免疫檢測技術(shù)課件

免疫檢測技術(shù)免疫檢測是目前生物學檢測方法中用途最廣泛的一種方法。具有高度精確、靈敏、特異的特點。可用于免疫學的基礎理論和應用研究，也可應用于生物學研究的各個領域。1、免疫疾病診斷

2、動物植物生理活動研究（激素、維生素）3、物種及微生物鑒定

4、動物、植物性狀的免疫標記

5、免疫增強藥物和疫苗的研究

6、發(fā)病機理研究7、分子生物學研究

免疫檢測技術(shù)在生物科學領域中的應用：網(wǎng)格學說（latticetheory）抗體過?？乖^?？贵w抗體比例合適抗原抗體二、影響抗原抗體反應的因素①溫度：在一定溫度范圍內(nèi)，提高溫度可加速反應速度，縮短反應時間，常用反應溫度為37-45℃。②溶液的pH：pH過高或過低可改變抗原和抗體理化性質(zhì)，影響反應結(jié)果，因此溶液的pH應適宜（pH6-8）。③電解質(zhì)：反應中必須有適宜的電解質(zhì)（0.85%NaCl）參與，否則不出現(xiàn)可見反應。三、抗原抗體反應類型1.沉淀反應2.凝集反應3.補體參與的反應4.中和反應5.免疫標記技術(shù)第二節(jié)常見免疫檢測方法可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、細胞裂解液或組織液等）與相應抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反應。一、免疫沉淀反應一、免疫沉淀反應

1.液相沉淀反應2.凝膠擴散沉淀3.凝膠免疫電泳絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀單向瓊脂擴散試驗雙向瓊脂擴散試驗血清免疫電泳火箭電泳對流免疫電泳免疫印跡等絮狀沉淀試驗操作步驟：（1）將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2）各管加入一定濃度的適量抗血清。（3）振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。（4）產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。絮狀沉淀試驗方法簡單，設備要求低，敏感度較低，目前多用以測定抗原抗體反應的最適比。環(huán)狀沉淀試驗操作步驟：（1）用毛細滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免產(chǎn)生氣泡。（已知！）（2）將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待測?。?）置沉淀管于室溫下使其反應，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。應用：主要用于抗原的定性試驗。用已知抗體來檢測未知抗原。

（診斷炭疽的Ascoli實驗、細菌分型、血跡鑒定）。

2.凝膠擴散沉淀凝膠擴散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的擴散部位相遇形成沉淀線的反應。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最常用的方法為：①單向瓊脂擴散試驗②雙向瓊脂擴散試驗單向瓊脂擴散試驗

原理：

將適當濃度的抗體混入瓊脂凝膠中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入待測的抗原物質(zhì)，使抗原在凝膠中由小孔自由向周圍擴散，并在小孔周圍合適的位置與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關。單向免疫擴散試驗示意圖雙向免疫擴散試驗雙向免疫擴散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關性分析。3.免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點：一是加快了沉淀反應的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應，以此作更細微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等

血清免疫電泳將抗原混合物（病人血清）在凝膠中用電泳分離后，沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進行雙向擴散。沉淀線的特點顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加。免疫電泳原理圖解火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實質(zhì)上是加速度的單向擴散。

沉淀線的高度與抗原量成正比火箭電泳圖二、凝集反應（Agglutination）

顆粒性抗原（如細菌、細胞）與相應抗體，在適當電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反應。1、直接凝集：將細菌或紅細胞與相應的抗體直接反應，出現(xiàn)細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面，與相應抗體反應出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。妊娠免疫診斷試驗

孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。三、補體結(jié)合實驗（2個系統(tǒng)，5種成分）已知抗原加入血清（檢測抗體）加入標準量補體加入包被抗體的紅細胞檢測紅細胞溶解情況AgYYPatient’sserum

YYYYYYYYAbNoAbAg三、補體結(jié)合實驗（2個系統(tǒng)，5種成分）免疫標記技術(shù)是采用酶、熒光素、放射性核素等標記物標記抗原或抗體所進行的抗原抗體反應。免疫標記技術(shù)既可對樣品作定性、定量檢測，也可進行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應用最廣泛的免疫學檢測技術(shù)。四、免疫標記技術(shù)常見標記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)

