葡萄糖含量檢測試劑盒Pro實驗解決方案

葡萄糖含量檢測試劑盒Pro實驗解決方案原理葡萄糖是幾乎所有生物體的主要能量來源。血糖水平是許多代謝性疾病的關(guān)鍵診斷參數(shù)。葡萄糖的檢測在研究和藥物發(fā)現(xiàn)過程中都非常重要。CheKine?Pro葡萄糖含量檢測試劑盒（熒光法）可檢測動植物組織，細胞、血清（漿）、唾液、尿液、體液等生物樣本。在該試劑盒中，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫，在過氧化物酶作用下，催化過氧化氫與無熒光物質(zhì)反應(yīng)生成有熒光的物質(zhì)（Ex/Em=535/590nm），與葡萄糖的量成正比。自備耗材·熒光酶標儀(激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長590nm)·96孔全黑板、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫箱、制冰機、低溫離心機·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準備AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。-20℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。-20℃避光保存。用不完的試劑-20℃避光分裝保存6個月，避免反復(fù)凍融。注意：ReagentI有毒，建議在通風(fēng)櫥進行實驗。ReagentII：即用型；-20℃避光保存。ReagentIII：即用型；-20℃避光保存。WorkingReagent：每孔準備50μL工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。按照AssayBuffer：ReagentI：ReagentII：ReagentIII=4,840μL：50μL：10μL：100μL的比例，混合均勻。Standard(400nmol/mL)：即用型；使用前，平衡到室溫。-20℃避光保存。用不完的試劑-20℃避光分裝保存6個月，避免反復(fù)凍融。標準品制備：4nmol/mL標準品：10μLStandard用990μLAssayBuffer稀釋；使用4nmol/mL標準品，按照下表所示，進一步稀釋成標準品：序號Standard體積（μL）AssayBuffer體積（μL）濃度（nmol/mL）Std.112.5μL4nmol/mLStandard987.550Std.2500μLofStd.1(50nmol/mL)50025Std.3500μLofStd.2(25nmol/mL)50012.5Std.4500μLofStd.3(12.5nmol/mL)5006.25Std.5500μLofStd.4(6.25nmol/mL)5003.125Std.6500μLofStd.5(3.125nmol/mL)5001.5625Std.7500μLofStd.6(1.5625nmol/mL)5000.78125Blank05000注意：每次實驗，請使用新配制的標準品；配制好的標準品需要在4h之內(nèi)使用。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應(yīng)控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLAssayBuffer，用勻漿器或研缽冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細胞：收集500萬細胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細胞，離心后棄上清，加入1mLAssayBuffer，冰浴超聲波破碎細胞5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。在進行檢測前，請依據(jù)下表對樣本進行稀釋，稀釋液為AssayBuffer（僅供參考）：胡蘿卜100-300兔肝臟100-400小鼠肌肉5-20HT29細胞5-20胎牛血清100-300Jurkat細胞培養(yǎng)液50-200唾液1-3尿液2-5注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟熒光酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)激發(fā)波長到535nm，發(fā)射波長到590nm。操作表（下述操作在96孔全黑板中操作）：試劑空白孔（μL）標準孔（μL）測定孔（μL）樣本0050Standard0500AssayBuffer5000WorkingReagent505050充分混勻，37℃反應(yīng)15min，記錄各孔的熒光值RFU，熒光激發(fā)波長535nm，熒光發(fā)射波長590nm，空白孔記為RFU空白，標準孔記為RFU標準，測定孔記為RFU測定。計算ΔRFU測定=RFU測定-RFU空白，ΔRFU標準=RFU標準-RFU空白。注意：空白管和標準管只需做1-2次。實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本稀釋成不同濃度做預(yù)實驗。根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，結(jié)合本試劑盒的線性范圍：0.1-50μM，選擇合適的稀釋倍數(shù)對樣本進行檢測。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。標準曲線的繪制以標準溶液濃度為x軸，ΔRFU標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程，將ΔRFU測定帶入方程得到x(nmol/mL)。葡萄糖含量的計算：按樣本蛋白濃度計算葡萄糖(nmol/mgprot)=x÷Cpr×F按樣本鮮重計算：葡萄糖(nmol/g鮮重)=x÷(W÷V樣總)×F=x÷W×F按照細胞數(shù)量計算葡萄糖(nmol/104cell)=x÷(n÷V樣總)×F=x÷n×F按樣本體積計算：葡萄糖(nmol/mL)=x×FV樣總：加入AssayBuffer體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；n：細胞數(shù)量，以萬計；F：樣本稀釋倍數(shù)。注意事項ReagentⅠ具有光敏性，使用和保存需嚴格避光。如果WorkingReagent出現(xiàn)紅色，可先對Standard進行檢測，若Blank孔熒光值大于Std.7(0.78125nmol/mL)，則WorkingReagent失效，反之可以繼續(xù)使用。每次檢測都需要建立新的標準曲線。如果RFU測定較低或ΔRFU測定為負值，可適當減少樣本稀釋倍數(shù)或延長反應(yīng)時間，但不得超過30min。如果樣本測不出值，建議取新鮮樣本，重新檢測。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.(a)葡萄糖標準曲線。(b)本試劑盒測定胡蘿卜和兔肝臟中葡萄糖的含量。(c)本試劑盒測定胎牛血清、Jurkat細胞培養(yǎng)液和尿液中葡萄糖的含量。相關(guān)產(chǎn)品Cata