生物細(xì)胞培養(yǎng)與基因技術(shù)課件

生物細(xì)胞培養(yǎng)與基因編輯技術(shù)本課程將介紹生物細(xì)胞培養(yǎng)與基因編輯技術(shù)的基本原理、操作方法以及應(yīng)用領(lǐng)域。課程導(dǎo)入課程內(nèi)容涵蓋細(xì)胞培養(yǎng)、基因編輯、干細(xì)胞等前沿技術(shù)。學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握相關(guān)技術(shù)的操作流程、原理以及應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)概述基本概念在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)。培養(yǎng)類型原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細(xì)胞系、細(xì)胞株。培養(yǎng)條件培養(yǎng)基、溫度、濕度、氣體成分、無菌操作。細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備與操作注意事項顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、生長狀態(tài)。培養(yǎng)箱提供適宜的溫度、濕度、氣體環(huán)境。移液器精確控制液體體積，避免污染。超凈工作臺提供無菌操作環(huán)境，防止污染。常見細(xì)胞株種類及特性細(xì)胞株特性HEK293人胚腎細(xì)胞，易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高。CHO-K1中國倉鼠卵巢細(xì)胞，表達(dá)外源蛋白能力強(qiáng)。NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞，用于研究細(xì)胞生長和增殖。細(xì)胞傳代操作流程1消化細(xì)胞，用胰酶或EDTA處理。2計數(shù)細(xì)胞，使用血球計數(shù)板或自動計數(shù)儀。3接種細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞密度調(diào)整接種量。4更換培養(yǎng)基，定期更換新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞生長曲線分析1細(xì)胞數(shù)量2時間3對數(shù)生長期4平臺期5衰退期細(xì)胞活力檢測方法1臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞膜完整性。2MTT法檢測細(xì)胞代謝活性。3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞形態(tài)觀察與鑒定上皮細(xì)胞扁平、排列緊密，有極性。成纖維細(xì)胞梭形或不規(guī)則形，具有突起。神經(jīng)元星形，具有長軸突和樹突。細(xì)胞分離純化技術(shù)1密度梯度離心法根據(jù)細(xì)胞密度進(jìn)行分離。2磁珠分選法利用磁珠標(biāo)記特定細(xì)胞進(jìn)行分離。3流式細(xì)胞術(shù)根據(jù)細(xì)胞大小、顆粒度、熒光強(qiáng)度進(jìn)行分選。基因工程概述1基因克隆2基因表達(dá)3基因治療4基因診斷基因編輯技術(shù)簡介原理利用核酸酶對基因組進(jìn)行定點修飾。類型鋅指核酸酶、TALEN、CRISPR/Cas9。應(yīng)用基因敲除、基因插入、基因修復(fù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)機(jī)理Cas9蛋白識別目標(biāo)DNA序列。引導(dǎo)RNA引導(dǎo)Cas9蛋白切割目標(biāo)DNA。細(xì)胞修復(fù)機(jī)制修復(fù)斷裂的DNA，產(chǎn)生突變。CRISPR/Cas9應(yīng)用案例病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染腺病毒載體高轉(zhuǎn)染效率，安全性較好。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合到宿主基因組，長期表達(dá)。非病毒載體的基因轉(zhuǎn)染方法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染利用脂質(zhì)包裹DNA，進(jìn)入細(xì)胞。電穿孔法利用電場刺激細(xì)胞膜，使DNA進(jìn)入細(xì)胞。顯微注射法直接將DNA注射到細(xì)胞核內(nèi)?；虮磉_(dá)檢測技術(shù)1Northernblotting檢測RNA表達(dá)水平。2RT-PCR檢測mRNA表達(dá)量。3Westernblotting檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平。蛋白質(zhì)純化技術(shù)1細(xì)胞裂解，釋放蛋白質(zhì)。2離心，去除細(xì)胞碎片。3層析分離，根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行分離。4純化驗證，檢測蛋白質(zhì)純度和活性。生物芯片技術(shù)原理將大量基因片段或蛋白質(zhì)固定在芯片上。應(yīng)用基因表達(dá)譜分析、疾病診斷、藥物篩選。類型DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片?；驕y序技術(shù)Sanger測序第一代測序技術(shù)，應(yīng)用廣泛。二代測序高通量、低成本，適用于大規(guī)模測序。三代測序長讀長、無須片段化，適用于復(fù)雜基因組測序。細(xì)胞治療技術(shù)1CAR-T細(xì)胞療法利用基因工程改造T細(xì)胞，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。2干細(xì)胞移植移植干細(xì)胞修復(fù)受損組織或器官。3基因治療利用基因編輯技術(shù)治療遺傳性疾病。干細(xì)胞技術(shù)概述多能性具有自我更新和分化為多種細(xì)胞的能力。來源胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。干細(xì)胞的體外培養(yǎng)選擇合適的培養(yǎng)基和生長因子?？刂婆囵B(yǎng)溫度、濕度和氣體環(huán)境。定期更換培養(yǎng)基，維持細(xì)胞生長狀態(tài)。干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)1添加特定生長因子或藥物。2調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，模擬特定組織環(huán)境。3檢測分化標(biāo)記，確認(rèn)細(xì)胞分化方向。干細(xì)胞的應(yīng)用前景生物倫理考量知情同意確保研究對象充分了解相關(guān)風(fēng)險和利益?；颊唠[私保護(hù)患者的個人信息和醫(yī)療數(shù)據(jù)安全。動物福利在動物實驗中，確保動物福利和倫理標(biāo)準(zhǔn)。實驗室安全操作規(guī)程個人防護(hù)佩戴防護(hù)服、手套、口罩等。無菌操作嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)范，防止污染。廢物處理按照規(guī)定對廢物進(jìn)行分類處理，避免感染。研究進(jìn)展與前沿動態(tài)1基因編輯技術(shù)新型基因編輯工具的開發(fā)和應(yīng)用。2干細(xì)胞研究干細(xì)胞的分化機(jī)制和臨床應(yīng)用研究。3細(xì)胞治療細(xì)胞治療技術(shù)的安全性、有效性和可及性。課堂討論與總結(jié)