跡法分子生物學實驗原理

RNA經變性電泳后，一般可進行轉移（印跡），其印跡方法與Southern方法相同。但對含甲醛的凝膠，可用DEPC預處理水漂洗，以去除甲醛。如果凝膠較濃（大于1％）、較厚（如大于0.5cm）或待測RNA片段較大（大于2.5kb），可預先將凝膠放在0.05mol/LNaOH溶液中浸泡20分鐘，以便充分使RNA變性。然后DEPC處理過的水漂洗，最后用20×SSC浸泡45min。固定方法，常用真空烘烤（80℃）2h。分子生物學實驗原理2．雜交（固－液相雜交）技術

DNA分子雜交實際上是雙鏈DNA的變性和具有同源序列的兩條單鏈的復性過程。RNA分子雜交也涉及變性和復性過程（這種變性是單鏈RNA分子內部發(fā)夾結構打開過程），其基本原理和方法與DNA雜交基本一致。因此以DNA分子雜交為例進行介紹。分子生物學實驗原理（1）變性

即打開DNA雙螺旋結構，變成單鏈DNA的過程。

變性的方法有：加熱變性有機溶劑變性高濃度鹽變性堿變性等常用方法是加熱變性和堿變性。

DNA變性時，在260nm處的紫外吸光度增加，這種現象又稱增色效應。當增色效應達到最大值的50%時溫度，稱熔解溫度（meltingtemperatureTm值），Tm值表明DNA溶液中一半的DNA雙鏈已解離為單鏈，也就是說，Tm值反映了DNA變性的程度和難易，Tm值越大，變性越難，反之，變性容易。分子生物學實驗原理

大多數DNA的Tm值在85～90℃左右。但Tm值并不是一個固定常數，常受許多因素影響。

①DNA的堿基組成。A：T堿基對只有兩個氫鏈，而G：C堿基對有3個氫鍵。因此Tm值主要受G：C堿基對數量多少的影響，有一個經驗公式為：

Tm＝(G+C)%×0.41＋69.3②溶液的離子強度。DNA鏈上的磷酸基團帶負電荷，它們之間的靜電具有相互排斥作用，可導致DNA雙鏈結構的不穩(wěn)定，比如：在無鹽的水中，DNA在室溫條件下就會變性，而加入鹽后，正電荷離子可以封閉磷酸基團的負電荷，使DNA雙鏈的穩(wěn)定性增加，Tm值亦會升高。分子生物學實驗原理

③pH值，pH值在5～9之間范圍內，Tm值變化不明顯，即DNA雙鏈比較穩(wěn)定，在高pH值情況下，可使堿基失去形成氫鍵的能力。當pH值大于11.3時，所有氫鍵均被破壞，DNA完全變性。這就是堿變性的原理。

④變性劑：變性劑可以干擾堿堆積力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑是甲酰胺和脲。通常用50％的甲酰胺可以使Tm值降低30℃。

分子生物學實驗原理（2）復性

變性DNA的兩條互補單鏈，或兩條具有同源性的單鏈核酸重新締合成雙鏈的過程，稱為復性或退火。復性并不是變性反應的一個簡單逆反應過程。復性的過程是相當復雜的。變性過程可以在一個極短的時間內完成（幾秒鐘），而復性則需要相對較長的時間才能完成。復性的時間與碰撞機率或有效配對有關。分子碰撞機率越大，復性速度越快，一開始往往錯誤碰撞，只有正確配對才是復性的開始。如果使熱變性的DNA溶液迅速冷卻，則只能形成一些不規(guī)則的堿基對，而不會完全恢復DNA雙鏈結構。要想使變性DNA完全恢復天然的雙鏈結構，則要在低于Tm值25℃的溫度下維持相當長的時間才能完成。

分子生物學實驗原理

復性的（速度）過程要受到許多因素的影響。

①DNA的濃度：DNA濃度直接影響到DNA單鏈間碰撞的機率，濃度越大、碰撞機率越大，復性速度越快。

②DNA的分子量：大分子量的DNA擴散速度較慢，碰撞機率較少，同時又很難形成正確配對，因此復性速度較慢；但一旦復性，又難于變性。

③溫度：溫度過高，有利于DNA變性而不利于復性；而溫度過低，碰撞機率減少，一旦形成局部錯誤配對，又不易解離，難以繼續(xù)尋找正確配對，因而使復性速度降低；適宜的溫度是較Tm值低15℃～25℃。