四、免疫標記技術(shù)該法是用放射性核素作為標記物標記抗原或抗體所進行的抗原抗體反應，盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設備且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的靈敏度（pg）和自動化檢測等特點，因此在實驗研究和臨床檢測中仍被廣泛應用。主要用于激素、小分子藥物、腫瘤標志物等小分子化合物的定量分析。1.放射免疫技術(shù)（125I）放射免疫分析－基本原理競爭性結(jié)合反應的經(jīng)典標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力

Ag*AbAg標記抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標準曲線上讀知含量

測定Ag*-Ab和游離Ag*放射性

放射免疫測定法(RIA)示意圖RIA法原理及標準曲線

7550301001101001000未標記抗原濃度（ng/mL)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）Ag*-AbAg*將熒光素（異硫氰酸熒光素或羅丹明等）標記抗體，制成熒光抗體診斷試劑。用熒光顯微鏡觀察熒光的產(chǎn)生或熒光強度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。2.免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)——直接法AgY熒光素標記的特異性抗體組織切片免疫熒光技術(shù)——間接法AgYY熒光素標記的抗抗體組織切片待測抗體免疫熒光染色顯示細胞骨架

免疫熒光染色是利用抗原－抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)熒光染料標記的抗體對細胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定性或定量研究的方法。該技術(shù)與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對特定的蛋白質(zhì)進行細胞或組織內(nèi)的精確定位。常用于抗原、抗體標記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：RhodamineB,TexasRed,Alexa-546,568,594顯示藍色熒光：Alexa－350用Alexa488標記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細胞核:紅色,DAPI染色人皮膚角化細胞免疫熒光染色用抗α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細胞核:紅色,DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片)PtK1細胞免疫熒光染色本法是抗原抗體反應的特異性與酶對底物的高效催化活性相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。酶標記的抗原或抗體與待檢標本中的相應成分特異性結(jié)合，根據(jù)酶作用底物后的顏色變化，采用肉眼或酶標檢測儀分析、判斷結(jié)果。常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者用于檢測可溶性抗原或抗體，后者常用于檢測組織中或細胞表面的抗原。3.免疫酶測定法是在固相載體（通常為聚苯乙烯反應板）表面進行的抗原抗體反應。實驗中常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP），底物為二苯基聯(lián)苯胺。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：ELISA試驗三個必要的試劑(1)固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）(2)酶標記的抗原或抗體（標記物）(3)酶作用的底物（顯色劑）底物顯色定性或定量的分析原理包被反應加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復合物與未結(jié)合的分離1234基本步驟五種常見的檢測方法1雙抗夾心法（測定抗原）2測定抗體的間接法3競爭法（測定抗原）4捕獲包被法測IgM抗體5ABS-ELISA法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及低于二價的小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心

1雙抗夾心法測抗原2間接法測抗體幾種標記/檢測技術(shù)靈敏度的比較酶標熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9幾種標記/檢測試劑的有效期比較酶標熒光放免發(fā)光有效期（月）1815129630020,00040,00060,00080,000100,000試劑盒儀器特殊防護治理污染人民幣人民幣三種免疫測定技術(shù)的成本及費用三種免疫測定技術(shù)的成本及費用放免酶標發(fā)光A.

將Ab吸附在固相載體表面;B.加入酶標Ag和待測Ag，競爭結(jié)合Ab；對照只加入酶標Ag；C.加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知Ag量。3競爭法測定抗原血清標本中的IgM包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM

加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合抗人IgM抗體包被加入血清標本加入特異性抗原試劑加入針對特異性抗原的酶標抗體加底物顯色4捕獲包被法測IgM抗體捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體底物顯色

ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，生物素為小分子化合物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。

1個親和素分子可與4個生物素分子結(jié)合。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可提高ELISA的敏感度。

5ABS-ELISA法ABS-ELISA法

①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；⑤：辣根過氧化物酶HRP-酶標鏈親和素（Avidin）；⑥：DAB顯色液；⑦：顯色；物理基礎主要包括：1.氣體定律2.物態(tài)變化3.流體運動第一節(jié)氣體定律一.理想氣體的狀態(tài)方程（一）理想氣體（idealgas）:只考慮分子間相互碰撞，不考慮其他相互作用，分子體積和分子間的引力均可忽略不計的氣體，稱之為理想氣體。

