DB13-T5688-2023蜜蜂微孢子蟲(chóng)病綠色防治技術(shù)規(guī)程

ICS65.020

CCSB16

13

河北省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB13/T5688—2023

蜜蜂微孢子蟲(chóng)病綠色防治技術(shù)規(guī)程

2023-05-06發(fā)布2023-06-06實(shí)施

河北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB13/T5688—2023

蜜蜂微孢子蟲(chóng)病綠色防治技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了蜜蜂微孢子蟲(chóng)病綠色防治的術(shù)語(yǔ)和定義、技術(shù)流程圖、診斷與鑒定、防控等技術(shù)

要求。

本文件適用于蜜蜂微孢子蟲(chóng)病癥狀、形態(tài)及分子生物學(xué)診斷和綜合防治。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用

文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）

適用于本文件。

GB/T19168蜜蜂病蟲(chóng)害綜合防治規(guī)范

SN/T1683蜜蜂微孢子蟲(chóng)病診斷方法

OIE陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

蜜蜂微孢子蟲(chóng)

是一種侵染成年蜜蜂中腸上皮細(xì)胞引起蜜蜂發(fā)病的致病性真菌，包括蜜蜂微孢子蟲(chóng)和東方蜜蜂

微孢子蟲(chóng)2個(gè)種。

3.2

消毒

指為殺滅包括蜜蜂疫病病原體或寄生蟲(chóng)而采取的一種措施，適用于可能被直接或間接污染的場(chǎng)

所、工具及各種物體。

[來(lái)源：OIE陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典，有修改]。

3.3

監(jiān)測(cè)

指系統(tǒng)而持續(xù)地收集、整理和分析與蜜蜂微孢子蟲(chóng)病有關(guān)的信息，并及時(shí)向相關(guān)人士傳遞信息

以便采取相應(yīng)的措施。

[來(lái)源：OIE陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典，有修改]。

4蜜蜂微孢子蟲(chóng)病綠色防治技術(shù)

蜜蜂微孢子蟲(chóng)病綠色防治技術(shù)流程圖(如圖1)：

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圖1蜜蜂微孢子蟲(chóng)病綠色防治技術(shù)流程圖

5診斷與鑒定

5.1診斷流程

當(dāng)觀察到蜂群出現(xiàn)典型癥狀時(shí)，應(yīng)遵循先通過(guò)個(gè)體癥狀觀察初步確診，再取樣后通過(guò)顯微鏡鑒

定即可確診。如需對(duì)沒(méi)有明顯癥狀的蜂群進(jìn)行早期診斷或例行養(yǎng)蜂場(chǎng)的病害監(jiān)控則可采用PCR鑒定方

法。

5.2癥狀

5.2.1蜂群癥狀

5.2.1.1急性重癥感染

當(dāng)蜂群感染處于后期重癥階段時(shí)有如下癥狀：

a)蜂群糞便：蜂箱外壁或周圍地面會(huì)出現(xiàn)大量棕色約0.5cm長(zhǎng)的細(xì)長(zhǎng)條狀糞便，或出現(xiàn)糞便

變稀、顏色變深現(xiàn)象；

b)蜂群表現(xiàn)：在蜂巢入口處及養(yǎng)蜂場(chǎng)地面，會(huì)見(jiàn)到患病爬行的和死去的蜜蜂，且蜂群群勢(shì)急

速下降。

5.2.1.2輕度感染

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除了部分成年蜜蜂在蜂箱外爬行外，沒(méi)有其他異常表現(xiàn)。

