食品毒理學(xué) 化學(xué)毒物的致突變作用學(xué)習(xí)課件

第八章化學(xué)毒物的致突變作用1927年Muller首先發(fā)現(xiàn)電離輻射可引起基因突變1947年Auerback報告某些化學(xué)物質(zhì)也能導(dǎo)致基因突變先后有很多學(xué)者研究了化學(xué)物質(zhì)對生物機體遺傳機構(gòu)的影響。并認(rèn)為環(huán)境因素導(dǎo)致機體遺傳機構(gòu)的改變可以引起人類的某些遺傳性疾病及癌癥。此外，動脈粥樣硬化、糖尿病及衰老也可能與遺傳機構(gòu)的損傷有關(guān)。近二十多年來，關(guān)于化學(xué)物質(zhì)及其它環(huán)境因素對機體遺傳機構(gòu)的毒作用研究已發(fā)展成為毒理學(xué)的一個重要分支—－遺傳毒理學(xué)遺傳毒理學(xué)是應(yīng)用遺傳毒理學(xué)是應(yīng)用生物遺傳學(xué)方法研究化學(xué)物質(zhì)及其他環(huán)境因素對機體遺傳物質(zhì)的有害作用及機制的一門毒理學(xué)分支學(xué)科。首先研究化學(xué)物質(zhì)對DNA損傷和改變DNA序列的強弱，即遺傳毒性。常應(yīng)用細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)方法，研究物質(zhì)的致突變作用、致畸作用與致癌作用間的關(guān)聯(lián)。應(yīng)用一套短期致突變性/致癌性檢測方法，篩檢物質(zhì)的致突變性，并深入研究遺傳毒性機制、為評價化學(xué)物質(zhì)對遺傳物質(zhì)、基因庫等潛在危害提供依據(jù)及防治對策。遺傳毒理學(xué)的作用在于：①檢測亞毒性水平下所致異性細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷，引起機體遺傳特性改變的物質(zhì)，研究其毒作用特點及對人類的潛在危害，為制定預(yù)防對策，保護人類基因庫提供依據(jù)。②應(yīng)用非哺乳動物或哺乳動物細(xì)胞的體外試驗篩選動物致癌物。遺傳毒理學(xué)的目的是檢測在亞毒性暴露水平即能特異性地引起基因損傷，造成機體遺傳特性改變的物質(zhì)，研究其毒性作用特點及對人類的潛在影響。第一節(jié)概述一、基本概念遺傳是保持其種族特性的根本，遺傳的穩(wěn)定是相對的。種瓜得瓜，種豆得豆。龍生龍鳳生鳳，老鼠的兒子會打洞（教育）。變異是生物物種推陳出新的來源。龍生九種各有不同。造成生物變異的原因有：①父本、母本的遺傳物質(zhì)由于重組而發(fā)生；②由于基因突變而發(fā)生，它是新基因產(chǎn)生的根本來源；③由于生物的染色體組成發(fā)生變化（染色體突變）或細(xì)胞質(zhì)發(fā)生變化而發(fā)生。從現(xiàn)代基因論的觀點出發(fā)，只有起源于基因和染色體的變異才能夠遺傳。突變實際上是遺傳物質(zhì)的一種可遺傳的變異。突變可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。自發(fā)突變的發(fā)生率極低，物種的進化與自發(fā)突變有密切關(guān)系。誘發(fā)突變是指人為造成的突變。目前，通過誘發(fā)突變的方法已培育出增產(chǎn)、抗病、耐早、抗冷的新品種，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等方面。但是誘發(fā)突變也會引起對人類健康的危害。早在1927年Muller通過研究發(fā)現(xiàn)電離輻射可引起果蠅發(fā)生基因突變，并推測體細(xì)胞突變可引起癌癥，1947年Auerbach報告某些化學(xué)物質(zhì)也能導(dǎo)致基因突變以來，很多學(xué)者研究了化學(xué)物質(zhì)對生物體遺傳機構(gòu)的影響，并認(rèn)為環(huán)境因素導(dǎo)致機體遺傳機構(gòu)的改變可以引起人類的某些遺傳性疾病及癌癥。從此認(rèn)識到外源化學(xué)物引起的致突變對健康危害的嚴(yán)重性。并隨之產(chǎn)生了研究化學(xué)物質(zhì)及其它環(huán)境因素對機體遺傳機構(gòu)毒性作用的一門新學(xué)科，即遺傳毒理學(xué)（genetictoxicology）。遺傳毒理學(xué)主要研究致突變的作用機制，應(yīng)用檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和探究致突變物，提出評價致突變物對健康危害的方法。至今已發(fā)現(xiàn)相當(dāng)數(shù)量的外源化學(xué)物及其它環(huán)境因素能損傷機體的遺傳物質(zhì)，從而誘發(fā)突變，這些物質(zhì)稱為致突變物或誘變物，也稱遺傳毒物。而外源化學(xué)物及其它環(huán)境因素能引起細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，而且這種改變隨同細(xì)胞分裂過程而傳遞的過程稱為致突變作用。簡單地說突變的發(fā)生及其過程即稱為致突變作用。突變是致突變作用的結(jié)果，其中包括基因突變和染色體畸變。二、遺傳學(xué)基礎(chǔ)（一）DNA與基因結(jié)構(gòu)DNA是由許多核苷酸組成的大分子物質(zhì)，它決定了生命現(xiàn)象的基本屬性。生命體系中的信息分子，除一些病毒是由RNA組成外，其它都是由DNA組成的。在DNA分子中每個核苷酸又由一個脫氧核糖、一個磷酸根和一個堿基構(gòu)成。DNA中有四種堿基，即腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T），每一種堿基和一個脫氧核糖、一個磷酸根組成一個核苷酸。即DNA分子中有腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸四種核苷酸。DNA分子就是由這四種核苷酸構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)的長鏈?；颍╣ene）是DNA分子中具有完整功能的最小單位?；虻幕咀饔迷谟冢孩倩蚴巧镞z傳信息的攜帶者，即基因是帶有一定遺傳信息并能產(chǎn)生某種功能產(chǎn)物的DNA分子片斷。基因產(chǎn)物是多肽，多肽按其功能可分為結(jié)構(gòu)性、酶性和調(diào)控性。一個生物體所表現(xiàn)出的性狀有賴于這些基因產(chǎn)物的正確結(jié)構(gòu)和表達。②三個堿基構(gòu)成的三聯(lián)密碼（即密碼子）體現(xiàn)了一個氨基酸的信息。密碼子在基因中的排列順序決定氨基酸在多肽中的排列順序。③基因中密碼子組成的變化，可導(dǎo)致生成無功能的基因產(chǎn)物，最終可能引起細(xì)胞或生物體的遺傳變異及死亡。④多肽基因產(chǎn)物的生成與信使RNA（mRNA）和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）有關(guān)。信使RNA起傳遞信息的作用。轉(zhuǎn)移RNA作用是運送氨基酸并將氨基酸按順序連接成多肽。⑤基因轉(zhuǎn)錄的啟動和終止由另一組調(diào)節(jié)基因來控制?；蚴巧镞z傳信息的攜帶者，同時，它又是遺傳信息傳遞、表達、性狀分化、發(fā)育的依據(jù)。細(xì)胞或生物體的一套完整單位的遺傳物質(zhì)稱為基因組（genome)。（二）染色質(zhì)與染色體在間期真核細(xì)胞的細(xì)胞核中，通過光鏡可見一種能被堿性染料著色的由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA組成的形似串珠結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，即為染色質(zhì)（chromatin)。在間期細(xì)胞核中，一般沒有染色體結(jié)構(gòu)，只有在細(xì)胞分裂前期，染色質(zhì)經(jīng)多次的螺旋化形成染色單體（chromatid），再由兩個染色單體依著絲點連成一個染色體（chromosome）。