小鼠抗人GP73單克隆抗體制備及鑒定：方法、影響因素與應用前景

一、引言1.1研究背景與意義肝臟作為人體至關重要的代謝和解毒器官，一旦發(fā)生病變，如肝炎、肝硬化、肝癌等，會嚴重威脅人類的健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）估計，2000年全世界肝癌發(fā)病人數(shù)為56.4萬，死亡54.9萬人，而我國肝癌發(fā)病人數(shù)30.6萬，死亡30.0萬人，約占全世界的50％，我國現(xiàn)有乙肝病毒攜帶者1.2億左右，約占世界乙肝病毒攜帶者的1/3；有癥狀的慢性乙肝患者2000萬人，另外我國還有肝硬化患者360萬人。由于眾多的肝病患者和肝癌高危人群，我國的肝細胞癌發(fā)病率居高不下。因此，對肝臟疾病的早期診斷和治療顯得尤為重要。高爾基體蛋白73（GolgiProtein73，GP73），是一種II型高爾基跨膜蛋白，也是一種新發(fā)現(xiàn)的與肝病病程相關的蛋白。在正常生理狀態(tài)下，GP73在肝細胞中表達量極少，主要在膽管上皮細胞中表達。然而，當肝細胞受到病毒感染、發(fā)生炎癥或癌變等病理變化時，GP73的表達會顯著上調(diào)。研究表明，在乙肝、丙肝等病毒性肝炎患者體內(nèi)，GP73水平會隨著病毒的活躍復制而升高；在肝硬化患者中，隨著肝纖維化程度的加重，血清GP73濃度也逐漸上升；特別是在肝癌患者中，GP73的表達水平呈現(xiàn)出大幅度的提升，且與肝癌的分期、預后等密切相關。如在一項針對60個肝癌患者和30個非肝癌患者的血清樣本分析中，GP73單克隆抗體對肝癌的敏感性為78.33%，特異性為90.00%，對于早期肝癌的敏感性更高，可達85.71%。正是由于GP73在肝臟疾病進程中的這種特異性表達變化，使得它成為極具潛力的肝臟疾病診斷和監(jiān)測的生物標志物。通過檢測GP73的表達水平，醫(yī)生能夠更準確地判斷肝臟疾病的類型、嚴重程度以及病情發(fā)展趨勢，從而為患者制定更為精準有效的治療方案。單克隆抗體技術自問世以來，憑借其特異性強、靈敏度高、可大量制備且性質(zhì)均一穩(wěn)定等顯著優(yōu)勢，在疾病診斷、治療以及基礎研究等眾多領域得到了廣泛應用。在肝臟疾病診斷領域，針對GP73制備的單克隆抗體，能夠特異性地識別并結(jié)合GP73抗原，從而實現(xiàn)對樣本中GP73的高靈敏度、高特異性檢測。這不僅有助于提高肝臟疾病早期診斷的準確性，還能為肝癌的早期篩查、分期以及預后評估提供強有力的工具。例如，利用基于GP73單克隆抗體的熒光ELISA系統(tǒng)，能夠準確確定肝癌患者的GP73水平，為肝癌的早期診斷和病情監(jiān)測提供關鍵依據(jù)。本研究聚焦于小鼠抗人GP73單克隆抗體的制備與鑒定，具有重要的理論和實踐意義。從理論層面來看，深入研究GP73單克隆抗體的制備與鑒定過程，能夠加深我們對GP73蛋白結(jié)構與功能關系的理解，為進一步探究肝臟疾病的發(fā)病機制提供新的視角和思路。從實踐應用角度出發(fā)，成功制備并鑒定出高效、特異性強的小鼠抗人GP73單克隆抗體，將為開發(fā)新型的肝臟疾病診斷試劑和方法奠定堅實基礎，有望顯著提高肝臟疾病的早期診斷率，為患者的早期治療和康復贏得寶貴時間，具有重要的臨床應用價值和社會經(jīng)濟效益。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對GP73的研究起步較早，自2000年Kladney等首次發(fā)現(xiàn)GP73并揭示其在肝臟疾病中的表達變化后，眾多科研團隊圍繞GP73展開了深入探索。在單克隆抗體制備方面，已經(jīng)有多種成熟的技術路線被應用，如傳統(tǒng)的雜交瘤技術，通過將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗GP73單克隆抗體的雜交瘤細胞株。這些單克隆抗體被廣泛應用于基礎研究中，用于探究GP73在肝臟生理病理過程中的作用機制，如研究GP73在肝癌細胞增殖、遷移和侵襲過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡。在臨床應用研究上，國外學者利用GP73單克隆抗體開發(fā)了多種檢測方法，如化學發(fā)光免疫分析法、免疫熒光法等，用于肝癌及其他肝臟疾病的診斷和病情監(jiān)測，并取得了一定的成果，部分檢測方法已進入臨床試驗階段。國內(nèi)在GP73單克隆抗體領域的研究也取得了顯著進展?？蒲腥藛T在優(yōu)化抗體制備工藝上投入了大量精力，通過改進抗原制備方法、調(diào)整免疫方案以及優(yōu)化雜交瘤細胞篩選流程等手段，提高了單克隆抗體的質(zhì)量和產(chǎn)量。