核“芯”13-PCR技術及應用

核“芯”13PCR技術及應用(時間：20分鐘)1.(2021·東北三校聯(lián)考)奶牛體內(nèi)含有溶菌酶基因(Lyz)，但表達水平較低。研究人員試圖通過替換啟動子的方法，實現(xiàn)Lyz基因在奶牛乳腺細胞中的高效表達。回答下列問題：(1)溶菌酶可破壞細菌的________，導致細菌過度吸水破裂而死亡；與使用抗生素相比，利用溶菌酶殺菌具有________________________________(至少答出兩點)等優(yōu)點。(2)從奶牛乳腺上皮細胞提取總RNA，經(jīng)________獲得cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，需要加入Lyz基因的________種引物。PCR擴增的前提是要根據(jù)________________________設計引物，引物與母鏈結合后控制不同溫度進行反復循環(huán)。(3)對Lyz基因片段和帶有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒進行連接，構建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒中綠色熒光蛋白基因的作用是作為________基因。為保證Lyz基因在奶牛乳腺細胞中高效表達，可用________的啟動子替換原有啟動子。將重組質(zhì)粒轉入奶牛乳腺細胞，再利用熒光顯微鏡檢測奶牛乳腺細胞中______________________，來判斷奶牛Lyz基因乳腺特異性表達質(zhì)粒是否構建成功。答案(1)細胞壁無毒、無害、無殘留、抗菌范圍廣、安全性高、不產(chǎn)生抗藥性等(答出兩點即可)(2)反轉錄兩一段已知目的基因的核苷酸序列(3)標記乳腺蛋白基因是否有綠色熒光解析(1)溶菌酶可通過分解細菌的細胞壁來殺死細菌；與抗生素相比，溶菌酶具有無毒、無害、無殘留、抗菌范圍廣、安全性高、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點。(2)以RNA為模板，經(jīng)反轉錄可獲得cDNA，要通過PCR技術獲得大量的Lyz基因，需要在進行PCR時，加入Lyz基因的兩種引物；PCR擴增的前提是要根據(jù)一段已知目的基因的核苷酸序列設計引物，引物與母鏈結合后控制不同溫度進行反復循環(huán)。(3)基因表達載體中含有啟動子、目的基因、終止子、標記基因和復制原點，其中標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，如抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等可作為標記基因。為保證Lyz基因在奶牛乳腺細胞中高效表達，需要用乳腺蛋白基因的啟動子替換原有啟動子。由于乳腺蛋白只在乳腺細胞中表達，所以如果奶牛Lyz基因乳腺特異性表達質(zhì)粒構建成功，則會在奶牛乳腺細胞中觀察到綠色熒光標記。2.(2021·武漢市調(diào)研)科學研究表明，新冠病毒是一種單鏈RNA病毒，其通過刺突蛋白(S蛋白)與人的ACE2受體識別結合，感染人的呼吸道上皮細胞。請回答下列問題：(1)獲取病毒RNA后，通過________過程得到cDNA，再利用PCR技術擴增S蛋白基因，擴增前要根據(jù)一段目的基因的核苷酸序列合成引物，PCR過程中需要引物的原因是____________________________________________________________________________________________________________________________。(2)科學家利用S蛋白刺激實驗動物的免疫系統(tǒng)，獲取________，用于新冠病毒的檢測及篩查。(3)將重組質(zhì)粒導入受體細胞后，首先要檢測____________________________________________________________________________________________________，這是目的基因能否在受體細胞中穩(wěn)定遺傳的關鍵。常采用DNA分子雜交技術進行檢測，即在含有目的基因的DNA片段上用________等作標記，以此作為探針來檢測。(4)用熒光探針檢測目的基因時，先將探針與染色體共同煮沸，使DNA雙鏈中的________斷裂，形成單鏈。隨后在降溫復性過程中，探針的堿基依據(jù)________原則，與染色體上的特定基因序列形成較穩(wěn)定的雜交分子。兩條姐妹染色單體中最多可有________條熒光標記的DNA片段。答案(1)逆轉錄DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈(合理即可)(2)抗體(3)轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因放射性同位素(4)氫鍵堿基互補配對4解析(1)獲取病毒的RNA后，通過逆轉錄過程得到cDNA，再利用PCR技術擴增S蛋白基因。由于DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，不能從頭開始合成DNA，故利用PCR技術擴增S蛋白基因前要根據(jù)一段目的基因的核苷酸序列合成引物。