DB31∕T 1194-2019 豬增生性腸炎診斷技術(shù)規(guī)范

豬增生性腸炎診斷技術(shù)規(guī)范Diagnostictechniqueforporcineproliferativeenteri2019-09-18發(fā)布2020-01-01實(shí)施 I 2規(guī)范性引用文件 13縮略語 14診斷方法 4.1臨床診斷 4.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 24.3細(xì)菌的分離和鑒定 4.4免疫過氧化物晦單層試驗(yàn)(IPMA) 64.5免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFAT) 4.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(競爭ELISA) 75綜合判定 75.1疑似 75.2確診 8附錄A(規(guī)范性附錄)PCR試劑的配制 9附錄B(規(guī)范性附錄)細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制 附錄C(規(guī)范性附錄)IPMA和IFAT試劑的配制 附錄D(規(guī)范性附錄)競爭ELISA試劑的配制 I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由上海市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出。本標(biāo)準(zhǔn)由上海市畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：上海市動物疫病預(yù)防控制中心。1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬增生性腸炎(PPE)的臨床診斷、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、細(xì)菌的分離與鑒定、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)、免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(競爭ELISA)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的臨床診斷技術(shù)適用于PPE的初步診斷；細(xì)菌的分離與鑒定技術(shù)和PCR試驗(yàn)適用于胞內(nèi)勞森菌的分離、鑒定和PPE的確診；IPMA、IFAT和競爭ELISA適用于胞內(nèi)勞森菌抗體的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法下列縮略語適用于本文件。Ct值：熒光信號量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(cyclethresholdvalue)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay)IEC-18:大鼠回腸細(xì)胞系(ilealepithelialcell-18)IFAT:免疫熒光抗體試驗(yàn)(immunofluorescentantibodytest)IPMA:免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(immunoperoxidasemonolayerassay)LI:胞內(nèi)勞森菌(Lawsoniaintracellularis)NE:壞死性腸炎(necroticenteritis)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)PHE:出血性腸炎(proliferativehaemorrhagicenteropathy)PIA:腺瘤樣增生性腸炎(porcineintestinaladenomatosis)PPE:豬增生性腸炎(porcineproliferativeenteritis)RI:局限性回腸炎(regionalileitis)4診斷方法PPE是一種重要的豬傳染性腸道疾病，又稱回腸炎，由LI引起，以回腸、結(jié)腸和盲腸粘膜增生為特征。各種年齡的豬均易感，特別是6～12周齡的豬最為常見，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、貧血、食欲下降和生2常發(fā)生于4月齡以上的豬，特別是4月~12月育肥豬和后備母豬。癥狀為出血性貧血，病初排黑高達(dá)50%。