在臨床研究方面，國內(nèi)開展了多項大規(guī)模的臨床樣本檢測實驗，進一步驗證了GP73單克隆抗體在肝臟疾病診斷中的價值，如在一項針對中國人群的多中心研究中，納入了上千例不同類型肝臟疾病患者及健康對照，結(jié)果顯示GP73單克隆抗體檢測在肝癌早期診斷中的靈敏度和特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)指標甲胎蛋白（AFP），為肝癌的早期篩查提供了新的有力工具。同時，國內(nèi)還積極探索GP73單克隆抗體與其他生物標志物聯(lián)合檢測的模式，以提高肝臟疾病診斷的準確性和全面性。盡管國內(nèi)外在GP73單克隆抗體的研究和應用方面取得了諸多成果，但目前仍存在一些不足之處。在單克隆抗體的性能上，部分抗體的親和力和穩(wěn)定性還有提升空間，這可能影響檢測的靈敏度和重復性；在檢測方法上，現(xiàn)有的檢測技術雖然能夠?qū)崿F(xiàn)對GP73的定量檢測，但檢測流程較為復雜，檢測時間較長，難以滿足臨床快速診斷的需求；在臨床應用方面，GP73單克隆抗體檢測尚未形成統(tǒng)一的標準化流程和參考區(qū)間，不同實驗室的檢測結(jié)果可比性較差，限制了其在臨床實踐中的廣泛推廣應用。本研究的創(chuàng)新點在于，嘗試采用新型的抗原修飾策略和細胞融合技術，期望制備出親和力更高、特異性更強的小鼠抗人GP73單克隆抗體。在抗體鑒定過程中，引入先進的蛋白質(zhì)組學和生物信息學技術，全面深入地分析抗體的結(jié)構和功能特性，為抗體的優(yōu)化提供更精準的依據(jù)。此外，本研究還將致力于開發(fā)基于該單克隆抗體的快速、簡便、高靈敏度的檢測方法，并通過大規(guī)模的臨床樣本驗證，建立標準化的檢測流程和參考區(qū)間，為GP73單克隆抗體在肝臟疾病臨床診斷中的廣泛應用奠定堅實基礎，補充現(xiàn)有研究在這些方面的不足。二、小鼠抗人GP73單克隆抗體制備2.1實驗材料與儀器實驗動物：6-8周齡雌性BALB/c小鼠，購自[具體動物供應商名稱]。BALB/c小鼠屬于近交系小鼠，其遺傳背景高度純合，個體間差異小，免疫反應一致性高。在單克隆抗體制備實驗中，這種遺傳穩(wěn)定性能夠確保小鼠在接受相同抗原免疫后，產(chǎn)生較為一致的免疫應答，有利于后續(xù)篩選出穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株。同時，BALB/c小鼠對多種抗原具有良好的免疫原性，能夠高效地產(chǎn)生針對目標抗原的抗體，是單克隆抗體制備中常用的實驗動物。細胞株：SP2/0骨髓瘤細胞株，由本實驗室保存。SP2/0細胞是小鼠骨髓瘤細胞，具有在體外無限增殖的特性。在單克隆抗體制備過程中，將其與免疫小鼠的脾細胞融合，形成的雜交瘤細胞既能繼承脾細胞分泌特異性抗體的能力，又能獲得SP2/0細胞無限增殖的特點，從而實現(xiàn)單克隆抗體的大量制備。試劑：抗原：重組人GP73蛋白，購自[蛋白供應商名稱]。該重組蛋白經(jīng)過純化和鑒定，純度高、活性好，能夠有效刺激小鼠的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體。其氨基酸序列和空間結(jié)構與天然人GP73蛋白高度相似，確保了制備的單克隆抗體能夠準確識別和結(jié)合天然GP73抗原，提高抗體的特異性和實用性。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑：購自[佐劑供應商名稱]。在免疫小鼠時，弗氏完全佐劑用于初次免疫，它能夠增強抗原的免疫原性，促進抗原在體內(nèi)的緩慢釋放，刺激機體產(chǎn)生強烈的免疫反應；弗氏不完全佐劑用于后續(xù)加強免疫，進一步增強小鼠的免疫應答，提高抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量。細胞培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基（購自[培養(yǎng)基供應商名稱]），添加10%胎牛血清（購自[胎牛血清供應商名稱]）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。