《酶聯(lián)免疫技術(shù)》課件

酶聯(lián)免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、應(yīng)用廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)方法。簡(jiǎn)介定義酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一種利用酶標(biāo)記抗體或抗原的免疫化學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)酶催化底物顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)和定量抗體或抗原。應(yīng)用ELISA廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域，在疾病診斷、藥物研發(fā)、生物制品質(zhì)量控制等方面發(fā)揮著重要作用。免疫系統(tǒng)的基本概念1免疫系統(tǒng)機(jī)體抵抗病原體侵襲的防御體系2免疫器官骨髓、胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等3免疫細(xì)胞淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等4免疫分子抗體、抗原、細(xì)胞因子等免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和分類1結(jié)構(gòu)由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，具有可變區(qū)和恒定區(qū)2分類IgG、IgM、IgA、IgD、IgE3功能識(shí)別抗原，激活免疫效應(yīng)細(xì)胞，清除病原體抗原-抗體反應(yīng)的基本原理抗原能與免疫系統(tǒng)中的抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合的物質(zhì)抗體由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的，能特異性識(shí)別并結(jié)合抗原的蛋白質(zhì)反應(yīng)特點(diǎn)特異性、可逆性、親和性應(yīng)用診斷、治療、疫苗研發(fā)等酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展歷程11960s免疫熒光技術(shù)發(fā)展21971年Engvall和Perlmann首次報(bào)道ELISA技術(shù)31980sELISA技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷41990sELISA技術(shù)應(yīng)用于食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)52000sELISA技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合，發(fā)展新的檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理1抗原-抗體結(jié)合抗體或抗原被固定在固相載體上，形成固相抗體或抗原2酶標(biāo)記抗體用酶標(biāo)記抗體，與固相抗原或抗體反應(yīng)3顯色反應(yīng)加入酶的底物，酶催化底物發(fā)生顏色變化4結(jié)果判斷根據(jù)顏色變化的程度判斷樣本中抗體或抗原的含量酶聯(lián)免疫技術(shù)的主要類型直接法ELISA用酶標(biāo)記的抗體直接與抗原反應(yīng)間接法ELISA用酶標(biāo)記的抗抗體與與抗原結(jié)合的抗體反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA加入已知濃度的酶標(biāo)記抗原與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體夾心式ELISA用兩種抗體夾住待測(cè)抗原，形成抗體-抗原-抗體的復(fù)合物直接法ELISA固相抗原將待測(cè)抗原固定在固相載體上酶標(biāo)記抗體加入酶標(biāo)記的抗體，與抗原反應(yīng)顯色反應(yīng)加入酶底物，觀察顏色變化間接法ELISA固相抗原將待測(cè)抗原固定在固相載體上待測(cè)抗體加入待測(cè)抗體，與抗原反應(yīng)酶標(biāo)記抗抗體加入酶標(biāo)記的抗抗體，與抗體反應(yīng)顯色反應(yīng)加入酶底物，觀察顏色變化競(jìng)爭(zhēng)性ELISA固相抗體將已知濃度的抗體固定在固相載體上待測(cè)抗原加入待測(cè)抗原與酶標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體顯色反應(yīng)加入酶底物，觀察顏色變化結(jié)果分析待測(cè)抗原濃度與顯色程度呈負(fù)相關(guān)夾心式ELISA固相抗體1將特異性抗體1固定在固相載體上待測(cè)抗原加入待測(cè)抗原，與抗體1反應(yīng)酶標(biāo)記抗體2加入酶標(biāo)記的抗體2，與抗原反應(yīng)顯色反應(yīng)加入酶底物，觀察顏色變化酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的樣品制備樣品類型血清、血漿、尿液、組織、細(xì)胞等制備方法離心、沉淀、過(guò)濾、提取等，去除干擾物質(zhì)注意事項(xiàng)樣品處理要規(guī)范，避免污染，保證樣品質(zhì)量酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)步驟1包被抗原或抗體將待測(cè)抗原或抗體固定在固相載體上2封閉用封閉液封閉固相載體上的空位，減少非特異性結(jié)合3加入樣品加入待測(cè)樣品，與固相抗原或抗體反應(yīng)4加入酶標(biāo)記抗體加入酶標(biāo)記的抗體，與抗原或抗體反應(yīng)5洗滌洗去未結(