部分病例沒有糞便異常，僅表現(xiàn)為皮膚蒼白而突然死亡。病理變化主要為PHE,剖檢可見臨床上較為常見，主要發(fā)生于6~20周齡生長育肥有以上流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀及病理變化特點(diǎn)者，可以懷疑豬群有LI感染，確診需要實(shí)驗(yàn)室c)10%十二烷基硫酸鈉(SDS)(配制見A.4);d)蛋白酶K溶液(10mg/mL)(配制見A.5);f)異丙醇(用前預(yù)冷至-20℃);g)70%乙醇(用前預(yù)冷至-20℃);h)2×熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液；j)瓊脂糖(電泳級);k)溴化乙錠(配制見A.6);3o)加樣緩沖液(配制見A.8);p)引物(熒光PCR引物見A.9;套式熒光PCR引物見A.10)。死豬，取病變腸段(回腸、結(jié)腸或盲腸)分段結(jié)扎(每段10cm)。在低溫條件下(2℃~8℃),樣品盡快(24h內(nèi))送往實(shí)驗(yàn)室，不能立即檢測時(shí)應(yīng)置于-20℃中，長期置于-70℃中保存。挑取適量糞便樣品于離心管中，按1:3的比例加入PBS,振蕩混勻，4000g離心5min,取上清備4.2.4DNA提取濃度分別為1%和0.5mg/mL,振蕩混勻；b)56℃水浴30min,置沸水孵育8min;e)加等體積異丙醇(-20℃預(yù)冷),振蕩混勻，4℃12000g離心10min,棄上清；f)加等體積70%乙醇，振蕩混勻，4℃12000g離心10min;h)加入50μLDEPC水，輕輕混勻，室溫放置10min,直接用于檢測或置-20℃?zhèn)溆谩?.2.5熒光PCR模板3μL,用滅菌去離子水補(bǔ)足到25μL,第一階段：95℃預(yù)變性5min;報(bào)告熒光(reportdye)設(shè)定為FAM,淬滅熒光(quenchdye)設(shè)定為TEMRA,校準(zhǔn)熒光設(shè)定為4None或自帶熒光ROX,可根據(jù)不同品牌儀器說明等效設(shè)置參數(shù)。陽性對照的Ct值應(yīng)≤30,并有S型擴(kuò)增曲線，陰性對照應(yīng)無Ct值且無S型擴(kuò)增曲線，否則此次試出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本，判為可疑，可疑樣本應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)仍為可疑判為陽性。陽性對照：取已知陽性的同類樣品作為陽性對照。陰性對照：取已知陰性的同類樣品作為陰性對照。提取的核酸3μL,不足體系用水補(bǔ)足。第一步擴(kuò)增產(chǎn)物1μL,不足體系用水補(bǔ)足。第一步擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min后，94℃40s、55℃40s,72℃40s,35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。第二步擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)與第一步相同。取15μL第2步擴(kuò)增產(chǎn)物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，陽性對照出現(xiàn)270bp的特異性條樣品擴(kuò)增產(chǎn)物在270bp處出現(xiàn)特異性條帶者為陽性，無特異性條帶為陰性。4.3細(xì)菌的分離和鑒定細(xì)菌的分離和鑒定所用試劑見附錄B。5膜或棉拭浸泡液放入SPG中，加入4mL0.1%胰酶溶液消化30s。懸浮液37℃孵育35min,加入10mLSPG。腸壁黏膜在組織研磨器上研磨1min,再加入10mLSPG以備過濾；棉拭樣品用過濾紙將長成單層的IEC-18細(xì)胞用0.1%胰酶消化1min,用細(xì)胞生長液懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×10?個/mL,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加人100μL,5%CO?培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)18h～24h。將樣品濾液在含抗生素細(xì)胞維持液中稀釋，稀釋比例為1:15,然后加至單層IEC-18細(xì)胞上。單層細(xì)胞和細(xì)菌懸液在2000g水平離心30min,轉(zhuǎn)移至智能工作站中，置換的氣體濃度為8%O?,10%CO?,75.8%N?,6.2%H?,37℃孵育3h,然后再供給含抗生素細(xì)胞維持液。