分子生物學實驗原理

④離子強度：離子強度過低，不利于復性。

⑤pH值：pH值在5～9范圍內，不影響復性速度，過低或過高則影響。

⑥DNA分子的復雜性：DNA總量一定時，基因組越復雜，其中特定順序的拷貝數就越少，互補順序的濃度就越低，因而復性反應速度越慢。分子生物學實驗原理（3）雜交體系的建立要考慮以下幾因素

①DNA濃度：DNA濃度越高，復性速度越快。其方法有：加入足夠的DNA；盡量減少雜交的體積，一般以每平方厘米濾膜面積加50～100μl雜交液為宜。

②DNA探針的長度：在雜交過程中，待測DNA固定在膜上，只有探針可以自由擴散，探針越長，擴散越慢，變性越慢。因此探針的長度不宜過長，一般以10～50bp（一般探針20bp）。分子生物學實驗原理

③離子強度：離子強度對變性影響較大。一般常用5×或6×SSC（1×SSC為0.15mol/LNacl和0.015mol檸檬酸鈉）。④溫度：溫度對于雜交（復性）反應的快慢和洗膜時去掉非特異雜交是至關重要的因素。一般認為雜交溫度為：68℃（不含甲酰胺（作用：降低Tm值））；當含50％甲酰胺時，在42℃進行雜交。洗膜溫度一般認為55℃～65℃。對于寡核苷酸探針的雜交溫度，應根據下列公式推算：Tm=4℃×G：C對數量＋2℃×A：T對數量。而雜交溫度一般比Tm值低5℃，即55℃。

Tm值的推算：與G：C對數量，離子強度，變性劑等有關。分子生物學實驗原理

⑤雜交時間：一般應為CoT1/2的1～3。

Yz

Yz

小時/Cot1/2＝＝

5×10X5×10XCo＝單鏈DNA濃度，t1/2＝反應一半時的時間，Y為探針DNA的復雜性，即片段大小（Kb），Z為雜交體系的體積(ml)。經驗雜交時間8～16h，過夜。。分子生物學實驗原理

⑥減少或抑制非特性雜交。一般在雜交前先進行預雜交，以便將非特異性DNA位點封閉，同時也將膜上非特異性吸附位點封閉。采用鮭魚精子DNA（SalmonSpermDNA）或小牛胸腺DNA（CalfthymusDNA）封閉DNA非特異位點；采用Dehardt氏液（含聚蔗糖400，聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白），除封閉DNA非特異位點外，更主要封閉膜上非特異吸附位點。近年來采用脫脂奶粉代替Denhardt氏液。⑦促進雜交反應速度：硫酸葡聚糖(dextransulfate,Mw500000)能促進DNA鏈間的締合，其微粒表面可吸附DNA探針分子，從而使DNA接觸面積增大，有利于雜交反應，促進雜交反應速度。如10％硫酸葡聚糖可使雜交反應速度提高10～100倍。分子生物學實驗原理

①預雜交；將膜放在預雜液中，即不放探針，預雜交液中主要含Dehardt液和鮭魚精DNA，主要是封閉膜上非特異性的雜交位點。預雜交的溫度和時間一般與雜交的溫度和時間是一樣的。預雜交液：5ⅩSSC；5ⅩDenhardt；50mmol/LPBS；

0.2%SDS；500ug變性鮭魚精DNA；50%甲酰胺

②雜交：雜交液中除含封閉物質外，還含有10％硫酸葡聚糖和探針。探針如果是雙鏈DNA，則需要進行變性處理：沸水中加熱5min，然后迅速置冰浴中（防止蛋白酶作用）；也可用堿變性處理。探針是寡核苷酸片段、單鏈DNA或RNA，則不需要進行變性處理。

（4）雜交操作步驟分子生物學實驗原理

將探針加到雜交液中，然后與膜上的待測核酸進行雜交反應。溫度68℃（不含甲酰胺），42℃（含50％甲酰胺），雜交時間：8～16h過夜。

③洗液：洗膜過程是將膜上未與DNA雜交的及非特異性雜交的探針從膜上洗去的過程。由于非特異性雜交的雜交體穩(wěn)定性較低，解鏈溫度較低，在一定的溫度下，非特異雜交體容易解鏈而被洗掉，而特異性雜交體由于穩(wěn)定而保留在濾膜上。注意，洗膜液要換幾次，要用幾種不同的洗膜液。離子強度逐漸降低，而洗膜溫度逐漸上升（室溫～37℃～65℃）。即逐漸增加洗膜的強度。逐漸減少離子強度，為下一步反應（檢測）做好準備。