故染色質(zhì)與染色體是由相同物質(zhì)組成的，染色體存在于細(xì)胞中，且其形態(tài)在細(xì)胞周期中是動態(tài)變化的。通常只有在細(xì)胞分裂時經(jīng)過特殊染色才能清楚地看到。細(xì)胞分裂中期染色體長度適宜，形態(tài)穩(wěn)定，便于觀察，是研究細(xì)胞遺傳毒理學(xué)的重要材料。根據(jù)細(xì)胞分裂中期染色體的特征和國際統(tǒng)一規(guī)定，將體細(xì)胞的全部染色體按其大小形態(tài)等方式編排所組成的染色體圖像稱核型。每一種生物種屬的核型是固定的，如小鼠有20對染色體，大鼠有21對，人有23對等。人類每個體細(xì)胞的23對染色體中，2個為性染色體，即x和y，其余22對為常染色體。充分了解每一種生物種屬的核型，對細(xì)胞遺傳毒理學(xué)研究是至關(guān)重要的，因為細(xì)胞遺傳毒理學(xué)研究主要是計算染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的變化。染色體與基因存在著平行的關(guān)系，表現(xiàn)為：①染色體可以在顯微鏡下觀察到，有一定的形態(tài)結(jié)構(gòu)。而基因是遺傳學(xué)的單位，不能在顯微鏡下觀察到，且每對基因在雜交中仍保持它們的完整性和獨立性。②染色體成對存在，基因也成對存在。在配子中每對基因只有一個，而每對同源染色體也只要一條。③個體中成對的基因一個來自父本，另一個來自母本，染色體也是如此。④不同對基因形成配子時的分離與不同對染色體在減數(shù)分裂期的分離，都是獨立分配的。（三）體細(xì)胞與生殖細(xì)胞大多數(shù)真核生物都由體細(xì)胞和生殖細(xì)胞組成。體細(xì)胞（somaticcell）多是二倍體（diploid）細(xì)胞。生殖細(xì)胞往往是單倍體細(xì)胞。體細(xì)胞含有完全相同的成對染色體，受外源化學(xué)物的作用，其遺傳損傷不會遺傳給子代；而生殖細(xì)胞的染色體受外源化學(xué)物的作用，可發(fā)生改變，即突變，且其突變可傳給子代。突變的生殖細(xì)胞根據(jù)其在二倍體中的表達，可分為顯性或隱性。顯性突變無論是純合子，還是雜合子均會出現(xiàn)表型異常；而隱性突變?nèi)鐬榧兒献?，將出現(xiàn)表型異常，若為雜合子，則表現(xiàn)為表型正常的攜帶者。（四）細(xì)胞周期與細(xì)胞的分裂細(xì)胞周期是指細(xì)胞從DNA復(fù)制起，經(jīng)過分裂直到把DNA均等地分配到兩個新的子細(xì)胞的全過程。此過程所需要的時間為細(xì)胞周期時間。真核細(xì)胞特別是哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞周期有明顯的周期，即間期和分裂期。通常講的細(xì)胞核的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，都是指間期核。間期指兩次分裂的中間時期。在間期中，細(xì)胞完成生成過程及DNA復(fù)制。根據(jù)功能，間期又可分為G1期、S期、G2期。過去將細(xì)胞周期分為間期和分裂期（M期）。目前，將細(xì)胞周期分為四個時期：Gl期、S期、G2期和M期。G1期即合成前期，是細(xì)胞進行急劇合成的時期，細(xì)胞主要合成RNA和蛋白，并做好合成DNA的準(zhǔn)備。S期即合成期，細(xì)胞主要合成DNA,完成DNA的復(fù)制。G2期即合成后期，細(xì)胞主要合成RNA和蛋白，為有絲分裂做準(zhǔn)備。M期即有絲分裂期。細(xì)胞主要完成DNA的分配。有絲分裂（mitosis）指細(xì)胞核分裂的過程。一個細(xì)胞由此生成兩個子細(xì)胞，每個子細(xì)胞各具有與親代細(xì)胞完全相同的染色體。在有絲分裂期，根據(jù)細(xì)胞核形態(tài)變化情況，又可分為前、中、后、末期。前期，核仁、核膜消失，染色質(zhì)纖維螺旋化并逐漸形成染色體。中期，所有的染色體排列于細(xì)胞中部形成赤道板。此期很適于做染色體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)方面的研究。后期，染色體著絲?？v裂，兩個染色單體各被一紡錘體牽引，移向細(xì)胞的兩極。末期，細(xì)胞體分裂，染色體消失而又恢復(fù)間期的核結(jié)構(gòu)。減數(shù)分裂（meiosis）指通過兩次細(xì)胞分裂（即兩個細(xì)胞周期）使染色體數(shù)目減少一半的一種特殊的有絲分裂。減數(shù)分裂的主要特點是，各對同源染色體在細(xì)胞分裂的前期配對，發(fā)生遺傳重組，而且，其細(xì)胞核兩次分裂，而染色體只復(fù)制一次。經(jīng)過減數(shù)分裂后染色體數(shù)目減少一半，變成單倍體（haploid)，減數(shù)分裂的生物學(xué)意義在于維持生物染色體數(shù)目的恒定，保證有性生殖的順利進行和為個體發(fā)育和物種的綿延起重要作用。第二節(jié)化學(xué)毒物的致突變類型化學(xué)致突物造成的遺傳學(xué)損傷有基因突變、染色體畸變和染色體數(shù)目的改變。這些遺傳學(xué)損傷可能因DNA受損所致，也可能因DNA以外的靶組織受損所致。對于以DNA為靶所產(chǎn)生的損傷常以能否為光學(xué)顯微鏡所見來區(qū)分，即分為基因突變和染色體畸變兩種損傷。由于光學(xué)顯微鏡的分辨能力極限為0.2μm，染色體在這一長度范圍內(nèi)約含4.7×106核苷酸對，因此這一長度以內(nèi)的改變不能在光鏡下看到。故基因突變只能通過生長發(fā)育、生化、形態(tài)等表型改變來判斷，而染色體畸變可用光學(xué)顯微鏡觀察到。一、基因突變基因突變亦稱點突變，是組成一個染色體的一個或幾個基因中DNA序列發(fā)生的變化?；瘜W(xué)致突變物造成的DNA損傷，在DNA復(fù)制過程中轉(zhuǎn)變?yōu)閴A基排列順序的變化，導(dǎo)致基因突變。根據(jù)作用方式和引起的后果不同，基因突變可分為三個類型：堿基置換（basesubstitution）、移碼（framshift）和大段損傷。堿基置換堿基置換是某一堿基配對性能改變或脫落所致的突變。當(dāng)DNA鏈上某一堿基在致突變物的作用下而脫落或其配對性能發(fā)生改變，就會在DNA復(fù)制過程中使DNA互補鏈上的相應(yīng)位點配上一個錯誤的堿基，即錯誤配對。這一錯誤配對上的堿基在下一次DNA復(fù)制時，卻按正常規(guī)律配對，于是原來的堿基對被錯誤的堿基對所置換，最終產(chǎn)生堿基對置換或簡稱堿基置換。在堿基置換中，如果原來的嘌呤被另一種嘌呤置換，或原來的嘧啶被另一種嘧啶置換稱為轉(zhuǎn)換；如果原來的嘌呤被另一種嘧啶置換，或原來的嘧啶被另一種嘌呤置換，稱為顛換。轉(zhuǎn)換和顛換的結(jié)果取決于其在蛋白質(zhì)合成過程中的錯義密碼和無義密碼的多少，而且都只涉及一對堿基，是名副其實的點突變，其結(jié)果可造成一個三聯(lián)密碼子的改變，可能出現(xiàn)錯義密碼、同義密碼和無義密碼（終止密碼）。16*16＝256個密碼，編碼20個氨基酸。由于錯義密碼所編碼的氨基酸不同，于是基因表達產(chǎn)物的蛋白質(zhì)有可能受到某種影響。終止密碼可使所編碼的蛋白質(zhì)肽鏈縮短。（二）移碼移碼是DNA中增加或減少了一對或幾對不等于3的倍數(shù)的堿基對所造成的突變。由于堿基序列所形成的一系列三聯(lián)體密碼子相互間并無標(biāo)點符號，于是從受損點開始堿基序列完全改變，從而形成錯誤的密碼，并轉(zhuǎn)譯成為不正常的氨基酸。在移碼突變中，如果所形成的錯誤密碼中包含有終止密碼，則肽鏈還會縮短。發(fā)生移碼突變后由于所編碼的蛋白質(zhì)的活性改變較大，故常出現(xiàn)致死性突變。如果減少或增加的堿基對數(shù)目剛好是3對，則基因產(chǎn)物的肽鏈中僅減少或增加1個氨基酸，其后果與堿基置換相似，與移碼突變完全不一樣，故不包括在移碼突變范疇。