KTB1119-CN-丙酮酸羧化酶（PC）活性檢測試劑盒（微量法）

丙酮酸羧化酶（PC）活性檢測試劑盒（微量法）原理丙酮酸羧化酶（Pyruvatecarboxylase，PC）廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中，但在植物體和大部分細菌中卻不含此酶。PC是供給草酰乙酸的主要補充反應，是糖異生過程的第一個限速酶。CheKine?丙酮酸羧化酶（PC）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動物組織、細胞等生物樣本。在該試劑盒中，PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，在340nm下測定NADH氧化速率，即可反映PC活性。包裝清單試劑盒組分規(guī)格儲存條件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠ10.8mL21.6mL4℃，避光保存ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預期差異較大的樣本進行預實驗。自備耗材·酶標儀或可見光分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機·去離子水·勻漿器或研缽試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。注意：ExtractionBuffer有毒且有刺激性氣味，建議在通風櫥進行實驗。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫。-20℃避光保存。ReagentIV：臨用前配制；48T加入0.6mL去離子水，96T加入1.2mL去離子水，充分溶解待用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復凍融。WorkingReagent：臨用前配制；用ReagentⅠ溶解ReagentII和ReagentIII，將溶解后的ReagentII和ReagentIII轉移到ReagentⅠ中，充分溶解待用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復凍融樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。動物組織或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：稱取約0.1g樣本或收集500萬細胞，加入1mLExtractionBuffer，用勻漿器或研缽冰浴勻漿。將勻漿600g，4℃離心5min，棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11,000g，4℃離心10min，上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的PC（可選做）。沉淀即為線粒體，加入1mLExtractionBuffer，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次），用于線粒體PC測定。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟酶標儀或可見光分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，可見光分光光度計用去離子水調(diào)零。將WorkingReagent置于37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）預熱5min。操作表（下述操作在96孔UV板或微量玻璃比色皿中進行）：試劑測定孔（μL）樣本10ReagentIV10WorkingReagent180迅速混勻后，記錄340nm處10s時吸光值A1和130s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.01可適當加大樣本量或延長反應時間。如果ΔA大于0.5，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。使用96孔UV板測定的計算公式如下PC活性的計算按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：每毫克蛋白每分鐘消耗1nmolNADH為1個酶活單位。PC上清(U/mgprot)=[ΔA上清×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=3,216×ΔA上清÷CprPC沉淀(U/mgprot)=[ΔA沉淀×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=3,216×ΔA沉淀÷Cpr總PC(U/mgprot)=PC上清+PC沉淀=3,216×ΔA上清÷Cpr+3,216×ΔA沉淀÷Cpr按樣本鮮重計算：酶活單位定義：每克樣本每分鐘消耗1nmolNADH為1個酶活單位。PC上清(U/g鮮重)＝[ΔA上清×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=3,216×ΔA上清÷WPC沉淀(U/g鮮重)＝[ΔA沉淀×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=3,216×ΔA沉淀÷W總PC(U/g鮮重)=PC上清+PC沉淀=3,216×ΔA上清÷W+3,216×ΔA沉淀÷W按細胞數(shù)量計算：酶活單位定義：每104細胞每分鐘消耗1nmolNADH為1個酶活單位。PC上清(U/g104cell)＝[ΔA上清×V反總÷(ε×d)×109]÷(n×V樣÷V樣總)÷T=3,216×ΔA上清÷nPC沉淀(U/g104cell)＝[ΔA沉淀×V反總÷(ε×d)×109]÷(n×V樣÷V樣總)÷T=3,216×ΔA沉淀÷n總PC(U/g104cell)=PC上清+PC沉淀=3,216×ΔA上清÷n+3,216×ΔA沉淀÷nΔA上清：上清測定值；ΔA沉淀：沉淀測定值；ε：NADH在340nm處摩爾吸光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應體系總體積，2×10-4L；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入ExtractionBuffer體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應時間，2min；n：細胞總數(shù)，以萬計。使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進行計算即可。結果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.本試劑盒測定兔心臟和肝臟中總PC的活性相關產(chǎn)品CatalogNo.Pro