中藥制劑檢測的新技術-聚合酶鏈式反應法

聚合酶鏈式反應法聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）是一種在體外特異性地擴增已知基因的生物學技術，是在引物指導下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴增反應，是模擬體內(nèi)DNA復制過程，在體外特異性擴增DNA片段的一種技術。PCR技術已廣泛用于生命學科、醫(yī)學工程、遺傳工程、疾病診斷、法醫(yī)學、考古學、醫(yī)藥及食品等領域1.

概述第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（1）基本原理●模板DNA在高溫下雙鏈解開為單鏈狀態(tài)（變性）；降低溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對，形成部分雙鏈，稱為復性（退火）；再將溫度升至合適溫度，在TaqDNA聚合酶的催化下，以四種脫氧核苷酸（dNTP）為原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段（延伸）。該片段又可作為下一輪反應的模板，如此重復改變溫度，由高溫變性、低溫復性和適溫延伸組成一個周期，反復循環(huán)，使目的基因得以指數(shù)倍增。1.

概述PCR基本原理示意圖第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（1）基本原理●中藥分析中利用這一原理，將經(jīng)過PCR擴增的供試品藥材和對照藥材的DNA片段，通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測，供試品凝膠電泳圖譜中與對照藥材凝膠電泳圖譜相應的位置上應有相應的DNA條帶。從而對供試品的真?zhèn)芜M行鑒別。1.

概述第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（2）主要特點●特異性強●靈敏度高●快速簡便●模板純度要求低1.

概述第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（1）主要儀器●正文內(nèi)容PCR擴增儀、電泳儀、紫外透射儀、凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)、高速離心機（轉(zhuǎn)速可達12000rpm/min及以上）、研缽、移液器、一次性移液槍頭、微量離心管等。2.

儀器和試劑PCR儀凝膠成像系統(tǒng)第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（2）常用試劑●供試品、對照藥材、DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、四種dNTP底物、鑒別引物、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、RNA酶、蛋白酶K、瓊脂糖、各種緩沖液、三羥甲基氨苯甲烷（Tris）、乙二胺四醋酸（EDTA）、無水乙醇、苯酚、氯仿、異丙醇、液氮、Mgcl2、Hcl等。2.

儀器和試劑第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（1）模板DNA的提?、賯鹘y(tǒng)DNA提取方法●

CTAB法●

SDS法②試劑盒法③提取注意事項3.

基本操作DNA試劑盒動物類藥材和植物類藥材的細胞結(jié)構(gòu)有何不同？在模板DNA提取過程中分別該如何操作？課堂互動第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（2）PCR反應①反應體系●在微量離心管中加入適量的PCR反應緩沖液、模板DNA、鑒別引物、dNTP底物、TaqDNA聚合酶、二氯化鎂、無菌超純水等。②PCR反應●將微量離心管置PCR儀中，設置PCR反應參數(shù)：變性、退火、延伸反應的溫度、時間，循環(huán)反應次數(shù)，進行PCR擴增反應。反應完畢，應立即進行瓊脂糖凝膠檢測或?qū)CR產(chǎn)物4℃保存。3.

基本操作第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（2）PCR反應③標準的PCR反應分為三步：●變性（90℃～96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。●退火（60℃～65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈?！裱由欤?0℃～75℃）：在TaqDNA聚合酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以四種dNTP為原料，以引物為起始點進行延伸，合成與模板互補的DNA鏈?！褡冃?、退火和延伸三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板，DNA含量成指數(shù)級增加，30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)一般可達106～107。3.

基本操作第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（2）PCR反應●有的樣品在PCR反應結(jié)束后，還需要在PCR反應液中加入適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，進行酶切反應，用酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，這就是在PCR技術基礎上發(fā)展起來的聚合酶鏈式反應—限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析技術。該技術是通過PCR擴增一段DNA片段，然后在選擇適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，消化PCR產(chǎn)物，經(jīng)電泳，可得到特異性的電泳譜帶，從而達到鑒定不同基因型的目的。3.

基本操作第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（3）電泳檢測●電泳是分離和純化DNA片段的最常用的技術。PCR反應中的DNA電泳檢測，常采用瓊脂糖凝膠電泳法?！癫僮鞣椒ǎ孩倥渲骗傊悄z②對照品溶液及供試品溶液的制備③點樣與電泳④凝膠成像分析●2015年版《中國藥典》中規(guī)定，瓊脂糖凝膠電泳法（通則0541）適用于檢測DNA，PCR反應中的電泳檢測，方法見各品種項下。3.

基本操作第二節(jié)聚合酶鏈式反應法（1）川貝母的聚合酶鏈式反應—限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法鑒別（2）烏梢蛇飲片的聚合酶鏈式反應法鑒別4.

應用實例第二節(jié)聚合酶鏈式反應法小結(jié)1．正文聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）是一種在體外特異性地擴增已知基因的生物學技術，是在引物指導下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴增反應，是模擬體內(nèi)DNA復制過程，在體外特異性擴增DNA片段的一種技術。2．P