5.2.2蜜蜂個(gè)體癥狀

蜜蜂個(gè)體感染病原后可通過(guò)如下癥狀進(jìn)行初步判斷。

a)病蜂活動(dòng)狀況，患病蜜蜂表現(xiàn)出行動(dòng)遲滯，腹部膨大，飛翔無(wú)力等癥狀；

b)用鑷子從具有典型癥狀的蜜蜂腹部末端夾出中腸及后腸仔細(xì)觀察，健康蜜蜂中腸呈棕色，

環(huán)紋明顯，并且具有彈性和光澤。如觀察到蜜蜂中腸膨大，呈乳白色，環(huán)紋不清，失去彈

性和光澤，可初步確定為蜜蜂微孢子蟲(chóng)病。

5.3實(shí)驗(yàn)室鑒定

5.3.1顯微鏡鑒定

5.3.1.1樣品處理

將采集的蜜蜂樣本，分離腹部置于研缽中，加入5mL～10mL蒸餾水研磨。取研磨的組織涂片，

在明場(chǎng)或相差光學(xué)顯微鏡下以400～600倍進(jìn)行檢查。

5.3.1.2鑒定

5.3.1.2.1初診

如在視野中見(jiàn)到長(zhǎng)約5μm～7μm，寬約3μm～4μm，橢圓形的孢子，邊界折光明顯，則可初步確

診。

5.3.1.2.2鑒別

按SN/T1683相關(guān)方法與酵母、真菌孢子、脂肪體或馬氏管變形蟲(chóng)囊包進(jìn)行鑒別。

5.3.2PCR鑒定

5.3.2.1DNA提取

提取緩沖液配方見(jiàn)表1：

表1DNA提取緩沖液配方

試劑名稱濃度

CTAB0.03M

Tris0.05M

EDTA0.01M

NaCl1.1M

注：緩沖液最終用ddH2O將pH值調(diào)至8.0

操作步驟如下：

a)取蜜蜂的中腸（取樣部位見(jiàn)圖1），置于一個(gè)預(yù)冷的（加入液氮）1.5mL離心管中并勻漿；

b)離心管中加入300μL提取緩沖液以及4μL20mg/mL的蛋白酶K溶液，置于60℃水浴3h

c)加入等體積（300μL）的苯酚:氯仿為1:1的混合液并輕輕混勻，13000rpm離心15min

d)將上清液移至另一個(gè)新管中，沉淀物重復(fù)用苯酚:氯仿為1:1的混合液混勻并離心1次，

合并2次的上清液；

e)加入預(yù)冷的600μL95%的乙醇后加入30μL3mol/L的NaOAc，輕輕混勻，置于-20℃下過(guò)

夜；

f)10000rpm離心15min，移去上清液，沉淀用1mL70%的乙醇洗滌兩次

g)烘干10min后加入30μLddH2O，置于65℃水浴10min，輕輕溶解混勻管中的沉淀物；

h)10000rpm離心10s以除去未溶解的物質(zhì)，即得蜜蜂中腸組織的DNA；

i)提取的DNA溶液置于-20℃保存，備用。

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標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明:

A—中腸；

B—小腸；

C—后腸；

D—蟄針。

圖2蜜蜂中腸取樣部位

5.3.2.2PCR擴(kuò)增

將前步所提取的DNA樣品稀釋5倍進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及引物按附錄A（表A.1、A.2）。將15μL

PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)確吸取至PCR板孔中，設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

a)94℃2.5min；

b)94℃15s，61.8℃30s，72℃45s，共36個(gè)循環(huán)；

c)72℃延伸7min；

5.3.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物的分離與鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，GoldView染色，照膠。

5.3.2.4診斷結(jié)果與辨別

通過(guò)以下凝膠中電泳條帶的位置可最終判別蜜蜂是否感染微孢子蟲(chóng)病原及種類：

a)只有當(dāng)凝膠中115bp位置有明顯條帶時(shí)結(jié)果可信；

b)當(dāng)凝膠中在218bp位置有明顯條帶時(shí)即可認(rèn)為樣品中含有東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)；