（二）理想氣體的狀態(tài)方程對于一定量的理想氣體，它的壓強（P）體積（V）和絕對溫度（T）存在下式關系：MPV=RT

（二）理想氣體的狀態(tài)方程1.R=8.314J/(mol.k)稱為摩爾氣體常數(shù)2.表示1摩爾質(zhì)量（Kg）,3.M為容器內(nèi)氣體的質(zhì)量（Kg）4.V為容器內(nèi)氣體的體積（m3）5.T為溫度（K開氏度或絕對度）6.P為壓強（Pa）（二）理想氣體的狀態(tài)方程由于氣體的密度=

M/V,上式也可寫成

P=RT

注意：這兩個方程在實際應用時，在溫度不太低，壓強不太高的條件下，計算結(jié)果與實驗數(shù)值有微小差別；但溫度越低、壓強越大計算結(jié)果與實驗數(shù)值的偏差越大。這就促使了范德瓦爾斯方程的出現(xiàn)。二、范德瓦爾斯方程（一）分子大小不可忽略的修正值壓強很大時，氣體的體積減少至很小，氣體分子本身所占的體積就不能再忽略不計。（二）分子引力不可忽略的修正值分子間引力的存在使器壁附近分子受到向容器內(nèi)部的引力，減弱氣體分子施與器壁的壓力。二、范德瓦爾斯方程1.由于實際氣體分子本身占有體積，分子之間存在相互作用力。范德瓦爾斯（Vanderwaals)考慮到這兩個因素，對理想氣體狀態(tài)方程加以修正，這就是范德瓦爾斯方程：

二、范德瓦爾斯方程

a（P+V2）(V-b)=RTa為壓強修正值,b為體積修正值，這兩者決定于氣體的性質(zhì)，可由實驗測定。例：Co2的a=0.366J.m3/mol2,b=0.0428x10-3m3/mol.二、范德瓦爾斯方程2.由于分子間的引力而減少的氣體的壓強通常稱之為內(nèi)壓強，用ΔP表示。3.范德瓦爾斯方程比理想氣體方程更接近于實際情況，但也不是絕對準確的。三、安德魯斯試驗1.安德魯斯（Andrews）曾在不同溫度下對二氧化碳作了系統(tǒng)的等溫壓縮試驗。二氧化碳當溫度高于31.1度時，即使高壓下也不能液化。三、安德魯斯試驗2.氣體靠壓縮液化有一最高溫度界限，稱為臨界溫度（二氧化碳的臨界溫度是31.1度），以Tc表示，和臨界溫度相應的等溫線稱為臨界等溫線。三、安德魯斯試驗3.安德魯斯畫了二氧化碳實際等溫線，發(fā)現(xiàn)有四個區(qū)：氣態(tài)區(qū)、汽態(tài)區(qū)、汽液共存區(qū)、液態(tài)區(qū)。4.氣態(tài)區(qū)域分為兩部分：在臨界等溫線以下區(qū)域成為汽；在臨界等溫線以上區(qū)域成為氣。5.單純依靠壓縮是不能使氣體液化的，必須在一定溫度下。四、混合氣體的壓強1.混合氣體中，各種成分氣體都有自己的壓強，稱為分壓強。2.道爾頓（Dalton）分壓定律:混合氣體的壓強等于組成混合氣體的各成分的分壓強之和。