補充：整碼突變整碼突變(codonmutation)又稱為密碼子的插入或缺失，指在DNA鏈中增加或減少的堿基對為一個或幾個密碼子，此時基因產(chǎn)物多肽鏈中會增加或減少一個或幾個氨基酸，此部位之后的氨基酸序列無改變。（三）大段損傷大段損傷是DNA鏈大段缺失或插入，這種損傷有時可跨越兩個甚至數(shù)個基因。涉及數(shù)以千計的核苷酸。嚴(yán)格意義上講，基因突變應(yīng)是在一個基因范圍內(nèi)因損傷所導(dǎo)致的改變。當(dāng)損傷足夠大，例如超過104堿基對以上，就介于基因突變與染色體畸變之間的不明確的過渡范圍。在大段損傷中，因缺失的片斷遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于光學(xué)顯微鏡可觀察到的染色體缺失，故稱小缺失(smalldeletion）。它往往是DNA鏈斷裂后重接的結(jié)果，有時在減數(shù)分裂過程中發(fā)生錯誤聯(lián)合和不等交換也可造成小缺失。小缺失通?？梢鹜蛔儭Ｐ∪笔в坞x出來的DNA片斷可整合到另一染色體的某一位置而形成插入（insertion）。每次整合都可發(fā)生突變。小缺失的片斷也可倒轉(zhuǎn)后仍插入原來位置而形成基因重排。補充：片斷突變指基因中某些小片段核苷酸序列發(fā)生改變，這種改變有時可跨越兩個或數(shù)個基因，涉及數(shù)以千計的核苷酸。主要包括核苷酸片段的缺失、重復(fù)、重組及重排等。缺失指基因中某段核苷酸序列的丟失，缺失范圍小，也稱為小缺失。重復(fù)指基因中增加了某一段重復(fù)的核苷酸序列。缺失和重復(fù)都可能打亂基因的讀碼順序，引起移碼突變。重組指兩個不同基因的局部片段的相互拼接和融合。重排則指DNA鏈發(fā)生兩處斷裂，斷片發(fā)生倒位后再重新接上。補充：根據(jù)突變后基因產(chǎn)物功能的改變，基因突變可分為正向突變及回復(fù)突變。正向突變(forwardmutation)是導(dǎo)致基因產(chǎn)物正常功能喪失的突變，回復(fù)突變(reversemutation)則指使基因產(chǎn)物的功能恢復(fù)的突變。二、染色體畸變本節(jié)中染色體畸變僅指染色體結(jié)構(gòu)異常，它是指遺傳物質(zhì)大的改變，是由染色體或染色單體斷裂所致。當(dāng)斷端不發(fā)生重接或雖重接而不在原處，即可出現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常。一般可用光學(xué)顯微鏡檢查適當(dāng)細(xì)胞有絲分裂中期的染色體來發(fā)現(xiàn)。如果畸變只涉及兩條染色體單體中的一條，則稱為染色單體型畸變，否則稱為染色體型畸變。能使染色體或染色單體發(fā)生斷裂的物質(zhì)稱為斷裂劑（clastogen)。這種作用的發(fā)生及其過程稱為斷裂作用（clastogenesis）。斷裂作用的關(guān)鍵是誘發(fā)DNA鏈發(fā)生斷裂。大多數(shù)化學(xué)斷裂劑像紫外線一樣，只能誘發(fā)DNA單鏈斷裂，發(fā)生染色單體型畸變，故稱為擬紫外線斷裂劑。少數(shù)化學(xué)斷裂劑與電離輻射一樣，可誘發(fā)DNA雙鏈斷裂，發(fā)生染色體型畸變，故稱為擬放射性斷裂劑。產(chǎn)生何種畸變，取決于損傷發(fā)生在DNA復(fù)制前，還是復(fù)制后。如果少數(shù)化學(xué)物質(zhì)或電離輻射在DNA復(fù)制前處理，可誘導(dǎo)染色體型畸變，如果在DNA復(fù)制后處理，則可誘導(dǎo)染色單體型畸變。在任何情況下見到的染色單體型畸變都將在下一次細(xì)胞分裂時衍生為染色體型畸變。染色體結(jié)構(gòu)異常的類型：（1)倒位（inversion）當(dāng)某一染色體發(fā)生兩次斷裂后，其中間節(jié)段倒轉(zhuǎn)180°再重接，因其位置被顛倒，故稱倒位。如果被顛倒的片斷包括著絲點，則稱為臂間倒位；如果被顛倒的片斷，不包括著絲點則稱為臂內(nèi)倒位。(2）缺失（deletion）染色體丟失一個片斷。結(jié)果保留在核中的有著絲粒節(jié)段缺少了部分遺傳物質(zhì)。(3)重復(fù)（duplication）在一套染色體里，一個染色體片斷出現(xiàn)不止一次。(4）易位（translocation）從某個染色體斷下的節(jié)段接到另一染色體上稱為易位。即一個染色體節(jié)段的位置發(fā)生了改變。兩個染色體各發(fā)生一處斷裂，僅一個染色體的節(jié)段連接到另一個染色體上稱為單方易位。兩個染色體各發(fā)生一處斷裂，其節(jié)段相互交換重接形成兩個結(jié)構(gòu)重排的染色體稱為相互易位。三個或三個以上染色體發(fā)生斷裂，其節(jié)段交換重接而形成的具有結(jié)構(gòu)重排的染色體稱為復(fù)雜易位。在這三種易位中，最常見的是相互易位。此外，還有裂隙和斷裂、環(huán)狀染色體等染色體結(jié)構(gòu)異常的類型。補充裂隙(gap)在一條染色單體或兩條染色單體上出現(xiàn)無染色質(zhì)的區(qū)域，但該區(qū)域的大小等于或小于染色單體的寬度。在制備染色體標(biāo)本過程中，會因各種因素的影響形成裂隙，故認(rèn)為裂隙并非染色質(zhì)損傷，所以，在計算染色體畸變率時通常不考慮裂隙。斷裂(break)同裂隙，但無染色質(zhì)區(qū)域的大小大于染色單體的寬度。環(huán)狀染色體(ringchromosome)染色體兩條臂均發(fā)生斷裂后，帶有著絲粒部分的兩端連接起來形成環(huán)狀。通常伴有一對無著絲點的斷片。微小體(minutebody)中間缺失形成的斷片有時很小，成圓點狀，稱為微小體。無著絲點環(huán)(acentricring)無著絲粒的染色體或染色單體斷片連在一起呈環(huán)狀。雙著絲點染色體(dicentricchromome)兩條染色體斷裂后，兩個有著絲粒的節(jié)段重接，形成雙著絲點染色體。屬于不平衡易位。輻射體染色單體間的不平衡易位可形成三條臂構(gòu)型或四條臂構(gòu)型，分別稱為三輻射體(triradial)及四輻射體(quadrirdial)。在三個或多個染色體間的單體互換則可形成復(fù)合射體(complexradial)。三、染色體數(shù)目異常各種生物都有其固定的染色體數(shù)目和核型。以動物正常體細(xì)胞染色體數(shù)目2n為標(biāo)準(zhǔn)，則染色體數(shù)目異?？杀憩F(xiàn)為整倍性畸變（euploidyaberration）和非整倍性畸變（aeuploidyaberration）。整倍性畸變可能出現(xiàn)單倍體、三倍體或四倍體（monoploid,triploid,tetraploid)。超過二倍體的整倍性畸變也統(tǒng)稱為多倍體(polyploid)。其染色體數(shù)目可成倍增加。非整倍性畸變系指比二倍體多或少一條或多條染色體。例如，人類體細(xì)胞正常為二倍體（2n)，有46條染色體。如果細(xì)胞有45或47條染色體，則定義為非整倍性畸變。如果有69條染色體，則定義為多倍體，此為三倍體。（比如兩性人xxy。）補充：基因組突變(genomicmutation)指基因組中染色體數(shù)目的改變，也稱為染色體數(shù)目畸變(numericalaberration)。非整倍體(aneuploid)指細(xì)胞丟失或增加一條或幾條染色體。缺失一條染色體時稱為單體(monosome)，增加一條染色體時稱為三體(trisome)。染色體數(shù)目的改變會導(dǎo)致基因平衡的失調(diào)，可能影響細(xì)胞的生存或造成形態(tài)及功能上的異常。如21三體導(dǎo)致先天愚型(Down氏綜合征)唐氏綜合癥或稱21三體，國內(nèi)又稱為先天愚型，是最常見的嚴(yán)重出生缺陷病之一。臨床表現(xiàn)為：患者面容特殊，兩外眼角上翹，鼻梁扁平，舌頭常往外伸出，肌無力及通貫手?；颊呓^大多數(shù)為嚴(yán)重智能障礙并伴有多種臟器的異常，如先天性心臟病、白血病、消化道畸形等。本病發(fā)生幾乎波及世界各地，很少有人種差異。