c)當(dāng)凝膠中在321bp位置有明顯條帶時(shí)即可判定樣品中含有蜜蜂微孢子蟲(chóng)。

5.4取樣

5.4.1取樣數(shù)量

為保證所采集的樣品具有代表性，應(yīng)按以下標(biāo)準(zhǔn)確定樣品數(shù)量。

a)蜂群數(shù)量50群（含）以下的養(yǎng)蜂場(chǎng)選取1群取樣，每群取樣約20～30只蜜蜂；

b)蜂群數(shù)量50群以上的養(yǎng)蜂場(chǎng)選取3群取樣，每群取樣約20～30只蜜蜂。

5.4.2取樣方法

不同的取樣目的應(yīng)分別遵循如下方法采集樣品。

a)非定量診斷時(shí)，直接從蜂巢入口附近選取具有典型癥狀的成年蜜蜂；

b)定量調(diào)查蜂群受感染程度時(shí)，隨機(jī)選取蜂群并隨機(jī)提取群內(nèi)1張巢脾，隨機(jī)抓取脾上的成

年蜜蜂。

5.4.3樣品保存

常溫、干燥保存于紙盒內(nèi)。

6防控

6.1養(yǎng)蜂場(chǎng)場(chǎng)址選擇

養(yǎng)蜂場(chǎng)場(chǎng)址按GB/T191683.1蜂場(chǎng)場(chǎng)址的選擇給出的要求進(jìn)行選擇。

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6.2飼養(yǎng)管理

6.2.1飼料

6.2.1.1春繁飼料

春繁期飼喂蜂蜜花粉時(shí)，不使用來(lái)歷不明的花粉，飼喂前應(yīng)對(duì)花粉進(jìn)行不少于20min的蒸汽消

毒。

6.2.1.2越冬飼料

a)飼喂越冬飼料前應(yīng)對(duì)飼料進(jìn)行顯微鏡檢查，如巢脾中的蜂蜜或花粉中發(fā)現(xiàn)有微孢子蟲(chóng)則應(yīng)

對(duì)巢脾及飼料進(jìn)行消毒；

b)補(bǔ)飼選擇蜂蜜或白糖，白糖需要高溫溶解；

c)越冬飼料的儲(chǔ)備量，視群勢(shì)強(qiáng)弱與越冬期長(zhǎng)短貯備蜜脾。

6.2.2預(yù)防消毒

a)養(yǎng)蜂器具：春繁前應(yīng)對(duì)養(yǎng)蜂器具進(jìn)行修整，巢框、巢脾及起刮刀等養(yǎng)蜂器具用2%～3%氫氧

化鈉溶液浸泡30min后清水清洗晾干再使用。蜂箱消毒可用火焰噴燈灼燒至微變色；

b)巢脾、蜂箱：長(zhǎng)期保存的巢脾應(yīng)置于空蜂箱中，蜂箱應(yīng)整齊疊放并將所有縫隙密封，然后

將盛有50mL濃度4%冰醋酸的容器放入蜂箱進(jìn)行熏蒸消毒；

c)病死蜂：隨時(shí)收集養(yǎng)蜂場(chǎng)地面的病蜂及死亡蜂，集中焚燒或深埋，并在養(yǎng)蜂場(chǎng)地面撒生石

灰消毒。

6.3監(jiān)測(cè)

每年從去除越冬包裝開(kāi)始，直至下次越冬包裝前，應(yīng)至少每3個(gè)月對(duì)蜂群進(jìn)行1次蜜蜂微孢子蟲(chóng)

病的病原監(jiān)測(cè)，定量調(diào)查蜂群受感染程度。根據(jù)上兩個(gè)年度的監(jiān)測(cè)記錄及當(dāng)前監(jiān)測(cè)結(jié)果隨時(shí)調(diào)整本

年度的防控措施。

6.4防治

6.4.1預(yù)防

結(jié)合蜂群的飼喂，將1g食品級(jí)檸檬酸粉劑加入1000g飼料中，持續(xù)飼喂7d，越冬飼料里不得添

加。

6.4.2治療

當(dāng)蜂群出現(xiàn)大量因排泄不暢的爬蜂時(shí)，取4g大黃蘇打片，溶于1000mL濃度為1:1的蔗糖水中，

噴脾，每張脾100mL。大流蜜期內(nèi)及之前1個(gè)月內(nèi)不得使用。

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

PCR反應(yīng)體系及引物序列

A.1PCR反應(yīng)體系

表A.1PCR反應(yīng)體系試劑配比

試劑劑量（μL）濃度

5×PCRbuffer3

引物610μM

OneTaq聚合酶0.25U/μL

dNTPs0.510mM

DNA模板2

ddH2O3.3

注1：3對(duì)引物的正負(fù)引物各1μL

注2：反應(yīng)體系15μL

A.2引物序列

表A.2引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物信息