RPMI-1640培養(yǎng)基為細胞提供了適宜的營養(yǎng)環(huán)境，胎牛血清中含有豐富的生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和增殖；青霉素和鏈霉素則用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，保證細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境。細胞融合試劑：聚乙二醇（PEG，分子量為4000，購自[PEG供應商名稱]），作為細胞融合劑，能夠促進脾細胞和骨髓瘤細胞的細胞膜融合，形成雜交瘤細胞。其作用原理是通過改變細胞膜的表面電荷和流動性，使兩種細胞更容易相互靠近并融合在一起。篩選培養(yǎng)基：HAT培養(yǎng)基（含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷，購自[HAT培養(yǎng)基供應商名稱]），用于雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞由于缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤進行核酸合成，而被氨基蝶呤阻斷了正常的核酸合成途徑，從而無法生長；未融合的脾細胞在體外存活時間有限，也會逐漸死亡；只有融合的雜交瘤細胞，由于獲得了脾細胞的HGPRT，能夠在HAT培養(yǎng)基中利用次黃嘌呤進行核酸合成，從而存活并增殖。其他試劑：磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4，自制），用于細胞洗滌、抗原稀釋等操作，維持溶液的pH穩(wěn)定，為細胞和生物分子提供一個接近生理狀態(tài)的環(huán)境；二甲基亞砜（DMSO，購自[DMSO供應商名稱]），在細胞凍存時作為冷凍保護劑，能夠降低細胞在冷凍過程中的冰晶損傷，提高細胞復蘇后的存活率。儀器：CO?培養(yǎng)箱：[品牌及型號]，為細胞培養(yǎng)提供適宜的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%）環(huán)境，維持細胞的正常生長和代謝。其中，CO?能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其保持在細胞生長所需的適宜范圍內(nèi)。超凈工作臺：[品牌及型號]，提供一個無菌的操作環(huán)境，防止外界微生物污染實驗材料和細胞，確保實驗的準確性和可靠性。通過過濾空氣，去除空氣中的塵埃和微生物，為實驗操作提供一個潔凈的空間。高速離心機：[品牌及型號]，用于細胞離心、蛋白質(zhì)分離等操作。在細胞融合過程中，通過離心使脾細胞和骨髓瘤細胞充分混合，提高融合效率；在蛋白質(zhì)純化過程中，利用不同離心速度和時間，分離出目標蛋白和雜質(zhì)。酶標儀：[品牌及型號]，用于檢測ELISA實驗中的吸光度值，定量分析抗體的效價和特異性。其工作原理是通過檢測特定波長下的光吸收強度，反映樣品中抗原-抗體反應的程度，從而實現(xiàn)對抗體性能的評估。倒置顯微鏡：[品牌及型號]，用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和融合情況。在細胞培養(yǎng)過程中，實時監(jiān)測細胞的生長情況，及時發(fā)現(xiàn)細胞的異常變化，如細胞形態(tài)改變、生長速度減慢等；在細胞融合后，觀察雜交瘤細胞的形成和生長情況，篩選出具有良好生長狀態(tài)的雜交瘤細胞克隆。2.2GP73抗原的制備與純化2.2.1GP73基因的獲取與表達載體構建獲取GP73基因是整個實驗的關鍵起始步驟。首先，從人肝癌細胞系HepG2中提取總RNA，這是因為HepG2細胞中GP73基因表達相對較高，能夠為后續(xù)的基因擴增提供豐富的模板。提取過程采用Trizol試劑法，該方法利用Trizol試劑中的異硫氰酸胍和苯酚等成分，能夠迅速裂解細胞，使核酸和蛋白質(zhì)分離，同時有效抑制RNA酶的活性，從而保證提取的RNA的完整性和純度。提取得到的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的兩倍，表明RNA質(zhì)量良好，無明顯降解，可用于后續(xù)實驗。以提取的總RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術擴增GP73基因。在RT-PCR過程中，首先利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系中包含總RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs以及緩沖液等成分，反應條件為42℃孵育60分鐘，隨后95℃加熱5分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。