椐統(tǒng)計染色體異常在新生兒中的發(fā)生率為5-6/1000，唐氏綜合癥約為1/750，絕大多數(shù)病人屬隨機發(fā)生，但隨母親年齡的增長其發(fā)生率隨之升高，一般母親年齡35歲以上，該患兒的出生率可高達1/350。。18三體綜合征(trisomy18syndrome)的發(fā)病率為1/5000-1/7000，女嬰多于男嬰(3:1)，1年以上存活率僅5％。80%患者的核型為47，XX(XY),+18。是次于先天愚型的第二種常見染色體三體征。1960年Edwards等首先報道1例多發(fā)畸形患兒，經(jīng)染色體檢查多一個額外的染色體，認(rèn)為是17號染色體，相繼許多學(xué)者陸續(xù)報道了相似的觀察，證實這些臨床綜合征與18號染色體異常有關(guān)，至今已有數(shù)百例報道。主要臨床表現(xiàn)為多發(fā)畸形，多于生后數(shù)周死亡。18三體綜合征的畸形主要包括中胚層及其衍化物的異常（如骨骼、泌尿生殖系統(tǒng)、心臟最明顯）。此外，接近中胚層的外胚層（如皮膚皺褶、皮嵴及毛發(fā)等）及內(nèi)胚層（如美克爾憩室、肺及腎）也異常。文獻報道胚胎5周前發(fā)育正常，在妊娠第6～8周開始出現(xiàn)異常。唐氏綜合癥或稱21三體，國內(nèi)又稱為先天愚型，是最常見的嚴(yán)重出生缺陷病之一。臨床表現(xiàn)為：患者面容特殊，兩外眼角上翹，鼻梁扁平，舌頭常往外伸出，肌無力及通貫手?；颊呓^大多數(shù)為嚴(yán)重智能障礙并伴有多種臟器的異常，如先天性心臟病、白血病、消化道畸形等。本病發(fā)生幾乎波及世界各地，很少有人種差異。椐統(tǒng)計染色體異常在新生兒中的發(fā)生率為5-6/1000，唐氏綜合癥約為1/750，絕大多數(shù)病人屬隨機發(fā)生，但隨母親年齡的增長其發(fā)生率隨之升高，一般母親年齡35歲以上，該患兒的出生率可高達1/350。在腫瘤細(xì)胞及人類自然流產(chǎn)的胎兒細(xì)胞中可有三倍體細(xì)胞的存在。發(fā)生于生殖細(xì)胞的整倍體改變，幾乎都是致死性的。表7-1不同物種動物的染色體數(shù)目物種體細(xì)胞(2n)性細(xì)胞(n)物種體細(xì)胞(2n)性細(xì)胞(n)人4623兔4422小鼠4020貓3819大鼠4221狗7839第三節(jié)化學(xué)毒物致突變作用的機理及后果化學(xué)毒物可誘導(dǎo)試驗動物產(chǎn)生基因突變，染色體畸變和染色體數(shù)目的異常。在已檢出的致突變物中，大多數(shù)有不同程度的特異性。有些致突變物以DNA為靶，誘導(dǎo)基因突變和染色體畸變。而有些致突變物則不以DNA為靶，常以有絲分裂和減數(shù)分裂的成分，如以紡錘絲為靶，誘導(dǎo)染色體數(shù)目的異常。一、以DNA為靶的損傷機理（一）DNA加合物形成許多化學(xué)誘變劑或其活化產(chǎn)物是親電子物，可與細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)等大分子親核物質(zhì)通過共價鍵，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，即加合物。通常很難用一般的化學(xué)和生物學(xué)方法使其解離。DNA加合物的形成被普遍認(rèn)為是誘變作用的重要事件。例如，黃曲霉毒素B和苯并（a)芘等致癌物質(zhì)在體內(nèi)經(jīng)生物活化形成環(huán)氧化物后，與DNA發(fā)生共價結(jié)合形成巨大的加合物分子，從而可誘發(fā)突變并產(chǎn)生強烈的致癌作用。又如一些對DNA和蛋白質(zhì)都具有強烈烷化作用的物質(zhì)，即烷化劑可提供甲基或乙基等烷基與DNA共價結(jié)合（稱烷化作用），使DNA甲基化或乙基化而發(fā)生誘變。誘變劑與DNA發(fā)生共價結(jié)合所攻擊的堿基和位置有些是專一的，有些則專一程度較低。如乙酞氨基芴（AAF）僅特異地作用于鳥嘌呤的C8位，引起移碼突變。而烷化劑則在中性環(huán)境中幾乎都能與核苷酸鏈上的全部氧和氮原子（除連接在戊糖上的氮以外）產(chǎn)生烷化作用，但已知烷基硫酸酯則幾乎僅與氮反應(yīng)，并多數(shù)攻擊鳥嘌呤的N7位，而烷基－N－亞硝基化合物則幾乎完全與氧反應(yīng)，并多數(shù)攻擊鳥嘌呤的O6位，引起堿基置換。鳥嘌呤的O6位被烷化常引起堿基錯配，由原來的G:C轉(zhuǎn)換為A:T，并常誘發(fā)腫瘤。鳥嘌呤的N7位或其它堿基環(huán)上的氮被烷化后，一般不至引起錯配，但有時發(fā)生堿基脫落，即堿基缺失，結(jié)果發(fā)生移碼突變。（二）平面大分子嵌入DNA鏈引起化學(xué)致突變的關(guān)鍵是需要致突變物與DNA發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)。然而，有些化合物能以非共價結(jié)合的靜電吸附形式嵌入DNA單鏈的堿基之間或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的相鄰多核苷酸鏈之間，稱嵌入劑（intercalatingagent）。它們多數(shù)具有多環(huán)的平面結(jié)構(gòu)，尤其是三環(huán)結(jié)構(gòu)，易于嵌入DNA單鏈的堿基之間或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的相鄰多核苷酸鏈之間，造成移碼突變。如9－氨基吖啶（9-aminoacidine）與DNA的結(jié)合即為非共價結(jié)合。像這種非共價結(jié)合后引起的致突變作用，是化學(xué)物嵌入DNA堿基對中后所致的結(jié)果。在DNA復(fù)制時，由于吖啶分子具有較扁平的結(jié)構(gòu)，能夠結(jié)合到DNA分子上，并嵌入鄰近的堿基對中，使它們分開。此時DNA鏈出現(xiàn)歪斜，造成排列不齊，結(jié)果導(dǎo)致一個堿基對增多，一個堿基對減少的不等交換的兩個重組子產(chǎn)生。即造成堿基對的缺失或額外堿基對嵌入的移碼突變。另外，有些既能以非共價結(jié)合的靜電吸附形式嵌入DNA鏈，又能與DNA發(fā)生共價結(jié)合的化合物，如吖啶芥ICR一191(acridinemustardICR一191)等，要比單一嵌入劑更具有潛在的致突變作用。（三）DNA一蛋白質(zhì)交聯(lián)物（DNA-proteincrosslinks，DPC)形成DNA一蛋白質(zhì)交聯(lián)物的形成是致突變物對細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)等大分子親核物質(zhì)的一種重要的遺傳損害，也是一種穩(wěn)定的共價結(jié)合物。已知許多外來化合物如烷化劑、苯并（a)芘、砷化物、醛類化合物及一些重金屬（如Ni，Cr）等，均使DNA鏈內(nèi)、鏈間或DNA與蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)（crosslinkage)，引起DNA一蛋白質(zhì)交聯(lián)物的形成。雖然不同化學(xué)物引起DNA一蛋白質(zhì)交聯(lián)物的交聯(lián)有所不同，但一旦形成DPC，則必將對DNA構(gòu)象與功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響。結(jié)果導(dǎo)致DNA鏈不易修復(fù)或發(fā)生易錯修復(fù)，同時導(dǎo)致高度致基因突變，也經(jīng)常發(fā)生染色體或染色單體斷裂，并易發(fā)生致死性突變現(xiàn)象。（四）改變或破壞堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)一些化合物可對堿基產(chǎn)生氧化作用，從而破壞或改變其結(jié)構(gòu)，有時還引起鏈斷裂。它們主要改變核酸中核苷酸的化學(xué)組成，其作用與DNA復(fù)制無關(guān)。