分子生物學實驗原理3．雜交信號的檢測

⑴放射自顯影：探針標記了放射性核素，如32P、35S、125I或131I。其具體方法是：在暗盒里將雜交后的濾膜放在暗盒里的X光片上，蓋上暗盒，置－70℃曝光一定時間。放射線可使X光片曝光，經顯影、定影后，可出現黑色曝光斑點，根據斑點密度及大小，判斷被檢測核酸是否有與探針相應序列及大小。分子生物學實驗原理

⑵顯色反應：探針直接標記酶或間接結合酶，酶在有特異性底物存在的情況下，可發(fā)生顯色反應。一般情況下，大都是通過間接法結合酶。即探針標記了半抗原，如地高辛或生物素，再抗地高辛的抗體或抗生物素蛋白的配體（avidin）結合酶，酶在有底物存在的情況下再發(fā)生顯色反應。即:

A

BC酶+底物

顯色探針標記物(地高辛)抗體

根據顯色反應斑點大小判斷結果。

分子生物學實驗原理常用的酶堿性磷酸酶：作用底物有：BCIP（5-溴-4-氯-4-吲哚磷酸）

NBT(硝基藍四氮唑)。顯色過程：堿性磷酸酶→BCIP→脫磷，產生H+

→NBT還原

→紫色化合物。辣根過氧化物酶（HRP）：常用的底物：DAB（二氨基聯苯胺）

TMB（四甲基聯苯胺）

DAB經HRP消化產生紅棕色，有致癌性。TMB經HRP消化產生藍色，無致癌性。常用后者。分子生物學實驗原理⑶化學發(fā)光反應與顯色反應基本一致，只是酶（HRP堿性磷酸酶）催化一種特殊底物如luminol、CSPD等，產生發(fā)光，而不顯色。該化學光可使X光片曝光，經顯影、定影后，可獲得雜交斑點?；瘜W發(fā)光是一種有發(fā)展前途的檢測方法。如需準確定性和定量，可用數字成像系統進行檢測。分子生物學實驗原理（三）、PCR技術

1985年美國的KaryMullis教授首次建立了PCR技術，1993年KaryMullis教授因此獲得了諾貝爾獎。

分子生物學實驗原理1.PCR的定義及意義

定義：PCR是polymerasechainreaction的縮寫，譯為多聚酶鏈式反應。是一種在體外（試管內）擴增DNA特異片段的技術，可在短時間內獲得大量（數百萬個）DNA特異序列的拷貝。

意義：可在短時間內獲得大量目的基因，因此比較容易地對目的基因進行分析、鑒定及其他用途。分子生物學實驗原理

要想從生物材料中獲得某一特異DNA片段，按傳統的方法，要采用重組和克隆技術，不僅費時（數周甚至數月），而且獲得的數量有限。PCR技術不僅克服了上述缺點，而且還有靈敏度高的優(yōu)點，只要微量的DNA（一滴血，精斑，頭發(fā)），就可以得到大量擴增的DNA。概括起來，

PCR的特點是：①簡單、快速。②需要樣本量很少，即靈敏度高。

分子生物學實驗原理2.PCR技術的原理

PCR技術實際上是根據DNA復制的基本原理，建立起來的一種體外DNA復制方法，即在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，靠DNA聚合酶催化反應，合成一條與模板互補的新鏈。它與體內DNA復制不同的是，要不斷改變溫度，即通過溫度控制來實現聚合反應。分子生物學實驗原理步驟

（1）變性（denaturation）：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。（2）退火（annealling）：當溫度突然降低到適當溫度時，引物與DNA模板上的特異序列，按堿基互補原則，形成雜交雙鏈。（3）延伸（extension）：在DNA聚合酶、4種脫氧核糖核苷三磷酸及Mg2+存在條件下，以引物為起始點，按5′→3′方向催化合成一條與模板互補的新鏈。分子生物學實驗原理