接著以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，根據(jù)GenBank中公布的GP73基因序列（登錄號：[具體登錄號]），設計特異性引物，引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。引物設計遵循堿基互補配對原則，同時考慮引物的長度、Tm值、GC含量等因素，以確保引物具有良好的特異性和擴增效率。PCR擴增體系包括cDNA模板、上下游引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs以及PCR緩沖液等，擴增條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預期大小位置（約[X]bp）出現(xiàn)明亮的條帶，與理論值相符，表明成功擴增出GP73基因。將擴增得到的GP73基因克隆到原核表達載體pET-28a(+)上。在進行連接反應前，先使用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI對pET-28a(+)載體和GP73基因PCR產(chǎn)物進行雙酶切處理。酶切反應體系包含載體或PCR產(chǎn)物、限制性內(nèi)切酶、緩沖液等，37℃孵育3小時，使酶切反應充分進行。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，確?；厥盏钠渭兌雀?、完整性好。將回收的GP73基因片段與同樣經(jīng)雙酶切處理的pET-28a(+)載體在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應，連接體系中包含載體片段、基因片段、T4DNA連接酶、緩沖液等，16℃連接過夜。連接反應完成后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化過程如下：將連接產(chǎn)物加入到冰浴的DH5α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘；然后42℃熱激90秒，迅速置于冰浴中2分鐘；加入預熱的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細菌恢復生長并表達抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時，待菌落長出后，隨機挑取單菌落進行菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定。菌落PCR鑒定時，以挑取的菌落為模板，使用與構建載體時相同的引物進行PCR擴增，擴增條件與之前的PCR擴增條件相同，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在預期位置出現(xiàn)條帶，則初步判斷為陽性克隆。對初步鑒定為陽性的克隆進行雙酶切鑒定，酶切體系和條件與之前的雙酶切相同，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)與預期大小相符的載體片段和GP73基因片段，則進一步確認重組表達載體構建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進行測序驗證，測序結(jié)果與GenBank中公布的GP73基因序列進行比對，若完全一致，則表明成功構建了重組表達載體pET-28a(+)-GP73。2.2.2原核表達與蛋白純化將構建成功的重組表達載體pET-28a(+)-GP73轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，以實現(xiàn)GP73蛋白的原核表達。轉(zhuǎn)化方法與轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞類似，將重組質(zhì)粒加入到冰浴的BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，冰浴、熱激、復蘇后，涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時。挑取單菌落接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，進行種子培養(yǎng)。