例如，亞硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶發(fā)生氧化性脫氨，相應(yīng)生成次黃嘌呤和尿嘧啶；羥氨能使胞嘧啶C6位的氨基變?yōu)榱u氨基。以上改變都會造成轉(zhuǎn)換型堿基置換。一些化合物可通過另一種機制破壞堿基結(jié)構(gòu)，可在機體內(nèi)形成有機過氧化物或自由基來破壞嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。如甲醛、氧基甲酸乙酯（又稱尿烷或烏拉坦）和氧咖啡堿等都以這種機制使DNA鏈發(fā)生斷裂。（五）堿基類似物取代有些化合物的結(jié)構(gòu)與DNA分子中的四種天然堿基非常相似，稱為堿基類似物。這些化合物在細(xì)胞周期的DNA合成期（S期）能與正常的堿基競爭，取代其位置。結(jié)果常造成錯誤配對，即發(fā)生堿基置換。常見的例子是5一溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu)取代胸腺嘧啶，2一氨基嘌呤(2-AP)取代鳥嘌呤。取代后如出現(xiàn)異構(gòu)互變，則Brdu可由常見的酮式變?yōu)樯僖姷南┐际浇Y(jié)構(gòu)，或2一AP由常見的氨式變?yōu)閬啺笔浇Y(jié)構(gòu)。就會使互補鏈發(fā)生錯誤配對，下次復(fù)制時該錯配的堿基按常規(guī)配對，即發(fā)生堿基置換現(xiàn)象。（六）二聚體的形成當(dāng)細(xì)胞或機體受到紫外線刺激，會使DNA發(fā)生化學(xué)變化，主要產(chǎn)生環(huán)丁烷嘧啶二聚體和（4一6)光產(chǎn)物(4一6一photoproduct）。這些較大的損傷可阻止DNA的復(fù)制，并引起細(xì)胞的死亡。機體受到紫外線刺激后，引起細(xì)胞死亡的致突變機制為：①連接A一T，C－G之間的氫鍵斷裂；②DNA分子的一個或兩個鍵中的糖一磷酸基之間斷裂；③DNA同一條鏈上，相鄰的嘧啶形成二聚體；④水的電離，產(chǎn)生自由基；⑤引起DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂。從而引起缺失、倒位、易位甚至破壞堿基，并引起細(xì)胞的死亡。二、不以DNA為靶的損傷機理（一）對DNA合成和修復(fù)有關(guān)的酶系統(tǒng)作用對DNA合成和修復(fù)有關(guān)的酶系統(tǒng)作用也可間接導(dǎo)致DNA損傷，從而發(fā)生基因突變或染色體畸變。DNA的高保真復(fù)制（即合成）需多種酶類的參與，并且在基因調(diào)控下進行。如果其過程中的任何一個環(huán)節(jié)受損傷，將影響DNA復(fù)制的高保真性，有可能引起突變。例如，一些氨基酸類似物可使DNA合成有關(guān)的酶受到破壞從而誘發(fā)突變。脫氧核糖核苷三磷酸在DNA合成時的不平衡也可誘發(fā)突變，此外，有些化合物雖然不損傷DNA分子，但可作用于組蛋白和非組蛋白成分，也可造成突變。另外，DNA是生命物質(zhì)中唯一具有自身修復(fù)能力的分子，其修復(fù)過程必須依賴各種各樣的酶，但這些酶有可能成為化學(xué)毒物的靶分子，從而無法清除受損傷的DNA片段，或無法合成新的片段來替換受損傷的DNA片段。使DNA的修復(fù)無法正常進行，導(dǎo)致DNA的損傷。（二）對紡錘體的毒作用前述染色體數(shù)目異?？杀憩F(xiàn)為整倍性畸變和非整倍性畸變。整倍性畸變和非整倍性畸變的產(chǎn)生不同于其它致突變作用，它們受作用的靶比較廣泛，是由于染色體分離異常，導(dǎo)致染色體數(shù)目改變而產(chǎn)生。主要涉及細(xì)胞分裂過程的改變?nèi)缂忓N體、微管蛋白的合成與聚合，微管結(jié)合蛋白的合成和功能發(fā)揮，細(xì)胞分裂紡錘纖維的功能發(fā)揮，著絲粒及與之有關(guān)的蛋白質(zhì)作用，極體的復(fù)制與分離，減數(shù)分裂時同源染色體的聯(lián)合配對重組等。整倍性畸變和非整倍性畸變的產(chǎn)生機制是相似的，可能有程度上的不同。例如，對紡錘體形成的干擾，如完全阻止，即形成整倍性畸變，如部分阻止，則形成非整倍性畸變。目前，對于它們產(chǎn)生的生化機制，已了解的主要是有關(guān)紡錘體的下列幾方面：(1)與微管蛋白二聚體結(jié)合微管蛋白二聚體是構(gòu)成紡錘體纖維的基本材料，一旦該蛋白的某一特定位置被化學(xué)致突物占據(jù)，即可妨礙微管的正確組裝，很易發(fā)生細(xì)胞分裂完全抑制，即紡錘體的完全抑制。秋水仙堿和鬼臼（jiu，四聲）毒素都能與該蛋白的某一特定部位結(jié)合，產(chǎn)生細(xì)胞染色體不分離。(2）與微管上的巰基結(jié)合微管蛋白帶有巰基，某些化學(xué)物、藥物和金屬等都能與微管蛋白不同部位的巰基特異性結(jié)合，影響微管的作用。如苯基汞易與著絲微管（即染色體纖維）結(jié)合，而甲基汞則易與極間微管（即連接兩中心粒的連續(xù)纖維）結(jié)合。結(jié)合可有多種后果，但細(xì)胞分裂多數(shù)不至于完全抑制，即造成非整倍性畸變。(3)破壞已組裝的微管在正常細(xì)胞中，微管經(jīng)常和游離的二聚體處于聚合和解聚的動態(tài)平衡中。微管結(jié)合蛋白可使二聚體聚合，維持微管的結(jié)構(gòu)和功能的正常發(fā)揮。秋水仙堿、灰黃霉素、長春花堿、乙酰甲基秋水仙堿等化學(xué)毒物都能與微管結(jié)合蛋白結(jié)合，雖結(jié)合點和作用方式不同，但都可使已組裝好的微管解聚。有些化學(xué)毒物，如毛地黃皂苷能通過非特異的蛋白質(zhì)變性作用而破壞微管。另一些化合物，如異丙基-N-氨基甲酸苯酯和其它氨基甲酸酯等通過對細(xì)胞分裂和DNA合成的復(fù)雜作用，使微管失去定向能力。(4）妨礙中心粒移動秋水仙堿可妨礙有絲分裂早期兩對中心粒的分離和移向兩極。但其機制尚不明確。(5）其它作用與秋水仙堿一樣，N2O也可產(chǎn)生相同的后果，但受N2O影響后，觀察不到微管組裝受抑制、組裝好的微管破壞、中心粒位置不正常等現(xiàn)象，N2O的作用機制尚不清楚。三、突變的后果化學(xué)致突變物引起的突變后果，主要取決于其所作用的靶細(xì)胞類型。如果致突變物作用于體細(xì)胞，引起體細(xì)胞突變，則僅能影響接觸致突變物的個體，不影響下一代。體細(xì)胞突變的后果有腫瘤、畸形、動脈粥樣硬化、糖尿病及衰老等，但最受注意的是腫瘤。如果致突變物作用于生殖細(xì)胞，引起生殖細(xì)胞的突變，則可影響下一代。造成顯性致死或可發(fā)生遺傳性改變，進而可能影響人類的基因?；瘜W(xué)致突變物引起生殖細(xì)胞的基因突變對人類的影響，按其嚴(yán)重程度可分為：①對機體無影響，如同義突變；②導(dǎo)致對健康無影響的正常人體生化組成的遺傳學(xué)變異，例如ABO血型ABO血型物質(zhì)除存在于紅細(xì)胞膜上外，還出現(xiàn)于唾液、胃液、精液等分泌液中。中國60％漢族人唾液中有ABO血型物質(zhì)。血型物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是指構(gòu)成血型抗原的糖蛋白或糖脂，而血型的特異性主要取決于血型抗原糖鏈的組成（即血型抗原的決定簇在糖鏈上）。A、B、H3種血型抗原化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，僅在于糖鏈末端的1個單糖。A抗原糖鏈末端為N-乙酰半乳糖，而B抗原糖鏈末端為半乳糖，H抗原和A、B抗原相比則糖鏈末端少1個半乳糖或N-乙酰半乳糖。1981年已有人用綠咖啡豆酶（半乳糖苷酶）作用于B型紅細(xì)胞，切去B抗原上的半乳糖，從而使B型轉(zhuǎn)變成O型獲得成功。ABO血型是由A、B和O三種血型基因所決定，血型基因位于第9對兩條染色體上。由于A、B是顯性基因，O是隱性基因，所以第9對染色體只要一條帶A基因，無論另一條染色體相應(yīng)位點上是A和O型基因，都表現(xiàn)為A型血。O型血則必須是第9對兩條染色體上都同樣是O基因。如果第9對染色體上一條帶A基因，另一條帶B基因，就表現(xiàn)為AB型血。、血清白蛋白類型及各種同工酶型等。