氧基抗氧化能力（ORAC）檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

氧基抗氧化能力（ORAC）檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理氧基抗氧化能力（OxygenRadicalAbsorbanceCapacity,ORAC）是一種檢測(cè)各種樣品中生物分子抗氧化能力的經(jīng)典方法。ORAC方法對(duì)抗氧化性能的評(píng)價(jià)具有特異性好、靈敏度高、測(cè)定范圍廣，以及適合抗氧化活性的高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物抗氧化提取物中得到越來(lái)越多的應(yīng)用，食品及功能食品企業(yè)普遍采用ORAC作為功能食品的重要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。CheKine?氧基抗氧化能力（ORAC）檢測(cè)試劑盒（熒光法）可檢測(cè)動(dòng)物或植物組織、細(xì)胞或細(xì)菌、血清（漿）等樣本，其原理是以熒光素鈉為熒光探針，偶氮類(lèi)化合物AAPH作為過(guò)氧自由基來(lái)源，根據(jù)自由基破壞熒光探針，使熒光強(qiáng)度產(chǎn)生變化，熒光強(qiáng)度的變化大小反映自由基破壞的程度。在抗氧化劑存在時(shí)，它可以抑制由自由基引起的熒光變化，抑制程度反映了它對(duì)自由基的抗氧化能力。自備耗材·熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm）·全黑96孔板·低溫離心機(jī)、恒溫箱·制冰機(jī)·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水、丙酮·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備1×AssayBuffer：使用前，AssayBuffer(2×)用去離子水稀釋成1×AssayBuffer，充分溶解待用。4℃保存。1×ReagentⅠ：使用前，ReagentⅠ(100×)用1×AssayBuffer稀釋成1×ReagentI，充分溶解待用。用不完的ReagentⅠ(100×)在-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。不要儲(chǔ)存稀釋的1×ReagentⅠ溶液。WorkingReagentⅡ：臨用前配制19mg/mLReagentⅡ溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。例如，稱(chēng)量19mgReagentⅡ加入1mL1×AssayBuffer，充分溶解待用。WorkingReagentⅡ溶液不穩(wěn)定，應(yīng)立現(xiàn)配現(xiàn)用。注意：ReagentⅠ和ReagentⅡ有一定的刺激性，建議在使用過(guò)程中做好個(gè)人防護(hù)。TroloxStandard(5mM)：使用前，用1×AssayBuffer稀釋成0.2mM濃度，充分溶解待用。用不完的TroloxStandard（5mM）-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。Standard設(shè)置：按下表所示，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。序號(hào)0.2mM標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL）1×AssayBuffer體積（μL）標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μM）Std.15015050Std.24016040Std.33017030Std.42018020Std.51019010Std.651955Std.72.5197.52.5Std.802000注意：每次實(shí)驗(yàn)都要做一次標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，制作標(biāo)曲；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時(shí)內(nèi)使用。樣本制備注意：樣本以新鮮為宜，若不能立刻檢測(cè)，應(yīng)儲(chǔ)存在-80℃保存。動(dòng)物組織：稱(chēng)取0.01-0.1g樣本，加入適量的1×AssayBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。植物組織：稱(chēng)取0.01-0.1g樣本，加入適量的1×AssayBuffer搗碎，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。細(xì)胞或細(xì)菌：收集100-500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入適量的1×AssayBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。血漿或血清：用1×AssayBuffer稀釋100倍或更多進(jìn)行檢測(cè)。液體樣本：10,000g，4℃離心10min，去除微粒，取上清液，置冰上待測(cè)。在進(jìn)行測(cè)定之前，根據(jù)需要稀釋上清液。親脂性樣本：溶于100%丙酮中，用50%丙酮稀釋?zhuān)谑覝叵路跤?h，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。在進(jìn)行測(cè)定之前，根據(jù)需要稀釋上清液。固體或高蛋白樣本：稱(chēng)取固體樣本，加入去離子水（1:2，w/v），冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取水溶性部分的上清液。不溶物部分用去離子水洗滌，將此洗滌液與水溶性的上清液混合，合并的上清液可以用1×AssayBuffer稀釋并直接用于分析。而不溶物部分加入純丙酮（1:4,w/v）在室溫下混合30-60min來(lái)進(jìn)一步提取。10,000g，4℃離心10min，取丙酮提取物的上清液用50%丙酮稀釋。通過(guò)將水溶性部分和不溶物部分的丙酮提取物的結(jié)果相結(jié)合，計(jì)算出總ORAC值。注意：該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1502的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟熒光酶標(biāo)儀預(yù)熱到37℃，激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）：試劑空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測(cè)定孔（μL）1×AssayBuffer2500Standard0250上清00251×ReagentⅠ150150150混勻，37℃孵育30minWorkingReagentⅡ252525混勻，立即用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光值，每5min讀取1次，總共60min。熒光酶標(biāo)儀的測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm，儀器溫度保持在37℃。注意：空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔只需做1-2次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)?？瞻卓椎淖罱K測(cè)定值應(yīng)小于初始值的10%。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。ORAC值根據(jù)熒光衰減曲線下凈面積(AreaUndertheCurve,AUC)=[AUC待測(cè)樣(抗氧化劑)-AUC(空白)]計(jì)算抗氧化劑的活性。1.從下面的等式計(jì)算AUCAUC=1+RFU1/RFU0+RFU2/RFU0+RFU3/RFU0+……+RFU59/RFU0+RFU60/RFU0RFU0=0min的相對(duì)熒光值。RFUx=xmin的相對(duì)熒光值。（例如，RFU5是5min時(shí)的相對(duì)熒光值）2.計(jì)算凈AUC：NetAUC=AUC(樣本)-AUC(空白)。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為y軸，凈AUC為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.將樣本的NetAUC帶入方程得到y(tǒng)值（μM），以微摩爾每升Trolox當(dāng)量（TE）或每克樣品的TE（μmolTE/g或μmolTE/L）表示ORAC值。注意：若樣本進(jìn)一步稀釋?zhuān)瑒t需要再乘以進(jìn)一步稀釋的稀釋倍數(shù)n。結(jié)果展示典型標(biāo)準(zhǔn)曲線：TroloxStandard(μMTroloxStandard(μM)凈AUCFigure1.ORAC的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)實(shí)例：取0.1g動(dòng)物組織加入1mL1×AssayBuffer進(jìn)行勻漿研磨，取上清，稀釋50倍，之后按照測(cè)定步驟操作，用全黑96孔板測(cè)得:樣本的AUC為6.715，空白的AUC為2.820，凈AUC=AUC(樣本)-AUC(空白)=6.715-2.820=3.895，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=4.9679x-0.916，Trolox濃度為18.43μM，ORAC值(樣本)=18.43μM×50(稀釋因子)=921.5μMTE=