(2)利用S蛋白刺激實驗動物的免疫系統(tǒng)，可獲取特異性抗體，然后利用抗體能夠和抗原特異性結合的特點，進行新冠病毒的檢測及篩查。(3)將重組質(zhì)粒導入受體細胞后，首先要檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因，這是目的基因能否在受體細胞中穩(wěn)定遺傳的關鍵。常采用DNA分子雜交技術進行檢測，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針來進行檢測。(4)將探針與染色體共同煮沸會使DNA雙鏈中的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA分子。隨后在降溫復性過程中，探針的堿基可依據(jù)堿基互補配對原則與染色體上的特定基因序列形成較穩(wěn)定的雜交分子。兩條姐妹染色單體中最多含有兩個目的基因、四條DNA單鏈，最多可有4條熒光標記的DNA片段。3.(2021·南昌市模擬)人乳鐵蛋白是乳汁中一種重要的糖蛋白。乳鐵蛋白不僅可參與鐵的轉運，而且還具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等強大生物功能。如圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳腺生物反應器的過程。圖中Tetr表示四環(huán)素抗性基因，Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，圖中標注了BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ三種限制酶的酶切位點。據(jù)圖回答：(1)若用PCR技術擴增人乳鐵蛋白基因，其前提條件是有一段________，以便合成相應的引物，合成的引物能與待擴增區(qū)段________(填“中間”“兩端”“左端”或“右端”)的DNA序列互補配對。(2)圖中將人乳鐵蛋白基因插入載體，需用________限制酶同時切割載體和人乳鐵蛋白基因。篩選含有重組載體的大腸桿菌時，首先需要在含________的培養(yǎng)基上進行。經(jīng)過兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)后再從________(填字母)處挑出大腸桿菌，擴增帶有外源DNA的重組載體。為使人乳鐵蛋白基因在牛的乳腺細胞中特異性表達，應在基因的上游插入________。(3)過程②的代孕牛需要進行________處理。若需獲得多頭轉基因牛，可對早期胚胎進行分割，對囊胚階段的胚胎進行分割時需要注意________。(4)為檢測轉基因牛的乳汁中是否含有人乳鐵蛋白，可采用________技術。答案(1)已知的人乳鐵蛋白基因(目的基因)的核苷酸序列兩端(2)HindⅢ和BamHⅠ氨芐青霉素D牛乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件(3)同期發(fā)情將內(nèi)細胞團均等分割(4)抗原—抗體雜交解析(1)利用PCR技術擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這段序列合成引物，合成的引物能與待擴增區(qū)段兩端的DNA序列互補配對。(2)分析題圖，若用SmaⅠ切割人乳鐵蛋白基因，會使其遭到破壞，需要用限制酶BamHⅠ和HindⅢ同時切割載體和人乳鐵蛋白基因(目的基因)。用限制酶BamHⅠ、HindⅢ切割載體時會破壞Tetr基因，而Ampr基因不會被破壞，因此篩選含有重組載體的大腸桿菌時，首先需要在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中進行，在該培養(yǎng)基上能生存的大腸桿菌有兩種：含有重組載體的大腸桿菌、含有未導入目的基因的載體的大腸桿菌，再采用影印法，在含有四環(huán)素的Tet瓊脂平板上進行篩選，圖中B處無菌落，說明與此位置對應的Amp瓊脂平板上D處生長的菌落是導入重組載體的大腸桿菌。要使人乳鐵蛋白基因在牛的乳腺細胞中特異性表達，需在目的基因的上游插入牛乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件。(3)過程②為胚胎移植，胚胎移植前需對代孕牛進行同期發(fā)情處理。在對囊胚階段的胚胎進行分割時，需要注意將內(nèi)細胞團均等分割，否則會影響分割后胚胎的恢復和進一步發(fā)育。(4)檢測轉基因牛的乳汁中是否含有人乳鐵蛋白，可采用抗原—抗體雜交技術。4.(2021·河南開封市模擬)如圖表示某植物的多種育種流程，請回答下列有關問題：(1)圖1中，培育子代Ⅱ和子代Ⅲ所用育種方法的原理________(填“相同”或“不相同”)。(2)圖1中，欲從子代Ⅲ中選育顯性純合個體需________，培育子代V的過程中發(fā)生了________(填變異類型)。(3)圖2中，利用PCR技術擴增目的基因前，需先獲得供體細胞的________。為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的5′端(見圖3)加上限制酶酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制酶酶切位點，主要目的是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。圖3答案(1)相同(2)