但在特殊情況下，如不同血型輸血及同種移植的排斥等，也可引起嚴(yán)重的后果；③導(dǎo)致遺傳易感性的改變；④導(dǎo)致遺傳性疾病，包括多種分子病和遺傳性代謝缺陷病等；ABO血型物質(zhì)除存在于紅細(xì)胞膜上外，還出現(xiàn)于唾液、胃液、精液等分泌液中。中國60％漢族人唾液中有ABO血型物質(zhì)。血型物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是指構(gòu)成血型抗原的糖蛋白或糖脂，而血型的特異性主要取決于血型抗原糖鏈的組成（即血型抗原的決定簇在糖鏈上）。A、B、H3種血型抗原化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，僅在于糖鏈末端的1個單糖。A抗原糖鏈末端為N-乙酰半乳糖，而B抗原糖鏈末端為半乳糖，H抗原和A、B抗原相比則糖鏈末端少1個半乳糖或N-乙酰半乳糖。1981年已有人用綠咖啡豆酶（半乳糖苷酶）作用于B型紅細(xì)胞，切去B抗原上的半乳糖，從而使B型轉(zhuǎn)變成O型獲得成功。ABO血型是由A、B和O三種血型基因所決定，血型基因位于第9對兩條染色體上。由于A、B是顯性基因，O是隱性基因，所以第9對染色體只要一條帶A基因，無論另一條染色體相應(yīng)位點上是A和O型基因，都表現(xiàn)為A型血。O型血則必須是第9對兩條染色體上都同樣是O基因。如果第9對染色體上一條帶A基因，另一條帶B基因，就表現(xiàn)為AB型血。由化學(xué)致突變物引起的染色體畸變對后代的影響，其數(shù)目異常往往大于結(jié)構(gòu)異常；而且，染色體畸變不平衡的影響大于染色體畸變平衡。染色體畸變可造成死胎、自發(fā)流產(chǎn)以及引起多種染色體病。生殖細(xì)胞突變能否在人類基因庫中固定下來，取決于回復(fù)突變的頻率和突變體的適合度（fitness）。由于人類食物鏈的增加，人類通過食物和空氣接觸農(nóng)藥殘留、食品添加劑、有害氣體等化學(xué)致突變物甚至接觸環(huán)境激素等的機會也不斷增加，從而導(dǎo)致生殖細(xì)胞突變的人群也日益增多。據(jù)統(tǒng)計，目前每人平均攜帶5-6個甚至更多的有害基因。環(huán)境致突變作用影響人類基因庫，造成遺傳負(fù)荷的增加已是一個不容忽視的問題。第四節(jié)化學(xué)毒物致突變作用的研究方法觀察化學(xué)毒物致突變作用一般通過致突變試驗來進行。致突變試驗旨在評定外源化學(xué)物對生殖細(xì)胞及體細(xì)胞的致突變性，對致癌、致畸和遺傳危害的潛在可能作出初步評價。致突變試驗所用的指示生物涉及到病毒、細(xì)菌、霉菌、昆蟲、植物、體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞和哺乳動物等。這些指示生物在對外源化學(xué)物的代謝、DNA損傷修復(fù)及其它影響突變發(fā)生的生理過程等方面雖存在差異，但作為遺傳物質(zhì)的DNA其基本特征具有普遍性，這是用非人類檢測系統(tǒng)預(yù)測對人類遺傳危害性的基礎(chǔ)。致突變試驗的研究發(fā)展很快，包括新方法的建立，原有方法的日益完善。目前已建立了200多種致突變試驗方法，但重要的和作為常規(guī)使用的僅約20種。一、常用的致突變試驗（一）細(xì)菌回復(fù)突變試驗（Ames試驗）細(xì)菌回復(fù)突變試驗是以營養(yǎng)缺陷型的突變體為指示生物，觀察受試物能否糾正或補償突變體所攜帶的突變發(fā)生改變的體外試驗。常用的菌株有組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌和色氨酸營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（E.coli）。鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗是目前應(yīng)用最廣泛的檢測基因突變的試驗。它是由美國加州大學(xué)的Ames教授在1979年建立并完善的，又稱Ames試驗。Ames試驗是采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株作為指示物，檢測受試物能否引起基因突變的試驗。其原理是鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株在某個調(diào)控組氨酸合成的基因發(fā)生了點突變，喪失合成組氨酸的能力，突變的菌株必須依賴外源性組氨酸才能生長。而在無組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活，致突變物可使其基因發(fā)生回復(fù)突變，使它在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上也能生長成可見的菌落。通過選擇性培養(yǎng)基上回變菌落數(shù)的變化來判定受試物是否有致突變性。試驗中可供選用的測試菌株有多種，所攜帶的突變是在不同基因中各有不同的特性，有的測定堿基置換，有的測定移碼突變，有的兩者都可能。我國普遍采用1983年由Mamn和Ames推薦的四種標(biāo)準(zhǔn)測試菌株，即TA97，TA98，TA100和TA102。TA97和TA98可檢測移碼突變，TA100檢測堿基置換突變，TA102對醛、過氧化物及DNA交聯(lián)劑較敏感。這四種測試菌株除了含有his一突變外，還含有一些如脂多糖（rfa）突變、切除修復(fù)突變（ΔuvrB）等附加突變和K因子（pKM101）及pAQ1質(zhì)粒，以提高敏感性。此外，國際協(xié)調(diào)組織（InternationalConferenceonHarmonization，ICH）建議，在用細(xì)菌回復(fù)突變試驗法進行常規(guī)檢測時，應(yīng)使用TA98,TA100,TA1535,TA1537或TA97或TA97a、TA102或E.coliWP2uvrA或E.coliWP2uvrA（pKM101）。由于鼠傷寒沙門氏菌缺乏哺乳動物的代謝酶，因此在進行Ames試驗時，必須進行不加及加代謝活化系統(tǒng)的檢測。最常用的活化系統(tǒng)是S9混合液。它是用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿，于9000×g速度離心，所得的上清液(S9)，加上NADP及葡萄糖一6一磷酸等輔助因子，作為代謝活化系統(tǒng)。如不加S9混合液得到陽性結(jié)果，說明受試物可能是直接致突變物；加S9混合液才得到陰性結(jié)果，說明該受試物是間接致突物。Ames試驗的方法有點試驗法、平板摻入法及預(yù)培養(yǎng)平板摻入法。點試驗法一般用于預(yù)試驗，平板摻入結(jié)果是Ames試驗的標(biāo)準(zhǔn)試驗法。補充：Ames試驗的優(yōu)點是，方法靈敏，檢出率高，經(jīng)試驗有90％的化學(xué)致癌物經(jīng)都可獲得陽性結(jié)果；加之方法比較簡便、易行，不需特殊器材，容易推廣。缺點是，微生物的DNA修復(fù)系統(tǒng)比哺乳動物簡單，基因不如哺乳動物多，不能完全代表哺乳動物的實際情況。盡管如此，由于存在著上述的優(yōu)勢，故目前在致突變試驗中占重要位置，為首選的試驗方法。Ames致突變試驗和大鼠致癌試驗有較好的一致性。（二）哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗（mammaliancellgenemutationassay）哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗是體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變試驗。正向突變是野生型基因失活的突變。