培養(yǎng)物放回工作站中，孵育6d,每2天換1次細(xì)胞維持液。倒掉單層細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入0.1%氯化鉀溶液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育5min。用吸管吸去0.1%氯化鉀溶液，加入0.2%氯化鉀溶液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育10min。用吸管吸去0.2%氯化鉀溶液，加入SPG,然后用細(xì)胞刮削器將單層細(xì)胞解離下來，將解離后的細(xì)胞液反復(fù)通過21號針頭注射器3次以將盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，4000g離心5min,取上清，按4.2.5或4.2.6做進(jìn)一步6采集被檢豬血液，2000g離心10min,分離血清，2℃~8℃存放備用，超過1周需-20℃保存。將被檢血清進(jìn)行1:30倍稀釋，取100μL稀釋好的血清加入IPMA診斷板的相應(yīng)孔內(nèi)，封板，37℃孵育1h,棄去液體。用洗滌液洗板3次，每孔300μL,每次1~3min,最后倒置在吸水紙上輕輕拍干。加入HRP-SPA,每孔100μL,37℃孵育1h,棄去液體。洗板3次，各孔中加入AEC溶液50μL,18℃~25℃作用30min,棄去液體。洗板1次后加入50μL乙酸鈉緩沖液待檢。將IPMA診斷板置于倒置顯微鏡下判讀。在對照血清成立的前提下，被檢血清各孔約30%～50%被檢血清的采集和保存見4.4.1.3,試驗(yàn)前將血清用PBS作30倍稀釋。取IFAT診斷板，每孔加入150μLPBS,室溫浸潤5min,棄去板中液體并在吸水紙上輕輕拍干。設(shè)立陰陽對照，并在診斷板的感染和非感染細(xì)胞孔內(nèi)分別加入50μL已稀釋的血清，置于保濕盒內(nèi)37℃作用30min。棄去板中血清，并在吸水紙上輕輕拍干。每孔加入PBS200μL,洗板6次，棄去液體。每孔加入工作濃度的兔抗豬IgGFITC結(jié)合物50μL,濕盒中37℃作用30min。棄去板中結(jié)合物，7將IFAT診斷板置于熒光顯微鏡下判讀。在對照血清成立的前提下，被檢血清在未感染細(xì)胞孔不出現(xiàn)熒光，感染細(xì)胞孔出現(xiàn)綠色熒光，判為陽性；未感染細(xì)胞和感染細(xì)胞都沒有特異性綠色熒光，判為4.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(競爭ELISA)酶標(biāo)測定儀、96孔平底微量反應(yīng)板、微量移液器等。陽性血清、陰性血清和酶標(biāo)記結(jié)合物使用前用稀釋液稀釋至工作濃度，其他試劑見附錄D。被檢血清的采集和保存見4.4.1.3。96孔包被板每孔加入90μL樣品稀釋液，向A?、A?孔中分別加入10μL陰性對照血清，A?、A?孔中分別加入10μL陽性對照血清，其他各孔加入10μL待檢血清，輕微振蕩，37℃孵育60min。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板3次，每次洗滌后均棄去孔內(nèi)液體。最后一次洗滌后，除凈孔內(nèi)液體，拍干。每孔加入100μL酶標(biāo)記結(jié)合物溶液，37℃孵育60min。洗板3次，各孔加入100μL底物溶液，18℃~25℃孵育10min。各孔加入終止液50μL終止反應(yīng)。立即用酶標(biāo)儀于450nm測定各孔光密度陰性對照血清OD值大于0.5,陽性對照血清PI值大于30時(shí)，才可以進(jìn)行結(jié)果判定。否則，本次試89(規(guī)范性附錄)PCR試劑的配制A.1災(zāi)菌雙蒸水1000mL雙蒸水(ddH?O,電阻≥18.22)(121±2)℃高壓滅菌20min后備用A.2焦碳酸二乙酯(DEPC)水取焦碳酸二乙酯(DEPC)5.00μL加入1000mL滅菌雙蒸水中，混勻，室溫過夜，(121±2)℃高壓滅菌20min。A.3磷酸鹽緩沖液(PBS)溶于1000mL滅菌雙蒸水中，(121±2)℃高壓滅菌20min,4℃保存?zhèn)溆?。A.410%十二烷基硫酸鈉(SDS)取SDS10g溶于100mL去離子水。A.5蛋白酶K溶液(10mg/mL)取蛋白海K100mg加入9.5mL水中，輕輕搖動，直至蛋白海K完全溶解，不要渦旋混合，加水定容到10mL,-20℃保存?zhèn)溆?。A.6溴化乙錠(EB)溶液溴化乙錠(EB)200mg,加滅菌雙蒸水至20mL,混勻。