次日，按1:100的比例將種子液轉(zhuǎn)接至新鮮的含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體OD600值達到0.6-0.8，此時菌體處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好，適合進行誘導表達。向培養(yǎng)體系中加入終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），25℃、180rpm誘導表達16小時。IPTG能夠誘導大腸桿菌表達外源基因，其作用機制是IPTG作為乳糖操縱子的誘導物，與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構象發(fā)生改變，從而無法與操縱基因結(jié)合，解除對基因轉(zhuǎn)錄的抑制，啟動外源基因的表達。誘導表達結(jié)束后，收集菌體，進行超聲破碎。將菌體懸浮于適量的PBS緩沖液中，在冰浴條件下進行超聲破碎，超聲參數(shù)設置為：功率200W，超聲3秒，間隔5秒，總時間30分鐘。超聲破碎的目的是使細胞破裂，釋放出胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。破碎后的菌液經(jīng)12000rpm、4℃離心30分鐘，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳分析，以確定GP73蛋白的表達形式。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在約[X]kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預期的GP73蛋白大小相符，且蛋白主要以可溶性形式存在于上清中。利用鎳離子親和層析柱對上清中的GP73蛋白進行純化。由于重組表達載體pET-28a(+)上帶有His標簽，His標簽能夠與鎳離子親和層析柱上的鎳離子特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)對GP73蛋白的分離純化。首先用平衡緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑）平衡鎳離子親和層析柱，流速為1mL/min，平衡3-5個柱體積，使柱子達到穩(wěn)定狀態(tài)。然后將超聲破碎后的上清液緩慢上樣到平衡好的柱子上，流速為0.5mL/min，上樣完成后，用平衡緩沖液繼續(xù)沖洗柱子，直至流出液的OD280值接近基線，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。接著用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑）洗脫目的蛋白，流速為1mL/min，收集洗脫峰。咪唑能夠與His標簽競爭結(jié)合鎳離子，隨著咪唑濃度的升高，與鎳離子結(jié)合的His標簽逐漸被洗脫下來，從而實現(xiàn)目的蛋白的洗脫。收集的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，在約[X]kDa處出現(xiàn)單一的條帶，表明GP73蛋白得到了有效純化。將純化后的GP73蛋白用透析緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl）進行透析，4℃透析過夜，以去除蛋白溶液中的咪唑和其他雜質(zhì)，得到高純度的GP73蛋白，用于后續(xù)的小鼠免疫實驗。2.3動物免疫與細胞融合2.3.1免疫小鼠選取6-8周齡雌性BALB/c小鼠，在正式免疫前，先將小鼠置于動物房適應環(huán)境1周，期間自由進食和飲水，維持動物房溫度在22±2℃，相對濕度在50%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)，以確保小鼠處于良好的生理狀態(tài)，減少環(huán)境因素對免疫效果的影響。初次免疫時，將純化后的重組人GP73蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，使用醫(yī)用三通管和注射器進行反復推打乳化，直至混合物滴到水面能保持滴狀，不迅速擴散，表明乳化完全。此時抗原的濃度為1mg/mL，按照每只小鼠100μg抗原的劑量，采用多點注射法，在小鼠的四肢皮下、腋下等部位進行注射，以刺激小鼠的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答。