以上三個步驟為一個循環(huán)，每一個循環(huán)產物可以作為下一個循環(huán)的模板，數小時之后，介于兩個引物之間特異性DNA片段得到了大量復制，數量可達2×106～2×107拷貝，即是指數增長。其中，引物是延伸反應的誘導物，同時又是特異性擴增的關鍵。分子生物學實驗原理分子生物學實驗原理3.PCR的反應體系及反應條件

PCR反應體系

反應體系一般選用50μl～100μl體積，其中含有：（1）PCR緩沖液：50mmol/LKCl；10mmol/LTris·HCl(pH8.4)；1.5mmol/LMgCl2；100μg/ml

明膠或牛血清白蛋白（BSA）。（2）2個引物，各0.25μmol/L。（3）4種底物dNTP，各200μmol/L。（4）模板DNA（人類基因組DNA）0.1μg。（5）TaqDNA聚合酶，2.5u（國際單位）分子生物學實驗原理反應條件：

94℃變性30秒；

55℃退火30秒；

70℃～72℃延伸30～60秒；共30次左右的循環(huán)。分子生物學實驗原理4.PCR反應體系中各種成分的作用、用量⑴KCl：促進引物退火，使用量為50mmol/L，過低，不起作用；過高則抑制TaqDNA聚合酶活性。⑵MgCl2：Mg2+能影響反應的特異性和擴增速度、產量。比較合適的用量為1.5mmol/L～2.0mmol/L。⑶明膠和BSA

對TaqDNA聚合酶有一定保護作用（尤其高溫變性時）。分子生物學實驗原理

⑷Tris·HCl：調節(jié)PH值并起緩沖作用，TaqDNA聚合酶發(fā)揮作用需要一個偏堿環(huán)境（pH8.4），Tris·HCl就起到這樣的一個作用。

⑸底物（脫氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）：合成新鏈DNA的底物（前體物，原料）。在PCR反應中，dNTP濃度應在20μmol/L～200μmol/L。

dNTP溶液具有較強的酸性，使用時應用NaOH將pH值調至7.0～7.5。另外，4種脫氧核糖核苷三磷酸的濃度要相等。分子生物學實驗原理⑹TaqDNA聚合酶：催化底物合成DNA新鏈。該酶具有很強的耐熱性（經95℃持續(xù)高溫仍不變性、失活），因此，加一次酶可完成整個PCR反應。在100μl反應體系中，一般需要TaqDNA聚合酶的用量為0.5u～5u。⑺引物：與目的基因的特異序列結合，并引導新鏈DNA的合成。PCR之所以可對特異DNA序列進行擴增，關鍵在于引物，即引物決定要對哪一段基因進行擴增。在PCR反應體系中，引物濃度一般為0.1μmol/L～0.5μmol/L。引物濃度過高，可引起非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機率。引物濃度過低，DNA合成率也會下降。

分子生物學實驗原理5.PCR反應的幾個關鍵因素

（1）高溫變性、低溫退火、中溫延伸

高溫變性：一般在90℃～95℃條件下，任何復雜的DNA均可變性。因此高溫變性的溫度容易確定、選擇。

中溫延伸：一般以TaqDNA聚合酶發(fā)揮活性作用的最適宜溫度為延伸反應溫度。TaqDNA聚合酶的最適溫度為70℃～75℃之間。因此，中溫延伸溫度也比較容易確定。分子生物學實驗原理

低溫退火：低溫退火時，引物與模板上的特異序列結合，而模板兩個單鏈DNA不易結合。因為引物是較小的片段，與模板碰撞機會大，易于結合。而兩個單鏈DNA由于分子片段較大，不易碰撞結合。退火溫度的選擇，一方面要考慮引物與模板DNA的特異性結合，另一方面又要考慮防止模板DNA的兩條單鏈的結合。溫度偏高，有利于引物與模板之間的特異性結合，但反應產物減少；偏低，容易引起引物與模板之間的非特異性結合，并引起模板兩條DNA的結合。因此，退火溫度的選擇至關重要。引物長度在15bp～25bp之間時，Tm=4×G/C+2×A/T。退火溫度的選擇應在Tm值允許范圍內，盡量選擇較高溫度。一般為40℃～60℃，以55℃為常用溫度。分子生物學實驗原理

是從一種在火山溫泉中生長的細菌中分離得到的。該細菌生長在70℃～75℃極富礦物質的環(huán)境中，因此該酶具有很強的耐熱性和耐鹽性。在92.5℃、95℃、97.5℃條件下，TaqDNA聚合酶的半衰期分別為130min