A.750×電泳緩沖液取Tris堿242.00g、冰乙酸57.10mL用時(shí)，取10mL電泳緩沖液用490mL蒸餾水稀釋成1×電泳緩沖液。A.8加樣緩沖液每100mL溶液中含溴酚藍(lán)0.25g、蔗糖40g。TaqMan探針R3:FAM-5'-CCGCCCGTC標(biāo)記的報(bào)告熒光集團(tuán)和淬滅基團(tuán)可根據(jù)熒光PCR設(shè)備具體情況另行選定。A.10胞內(nèi)勞森菌套式PCR擴(kuò)增引物序列外套上游引物W1:5'-TATGGCTGT外套下游引物W2:5'-TGAAGGTATTG內(nèi)套下游引物N2:5'-CTTTCTCATGTCCCATAAGC-3'引物濃度均為20pmol/μL,外套引物擴(kuò)增片段大小為319bp,內(nèi)套引物擴(kuò)增片段大小為270bp。(規(guī)范性附錄)細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制B.1磷酸鹽緩沖液(PBS)(KH?PO?)0.24g,用鹽酸(HC1)調(diào)pH值至7.4,加二級水至1000mL,(121±2)℃高壓滅菌20min,室溫保存。B.2胰酶溶液B.2.10.1%胰酶溶液取0.10g胰酶溶于100mLPBS中，調(diào)pH值至7.4,0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存，4℃一周內(nèi)用完。B.2.20.25%胰酶溶液取0.25g胰酶溶于100mLPBS中，調(diào)pH值至7.4,0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存，4℃一周內(nèi)用完。B.3谷氨酸鈉鉀溶液(SPG)牛血清(FBS)50mL,加二級水至500mL,調(diào)pH至7.0,0.22μm濾膜過濾除菌后，4℃保存。B.4細(xì)胞生長液取胎牛血清(FBS)100mL溶于900mL高糖型DMEM培養(yǎng)液(H-DMEM)中，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存。B.5細(xì)胞維持液取胎牛血清(FBS)70mL溶于930mL高糖型DMEM培養(yǎng)液菌，4℃保存。B.6含抗生素細(xì)胞維持液取胎牛血清(FBS)70mL、萬古霉素100mg、兩性霉素B2m充分溶解于930mL高糖型DMEM培養(yǎng)液(H-DMEM)中，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存。B.7氯化鉀溶液B.7.10.1%氯化鉀(KCI)氯化鉀0.5g充分溶解于500mL二級水中，0.22μm濾膜過濾除菌后備用。氯化鉀1g充分溶解于500mL二級水中，0.22μm濾膜過濾除菌后備用。(規(guī)范性附錄)IPMA和IFAT試劑的配制C.1洗滌液(用于IPMA)取氯化鈉(NaCl)8.78g和吐溫-805g溶于1000mL二級水中，4℃保存?zhèn)溆?，保存?0d。C.2顯色/底物溶液(用于IPMA)C.2.1AEC貯存液取氨乙基咔唑(3-amino-9-ethyl-carbazole)4mg加入二甲基甲酰胺(N,N-dimethy-formamide)C.2.2乙酸鈉緩沖液取乙酸鈉(CH?COONa)4.1g加入1000mL二級水中，用100%乙酸調(diào)整至pH5.0。C.2.3AEC溶液(用于IPMA)取AEC貯存液1mL,30%過氧化氫(H?O?)10μL,溶于19mL乙酸鈉緩沖液中，充分混合后，用C.3血清稀釋液(用于IPMA)取氯化鈉(NaCl)29.2g、馬血清4mL、吐溫-805g,溶于1000mL二級水中，調(diào)pH值至7.2,現(xiàn)用現(xiàn)配。C.4熒光抗體稀釋液(用于IFAT)文思藍(lán)0.10g,溶于1000mL二級水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。C.5IPMA/IFAT診斷板的制備C.5.1將長成單層的IEC-18細(xì)胞用0.1%胰酶消化1min,用細(xì)胞生長液懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×10?個/mL,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔分別加入100μL,5%CO?培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)18h~24h。C.5.2用細(xì)胞維持液稀釋LI標(biāo)準(zhǔn)菌液，稀釋比例為1:15,然后取100μL接種IEC-