常用的試驗方法有小鼠淋巴瘤（IS178y）細(xì)胞胸苷激酶位點（tK）突變檢測、中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）及中國倉鼠成纖維細(xì)胞（V97）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶位點（hgprt）突變檢測和中國倉鼠卵巢細(xì)胞的AS52細(xì)胞株黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶位點(gpt)突變檢測。正向突變試驗是利用培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞系如小鼠淋巴瘤(15178y)細(xì)胞系、中國倉鼠肺(V97)細(xì)胞株和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(AS52)的細(xì)胞株，觀察特定基因座位（locus）上是否誘變產(chǎn)生突變體的試驗。已發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中有數(shù)十個基因座易被誘發(fā)突變，可出現(xiàn)各種類型的突變體。突變體檢出可依賴于營養(yǎng)需求型、細(xì)胞周期型、輻射及擬輻射物質(zhì)敏感型、抗藥性及溴尿嘧啶脫氧核苷依賴性等指標(biāo)。最常用的基因座是hprt、tK和gpt。hprt基因座位于x染色體上，其基因產(chǎn)物是次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶（HPRT）。tK基因（座）位于常染色體上，其基因產(chǎn)物是胸苷激酶（TK），gpt基因產(chǎn)物是黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶（GPT）。正向突變試驗可檢測座位內(nèi)的堿基置換、缺失、移碼和重排等點突變。（三）微核試驗(micronucleustest，MNT)微核（micronucleus）與染色體損傷有關(guān)。經(jīng)致突變作用后，染色體或染色單體的無著絲點斷片或因紡錘體受損傷而丟失的整個染色體在細(xì)胞有絲分裂的后期不能進入子代細(xì)胞的細(xì)胞核中，而在間期的子代細(xì)胞漿內(nèi)形成一個或幾個規(guī)則的次核，因比主核小，故稱微核。微核與細(xì)胞主核著色一致，呈圓形或橢圓形。在細(xì)胞質(zhì)中微核來源有二：一是斷片或無著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期不能定向移動，而遺留在細(xì)胞質(zhì)中；二是對有絲分裂過程有毒的化學(xué)物作用使個別染色體或帶著絲粒的染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被遺留在細(xì)胞漿中。微核試驗（MNT）是通過觀察受試物能否產(chǎn)生微核，并檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑的試驗?？捎糜谖⒑藱z測的細(xì)胞很多，現(xiàn)已建立植物細(xì)胞（如紫露草花粉母細(xì)胞、蠶豆根尖等）、哺乳類動物細(xì)胞（如骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞等）、非哺乳類動物細(xì)胞（如魚紅細(xì)胞、蟾蜍紅細(xì)胞等）的微核試驗方法。目前在常規(guī)檢測中應(yīng)用最多的是嚙齒類動物骨髓多染紅細(xì)胞嗜多色性紅細(xì)胞（胞體直徑：8-11μ）：嗜多色性紅細(xì)胞（胞體直徑：8-11μ）：正常成熟紅細(xì)胞漿為弱嗜酸性，呈較均勻的淡紅色，如呈灰蘭色（整個紅細(xì)胞或其一部分）則稱為嗜多色性紅細(xì)胞。這種紅細(xì)胞屬尚未完全成熟的紅細(xì)胞，故細(xì)胞體積多較大，其染成灰蘭色的嗜堿性物質(zhì)是胞漿中的核糖體，它隨著細(xì)胞的完全成熟而消失。目前認(rèn)為嗜多色性紅細(xì)胞經(jīng)煌焦油蘭染色后即表現(xiàn)為網(wǎng)織紅細(xì)胞。微核試驗，除上述體內(nèi)試驗外，還有用中國倉鼠肺細(xì)胞（CHL），中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）及中國倉鼠成纖維細(xì)胞（V97）等細(xì)胞進行試驗的體外微核試驗法、有可能成為在人群中觀察化學(xué)毒物遺傳毒性一種手段的周圍血微核試驗法、雙核細(xì)胞法和不僅可提高其靈敏度，還可判斷微核是來源于斷片還是染色體的免疫熒光染色法和熒光原位雜交法等。（四）染色體畸變試驗（chromosomeaberrationtest）制備細(xì)胞分裂中期相染色體標(biāo)本，在光鏡下觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變稱為染色體畸變分析。染色體畸變試驗也常稱為細(xì)胞遺傳學(xué)試驗（cytogeneticassay）。對于染色體畸變，能觀察到裂隙、斷裂、斷片、無著絲粒環(huán)、染色體環(huán)、雙或多著絲粒染色體、射體和染色體粉碎。對于缺失，除染色單體缺失外，需作核型分析或用流式細(xì)胞儀作電腦圖像分析才能作出判斷。對于倒位、插入、重復(fù)以及易位（除生殖細(xì)胞非同源染色體相互易位外）均需顯帶技術(shù)檢查。對于染色體數(shù)目異常包括整倍性畸形（多倍體）及非整倍性畸形（非整倍體），則需在染毒后經(jīng)過一次細(xì)胞分裂才能出現(xiàn)，但此時一些不穩(wěn)定的染色體畸變往往消失。故試驗中觀察時間應(yīng)是多次，以便分別檢查。同時，應(yīng)注意致突變物可能在細(xì)胞周期的不同時期所起的作用。染色體畸變試驗可分為體內(nèi)試驗和體外試驗兩種。體內(nèi)染色體畸變試驗主要有嚙齒類動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗及嚙齒類動物睪丸細(xì)胞染色體畸變試驗。常用初成年的小鼠或大鼠。在嚙齒類動物睪丸細(xì)胞染色體畸變試驗中，常用精源細(xì)胞及初級精母細(xì)胞進行染色體畸變試驗。觀察精源細(xì)胞的染色體畸變同骨髓細(xì)胞一樣是在染毒后經(jīng)過一次有絲分裂的細(xì)胞中進行，一般在末次染毒后一天取樣測定。初級精母細(xì)胞的染色體畸變試驗，一般是在染毒后12一14d取樣，觀察受試物作用于前細(xì)線期引起的損傷在終變期的表現(xiàn)。嚙齒類動物骨髓染色體分析是檢測受試物對骨髓細(xì)胞（體細(xì)胞）的致染色體畸變作用。而睪丸染色體分析是檢測受試物對生殖細(xì)胞的致染色體畸變作用，生物學(xué)意義不同。體外染色體畸變試驗因靶細(xì)胞與受試物直接接觸而靈敏度高，且不會因毒物動力學(xué)的原因所致器官特異性而漏檢。常用的分析細(xì)胞為中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞、中國倉鼠肺（CHL）和V97細(xì)胞株及外周血淋巴細(xì)胞等。由于這些細(xì)胞染色體數(shù)目小，形態(tài)多樣而易于觀察。（五）顯性致死試驗（dominantlethalassay）―――整體動物試驗顯性致死試驗是一種體內(nèi)試驗，用于檢測整體哺乳動物生殖細(xì)胞的遺傳性損傷。顯性致死突變指生殖細(xì)胞染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常的遺傳學(xué)損傷，此種損傷不影響受精，但可導(dǎo)致受精卵在著床前死亡或胚胎的早期死亡。顯性致死試驗以胚胎死亡為觀察終點，可檢出受試物對生殖細(xì)胞的染色體損傷作用。即單純?nèi)旧w斷裂所導(dǎo)致的大缺失或重復(fù)；或者因染色體重排所形成的不平衡染色體分離或不分離，即非整倍型畸形（非整倍體）。由于卵子對誘變物的敏感性相對較低，而且受試物有可能作用于母體，產(chǎn)生不利于胚胎發(fā)育的種種干擾因素，影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本試驗一般采用僅對雄性動物染毒，然后與未處理的雌性動物交配，觀察一個精子發(fā)育周期中各個階段雌鼠胚胎早期死亡發(fā)生率的變化，進而判斷受試物有無對雄性生殖系統(tǒng)的損害及損害發(fā)生的敏感階段，是否具有致突變作用。