后續(xù)加強免疫分別在第14天、第28天和第42天進行。每次加強免疫時，將GP73蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，抗原濃度和免疫劑量與初次免疫相同，免疫注射過程與首免一致。在加強免疫過程中，佐劑能夠增強抗原的免疫原性，持續(xù)刺激小鼠免疫系統(tǒng)，使小鼠產(chǎn)生更高水平的抗體。在第四次免疫后的第7天，通過小鼠尾部靜脈采血，收集血液樣本于無菌離心管中，37℃放置1小時，使血液凝固，然后4℃放置1小時，促進血清析出。隨后3000-4000rpm離心5-10分鐘，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的干凈EP管內(nèi)，得到免疫小鼠血清。采用間接ELISA法測定小鼠血清效價，以確定小鼠的免疫效果是否達到細胞融合的要求。將抗原進行系列稀釋，包被酶標板，每孔加入100μL，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗原。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育1小時，封閉酶標板上的非特異性結(jié)合位點。再次洗滌后，加入稀釋后的免疫小鼠血清，每孔100μL，37℃孵育1小時。洗滌后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育30分鐘。最后加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光反應15-20分鐘，當顏色明顯變化時，加入2M硫酸終止液，每孔50μL。使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度（OD）值。當血清稀釋倍數(shù)為12800時，OD值≥1，即可判定小鼠的免疫效果滿足融合標準。若小鼠血清效價未達到要求，可在第56天進行第五次免疫，免疫方法同前，然后再次檢測血清效價，直至滿足融合標準。若小鼠血清效價達到要求，則在融合前3天，進行一次沖刺免疫，取抗原原液200-250μg/只，直接進行腹腔注射，以進一步增強小鼠的免疫應答，為細胞融合提供高質(zhì)量的脾細胞。2.3.2細胞融合過程在沖刺免疫后的第3天，將小鼠頸椎脫臼處死，迅速放入75%酒精中浸泡消毒3-5分鐘，以殺滅小鼠體表的微生物，防止污染實驗材料。在超凈工作臺內(nèi)，取出小鼠的脾臟，置于盛有預冷的RPMI-1640不完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，然后用注射器芯輕輕研磨，使脾細胞充分釋放出來，制成脾細胞懸液。將脾細胞懸液通過200目細胞篩網(wǎng)過濾，去除組織碎片和雜質(zhì)，得到單細胞懸液。將SP2/0骨髓瘤細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中復蘇，待細胞完全融化后，轉(zhuǎn)移至含有RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1500rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞融合前24小時，將SP2/0細胞傳代，以保證細胞處于對數(shù)生長期，活力良好。用RPMI-1640不完全培養(yǎng)基將制備好的脾細胞和處于對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細胞分別重懸，用血球計數(shù)板計數(shù)，然后按照脾細胞：SP2/0細胞=3:1的比例于50ml無菌離心管中混合，充分混合后加入RPMI-1640不完全培養(yǎng)基至40ml。1500rpm離心5min，使細胞沉淀。離心后棄去上清以及管壁液體，用滅菌吸水紙條吸干殘留液體，以避免殘留液體對后續(xù)融合過程產(chǎn)生影響。輕輕敲打離心管底部，使SP2/0細胞和免疫鼠細胞混合沉淀松動，將離心管底部浸入37℃溫水中，為細胞融合提供適宜的溫度環(huán)境。從培養(yǎng)箱中取出已溫育的1ml融合劑PEG（分子量為4000），在60s內(nèi)均勻滴入細胞混合沉淀中，邊滴加邊緩慢轉(zhuǎn)動離心管，使PEG充分作用于細胞，促進細胞膜融合。