jié)合的物質(zhì)6加入底物加入酶的底物，酶催化底物發(fā)生顏色變化7測(cè)定結(jié)果用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)測(cè)定顏色變化，計(jì)算結(jié)果酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的定量分析1標(biāo)準(zhǔn)曲線用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線2樣本測(cè)定測(cè)定樣本的吸光度值3結(jié)果分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣本中抗原或抗體的濃度酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域臨床診斷傳染病診斷檢測(cè)病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體抗體或抗原自身免疫病診斷檢測(cè)自身抗體，輔助診斷自身免疫性疾病腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物，輔助診斷腫瘤環(huán)境監(jiān)測(cè)水質(zhì)檢測(cè)檢測(cè)水體中的細(xì)菌、病毒、農(nóng)藥殘留等污染物空氣質(zhì)量檢測(cè)檢測(cè)空氣中的細(xì)菌、病毒、污染物等土壤檢測(cè)檢測(cè)土壤中的農(nóng)藥殘留、重金屬等污染物食品安全檢測(cè)食品添加劑檢測(cè)檢測(cè)食品中是否添加了違禁添加劑肉類安全檢測(cè)檢測(cè)肉類中的激素、抗生素等殘留乳制品安全檢測(cè)檢測(cè)乳制品中的抗生素、農(nóng)藥殘留等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)檢測(cè)病蟲害檢測(cè)檢測(cè)植物病蟲害，及時(shí)防治動(dòng)物疫病檢測(cè)檢測(cè)動(dòng)物疫病，預(yù)防疫情爆發(fā)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留、重金屬等，保證食品安全酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和局限性優(yōu)勢(shì)靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、應(yīng)用廣泛局限性檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，可能受到樣品質(zhì)量、操作因素的影響，某些情況下靈敏度不足靈敏度和特異性靈敏度檢測(cè)方法識(shí)別陽(yáng)性樣品的準(zhǔn)確率特異性檢測(cè)方法識(shí)別陰性樣品的準(zhǔn)確率檢測(cè)時(shí)間和成本檢測(cè)時(shí)間傳統(tǒng)ELISA方法需要數(shù)小時(shí)，新型ELISA方法可縮短至數(shù)十分鐘成本ELISA方法成本相對(duì)較低，適合大規(guī)模檢測(cè)操作復(fù)雜性操作步驟ELISA方法操作步驟較多，需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作人員要求需要具備一定的專業(yè)知識(shí)和技能臨床應(yīng)用的局限性交叉反應(yīng)抗體或抗原可能與其他物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果干擾因素樣品質(zhì)量、操作因素等可能影響檢測(cè)結(jié)果靈敏度不足在某些情況下，ELISA方法的靈敏度不足以檢測(cè)微量抗原或抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)1新型檢測(cè)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)微流控芯片、納米材料等新技術(shù)應(yīng)用于ELISA檢測(cè)2多重檢測(cè)和自動(dòng)化技術(shù)發(fā)展多重ELISA檢測(cè)方法，提高檢測(cè)效率3分子診斷與融合技術(shù)ELISA技術(shù)與分子診斷技術(shù)結(jié)合，提高檢測(cè)精度和靈敏度新型檢測(cè)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)微流控芯片將ELISA反應(yīng)縮小到微米尺度，提高檢測(cè)效率和靈敏度納米材料納米材料具有高表面積、生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，可用于增強(qiáng)ELISA檢測(cè)信號(hào)多重檢測(cè)和自動(dòng)化技術(shù)多重ELISA檢測(cè)在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多種抗原或抗體自動(dòng)化技術(shù)開(kāi)發(fā)自動(dòng)化ELISA檢測(cè)系統(tǒng)，提高檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性分子診斷與融合技術(shù)PCR技術(shù)將ELISA技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度基因測(cè)序技術(shù)將ELISA技術(shù)與基因測(cè)序技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷結(jié)語(yǔ)酶聯(lián)免疫技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的檢測(cè)方法，在醫(yī)學(xué)、生物、食品等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用?？偨Y(jié)本課程內(nèi)容1