常用性成熟的雄性大、小鼠。一般設(shè)三個處理組，最高劑量為LD50的1/10～1/3，一次或連續(xù)5d，每天染毒一次。同時設(shè)陰性和陽性對照組。于最后一次染毒后的1～2d開始交配。每只雄鼠與兩只雌鼠同籠5d，休息兩天后與另兩只未交配過的新雌鼠同籠5d，如此連續(xù)6～8周，大鼠8～10周。每只雌鼠于同籠的第3天算起的第13～14天處死，檢查子宮內(nèi)的著床數(shù)、早死胎、晚死胎和活胎數(shù)。分析各周交配的顯性致死情況，可檢出精子是處于哪一個發(fā)育階段受到遺傳毒性作用。染毒后前3周交配的結(jié)果表示化學(xué)物對精子和精細(xì)胞有毒性作用，第4～5周交配的結(jié)果表示化學(xué)物對精母細(xì)胞有毒作用，第6周及以后的結(jié)果表示化學(xué)物對精源細(xì)胞有毒作用。由于顯性致死試驗是在哺乳動物體內(nèi)進行，不需特殊設(shè)備條件，同時通過該試驗還可進一步確證體外試驗或其它試驗系統(tǒng)獲得的陽性結(jié)果，故它是評價化學(xué)毒物對雄性動物生殖細(xì)胞遺傳毒性的一種較好的方法。其不足之處在于靈敏度差和使用動物數(shù)量大，且要求有一定的受孕率。（六）程序外DNA合成試驗（unscheduledDNAsynthesistest，UDS試驗）正常細(xì)胞需經(jīng)過細(xì)胞周期才能達到增殖的目的，細(xì)胞周期包括G1期，S期、G2期和M期。正常細(xì)胞在有絲分裂過程中，僅在S期按固定程序進行DNA復(fù)制合成。稱為程序性DNA合成（scheduledDNAsynthesis）。當(dāng)DNA受損后，DNA的修復(fù)合成可發(fā)生在正常復(fù)制合成期（S期）以外的其它時期，稱為程序外DNA合成。它是機體為保證其遺傳特征的高度穩(wěn)定而對DNA雙鏈上出現(xiàn)的變異或損傷進行修復(fù)合成的過程。本試驗可以利用放射自顯影法或液體閃爍計數(shù)法顯示DNA修復(fù)合成。常用的細(xì)胞系統(tǒng)有大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞、Hela細(xì)胞及人羊膜細(xì)胞FL株等。一般使用不是處于正在增殖狀態(tài)的細(xì)胞進行試驗。如果細(xì)胞處于增殖時期，則用同步培養(yǎng)法將細(xì)胞阻斷于G1期，使增殖同步化，在藥物的抑制下使殘存的半保留DNA復(fù)制降低到最低限度，然后用受試物處理細(xì)胞，并在加有3H一胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。如果受試物引起DNA損傷，并啟動DNA損傷修復(fù)機制，則培養(yǎng)液中的標(biāo)記DNA合成材料即3H一胸腺嘧啶核苷就會摻入到新合成的DNA鏈中。3H所釋放出的β粒子使感光材料中的銀粒還原為可顯影的銀粒，根據(jù)鏡下所觀察到的細(xì)胞核內(nèi)銀粒數(shù)來判斷受試物是否造成DNA的損傷。程序外DNA合成試驗具有經(jīng)濟、快速、操作簡便，無需昂貴設(shè)備和復(fù)雜技術(shù)等的特點。（七）姐妹染色單體交換試驗（sisterchromatidexchangeassay）在DNA合成期，所有染色體均可進行復(fù)制形成兩條姐妹染色單體。姐妹染色單體交換（SCE）是染色體同源座位上DNA復(fù)制產(chǎn)物的相互交換，其頻率可能與DNA的斷裂和重接有關(guān)，故可間接提示DNA的損傷。SCE的觀察方法是采用姐妹染色單體的差別染色法，細(xì)胞在含5一溴脫氧尿嘧啶核苷（5一Brdu)的培養(yǎng)液中生長兩個周期，在DNA合成期，5一Brdu就可取代胸腺嘧啶摻入DNA中。由于DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制，在第一個細(xì)胞周期，染色體的兩條單體各有一條DNA鏈摻入Brdu，此時兩條姐妹染色單體之間染色沒有區(qū)別。但到了第二個周期的分裂中期，兩條染色單體就會出現(xiàn)Brdu摻入的不同。一條單體中兩條DNA鏈均有Brdu的摻入，而另一條則僅一條DNA鏈中有Brdu的摻入。此時，用染色劑如吉姆薩和光處理，則在普通光學(xué)顯微鏡下可見到，雙股含Brdu的染色單體著色淺淡，而單股含Brdu的染色單體著色深的現(xiàn)象。并可清晰分辨出交換的染色單體，計數(shù)SCE數(shù)。以此判斷受試物是否對DNA有損傷作用。SCE試驗可進行體外試驗，也可進行體內(nèi)試驗。體外試驗可用人外周血淋巴細(xì)胞或睪丸生殖細(xì)胞進行，體內(nèi)試驗可用骨髓細(xì)胞或睪丸生殖細(xì)胞進行。（八）果蠅伴性隱性致死試驗《sex-linkedrecessivelethaltest，SLRL試驗）果蠅伴性隱性致死試驗是利用隱性基因在伴性遺傳中具有交叉遺傳的特征而進行的試驗。試驗所用的果蠅是黑腹果蠅，由于其體內(nèi)對化學(xué)物的生物轉(zhuǎn)化能力與哺乳動物相似，而且世代周期短、繁殖率高、飼養(yǎng)方便、經(jīng)濟、判斷突變終點客觀、不需活化等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)試驗中。給予雄果蠅受試物后，如發(fā)生點突變、小缺失、重組等各類基因突變的隱性致死效應(yīng)，則將傳給F1代雌蠅，再通過F1代雌蠅傳給F2代雄蠅。由于x染色體上的隱性基因在F1代雌蠅為雜合子，不能表達，而在F2代雄蠅為半合子，使位于x染色體上的隱性基因在半合型雄蠅中表現(xiàn)出來。即由于致死基因突變不出現(xiàn)，會有明顯標(biāo)記（如眼睛的形狀和色澤）的野生型雄蠅出現(xiàn)。本試驗盡管具有觀察技術(shù)簡單易行、判斷突變終點客觀、不需活化等優(yōu)點，但由于它與哺乳動物差異較大，且染毒方式與計量計算等都與哺乳動物試驗不同。故對陰性結(jié)果在沒有真核系統(tǒng)試驗支持前不能完全認(rèn)為是無致突變性，對其結(jié)果外推應(yīng)慎重。（九）單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）試驗1984年由Ostiling和Johanson首先建立并應(yīng)用于遺傳毒性試驗的，該方法具有能簡便而又快速測試完整細(xì)胞DNA鏈斷裂的優(yōu)點。其原理和方法為：細(xì)胞在體內(nèi)和體外試驗中受化學(xué)物作用后，DNA鏈發(fā)生斷裂。將細(xì)胞制成單細(xì)胞混懸液，在載玻片上制備加有受檢細(xì)胞混懸液的凝膠，在堿性條件下使細(xì)胞裂解，解旋DNA后進行電泳。帶負(fù)電荷的DNA斷裂端由陰極向陽極遷移。DNA經(jīng)EB染色后在熒光顯微鏡下可觀察到DNA受損的細(xì)胞核拖一條尾巴，呈彗星狀，如DNA無損傷則見圓形的核。故單細(xì)胞凝膠電泳試驗又稱彗星試驗。觀察時通過自動圖像分析儀測定呈彗星狀細(xì)胞的數(shù)量和比例并計算出受損的DNA量，或通過手工操作的方法用目鏡測微尺在熒光顯微鏡下測量細(xì)胞核的直徑和彗星尾部的長度，以此作為DNA受化學(xué)損傷的評價指標(biāo)。（十）熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交（FISH）是原位雜交（ISH）的一種。熒光原位雜交法是近年發(fā)展的一種在保持組織、細(xì)胞或染色體原有形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，對其內(nèi)部特殊核苷酸順序進行檢測及定位的分子生物學(xué)新技術(shù)。該法用生物熒光來標(biāo)記的各類DNA和RNA進行原位雜交，即可使被觀察的特定DNA序列顯現(xiàn)熒光。FISH與放射性核素標(biāo)記不同，具有操作、分析簡便，立體分辨率高，信