滴加完PEG后，靜置溫育45s，然后取出37℃溫箱中預熱的RPMI-1640不完全培養(yǎng)基，先取1ml，在60s內(nèi)均勻滴入沉淀中稀釋PEG融合劑，邊滴加邊轉(zhuǎn)動離心管；再取1ml，在30s內(nèi)均勻滴入；之后將剩余的45ml培養(yǎng)基全部慢慢滴入。滴加過程中要注意速度的控制，避免對細胞造成損傷。終止PEG作用后，靜置在37℃水浴約10分鐘，使細胞充分恢復。然后1500rpm離心5min，棄去上清液，用HAT培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，將細胞懸液分裝到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HAT培養(yǎng)基能夠選擇性地培養(yǎng)雜交瘤細胞，抑制未融合的骨髓瘤細胞和脾細胞的生長。2.4雜交瘤細胞的篩選與克隆化2.4.1初步篩選細胞融合后，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，待雜交瘤細胞在96孔板中生長至孔底面積的1/3-1/2時，即可進行初步篩選。采用間接ELISA法對融合后的細胞培養(yǎng)上清進行檢測，以篩選出能夠分泌抗GP73單克隆抗體的雜交瘤細胞。在進行ELISA檢測時，首先用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）將純化的重組人GP73蛋白稀釋至1μg/mL，每孔加入100μL，包被酶標板，4℃過夜。包被過程中，抗原會特異性地吸附在酶標板的孔壁上，形成固相抗原。次日，棄去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌酶標板3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗原。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育1小時，封閉酶標板上的非特異性結(jié)合位點，防止后續(xù)檢測過程中出現(xiàn)非特異性吸附。再次洗滌后，加入待檢測的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，每孔100μL，同時設置陰性對照（未免疫小鼠的脾細胞培養(yǎng)上清）和陽性對照（已知的抗GP73陽性血清），37℃孵育1小時。在這一步中，若雜交瘤細胞分泌的抗體能夠與固相抗原結(jié)合，就會形成抗原-抗體復合物。洗滌后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育30分鐘。二抗能夠特異性地識別并結(jié)合一抗（雜交瘤細胞分泌的抗體），形成抗原-抗體-酶標二抗復合物。最后加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光反應15-20分鐘，當顏色明顯變化時，加入2M硫酸終止液，每孔50μL。TMB在HRP的催化作用下發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，加入硫酸終止反應后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色，顏色的深淺與雜交瘤細胞分泌的抗體量成正比。使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度（OD）值，當OD450nm值大于陰性對照OD值的2.1倍時，判定該孔的雜交瘤細胞為陽性，即能夠分泌抗GP73單克隆抗體。2.4.2有限稀釋法克隆化將初步篩選得到的陽性雜交瘤細胞進行克隆化，以獲得穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細胞株。采用有限稀釋法進行克隆化，具體步驟如下：將陽性雜交瘤細胞用含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為50個/mL、10個/mL和5個/mL。在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL飼養(yǎng)細胞懸液（飼養(yǎng)細胞選用小鼠腹腔巨噬細胞，提前制備并調(diào)整濃度為2×10?個/mL），飼養(yǎng)細胞能夠分泌細胞因子，為雜交瘤細胞的生長提供適宜的微環(huán)境，促進雜交瘤細胞的生長和增殖。然后將不同濃度的雜交瘤細胞懸液分別加入96孔板中，每孔100μL，使每孔中雜交瘤細胞的數(shù)量分別約為5個、1個和0.5個。置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，期間觀察細胞生長情況。