P空氣=PN2+PO2+PH2O+PCo2四、混合氣體的壓強3.分壓強=容積百分比x總壓強4.不均勻的分壓強會帶來什么結(jié)果？氣體流向：同種氣體流向與該種氣體分壓強大小有關，氣體總是由分壓強大的地方向分壓小的地方轉(zhuǎn)移。例：O221kPa?13.6Kpa五、氣體的彌散1.彌散：當氣體的密度不均勻時，氣體的分壓強就會有差異，氣體分子從分壓大的地方向分壓小的地方移動，稱之為彌散。肺泡PO2=13.83kPa（血管PO2=5.32kPa）五、氣體的彌散2.肺泡氣（PO2=13.83kPa）彌散肺動脈血進入肺毛細血管時（PO2=5.32kPa）毛細血管動脈端（PO2=12.64kPa）彌散組織間液（PO2=5.32kPa）排出二氧化碳的過程與供氧過程相反。五、氣體的彌散3.主動脈血氧分壓為什么低于13.83kPA？由于少量肺循環(huán)的靜脈血未與肺泡氣進行交換而直接流入到動脈中，降低了肺循環(huán)后流入大動脈的血液的氧含量，是氧分壓由13.83kPa降至12.64kPa.五、氣體的彌散4.吸入性麻醉藥的彌散在機體內(nèi)，由于氧不斷消耗，二氧化碳不斷產(chǎn)生，故不能達到靜態(tài)平衡。而不被代謝的吸入性麻醉藥進入體內(nèi)的彌散過程與氧相同，不同的是可以趨向靜態(tài)平衡，平衡時，組織內(nèi)的分壓和吸入氣中的分壓值相等，當麻醉氣體的腦內(nèi)分壓和吸入氣中的分壓值相等時，臨床上認為達到麻醉濃度。六、氣體在液體中的溶解度1.溶解度:在一定溫度與壓力的條件下，當液面上的氣體和溶解的氣體達到動態(tài)平衡時，該氣體在液體中的濃度稱為溶解度。2.表示方式：用100ml液體中能溶解氣體體積的毫升數(shù)表示，寫成vol%,記為C例:在37oC,一個大氣壓下，100ml的血中能溶解氧化亞氮0.468ml,即氧化亞氮的溶解度為0.468vol%六、氣體在液體中的溶解度3.溶解度的大小：通常隨溫度升高而降低，隨壓強增加而增加。4.亨利定律：C=aPC表示溶解度，a是比例常數(shù)，稱為氣體的溶解系數(shù)，其只相當于壓強為一個單位時的氣體溶解度。P為壓強。實際應用：用高壓氧艙治療缺氧性疾病六、氣體在液體中的溶解度5.溶解度與麻醉誘導及清醒速度的關系：溶解度小的麻醉藥（異氟醚），吸入后肺泡內(nèi)分壓與腦內(nèi)分壓達到平衡的時間短，誘導迅速；一旦停止吸入，迅速從體內(nèi)排出并消失，因此清醒快。七、分配系數(shù)1.分配系數(shù)（distributecoefficient）:一定溫度下，某物質(zhì)在兩相中處于動態(tài)平衡時，該物質(zhì)在兩相中濃度的比值，是溶解度的另一種表達方式。揮發(fā)性藥經(jīng)肺泡進入血液，可把肺泡氣和血液看成互相鄰接的氣、液兩相，當其在兩相中處于動態(tài)平衡時，這兩相中麻醉藥的濃度比值，就成為該藥的血/氣分配系數(shù)。七、分配系數(shù)實例：恩氟烷在37oC時的血/氣分配系數(shù)是1.9，即表示溶解在血中的濃度是肺泡濃度的1.9倍。2.血/氣分配系數(shù)與麻醉（1）血/氣分配系數(shù)與麻醉誘導快慢有關。異氟醚在血中溶解度小，血/氣分配系數(shù)小，麻醉誘導迅速，清醒也快。

七、分配系數(shù)（2）油/氣分配系數(shù)麻醉強度有關：油/氣分配系數(shù)越高，作用強度越大。（甲氧氟烷的油/氣分配系數(shù)最大，麻醉強度最大）（3）橡膠/氣分配系數(shù)影響誘導和蘇醒時間：甲氧氟烷的橡膠/氣分配系數(shù)很大在使用甲氧氟烷時，一部分被麻醉機裝置所吸收，導致濃度降低，誘導時間延長；麻醉結(jié)束時，甲氧氟烷逐漸釋放，是蘇醒延長。第二節(jié)物態(tài)的變化物質(zhì)分子可以聚集成固、液、氣三種狀態(tài)，在一定溫度與壓力下，物質(zhì)的三態(tài)可以互相轉(zhuǎn)變，稱為相變。在呼吸和麻醉中常遇到液、氣之間的相變。一、氣化1.定義：物質(zhì)由液態(tài)變成氣態(tài)的過程。2.氣化的方式：蒸發(fā)和沸騰（一）蒸發(fā)：液體表面發(fā)生的氣化現(xiàn)象。（1）