當細胞生長至孔底面積的1/3-1/2時，采用間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的抗體效價，方法同初步篩選。選擇抗體效價高且穩(wěn)定的單克隆細胞孔，將其中的細胞繼續(xù)進行有限稀釋法克隆化，重復2-3次，直至所有克隆化細胞孔的抗體效價均一且穩(wěn)定，表明獲得了穩(wěn)定分泌抗GP73單克隆抗體的單克隆細胞株。將篩選得到的單克隆細胞株擴大培養(yǎng)，一部分凍存于液氮中，作為種子細胞長期保存；另一部分用于后續(xù)的單克隆抗體大量制備和鑒定實驗。三、影響小鼠抗人GP73單克隆抗體制備的因素3.1抗原相關因素3.1.1抗原純度抗原純度在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備過程中扮演著舉足輕重的角色，對免疫反應的特異性和抗體質(zhì)量有著深遠影響。高純度的抗原能夠有效減少雜質(zhì)對免疫反應的干擾，從而顯著提高免疫反應的特異性。當抗原中存在雜質(zhì)時，這些雜質(zhì)可能會作為額外的抗原刺激小鼠的免疫系統(tǒng)，導致小鼠產(chǎn)生針對雜質(zhì)的抗體，使得最終獲得的抗體混合物中包含多種非特異性抗體，這不僅會增加后續(xù)抗體篩選和純化的難度，還會降低目標抗體的純度和特異性。在實際研究中，眾多實驗結(jié)果有力地證明了高純度抗原的優(yōu)勢。例如，在一項關于病毒抗原單克隆抗體制備的研究中，對比了高純度抗原組和低純度抗原組的免疫效果。高純度抗原組采用了先進的純化技術，使抗原純度達到了95%以上；而低純度抗原組的抗原純度僅為70%左右。結(jié)果顯示，高純度抗原組免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體效價明顯高于低純度抗原組，且抗體的特異性更強，在后續(xù)的檢測實驗中，能夠更準確地識別和結(jié)合目標抗原，背景信號更低。對于GP73單克隆抗體制備而言，高純度的GP73抗原同樣至關重要。高純度的GP73抗原能夠確保小鼠免疫系統(tǒng)主要針對GP73的特定抗原表位產(chǎn)生免疫應答，從而產(chǎn)生高特異性的單克隆抗體。這些抗體在用于肝臟疾病診斷時，能夠更準確地檢測出樣本中的GP73，減少假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，提高診斷的準確性和可靠性。為了獲得高純度的GP73抗原，本研究采用了多種純化技術相結(jié)合的方法。首先通過鎳離子親和層析柱利用GP73蛋白上的His標簽與鎳離子的特異性結(jié)合，初步分離出GP73蛋白，去除大部分雜質(zhì)；然后采用凝膠過濾層析進一步根據(jù)蛋白的分子量大小進行分離，去除殘留的雜質(zhì)和聚合物，從而得到高純度的GP73抗原。經(jīng)過SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示在預期位置出現(xiàn)單一且清晰的條帶，表明GP73抗原的純度達到了90%以上，滿足后續(xù)抗體制備的要求。這種高純度的抗原為制備高質(zhì)量的小鼠抗人GP73單克隆抗體奠定了堅實基礎，有助于提高抗體的特異性和親和力，使其在肝臟疾病的診斷和研究中發(fā)揮更重要的作用。3.1.2抗原表位抗原表位是抗原分子上能被抗體識別的特定區(qū)域，其對產(chǎn)生抗體的特異性和親和力有著決定性影響。不同的抗原表位會誘導機體產(chǎn)生不同特異性的抗體，這是因為抗體的抗原結(jié)合部位（互補決定區(qū)，CDR）與抗原表位具有高度的特異性匹配關系。例如，線性表位是由連續(xù)的氨基酸序列組成，其誘導產(chǎn)生的抗體主要識別線性的氨基酸排列順序；而構象表位則依賴于抗原的三維空間結(jié)構，由不連續(xù)的氨基酸通過折疊形成特定的空間構象，針對構象表位產(chǎn)生的抗體能夠識別抗原的特定三維結(jié)構。在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備中，選擇合適的抗原表位對于獲得具有高特異性和高親和力的抗體至關重要。如果選擇的抗原表位位于GP73蛋白的保守區(qū)域，且該區(qū)域與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，那么針對該表位產(chǎn)生的抗體就更有可能特異性地識別病變狀態(tài)下的GP73蛋白，從而在肝臟疾病診斷中發(fā)揮重要作用。為了選擇合適的抗原表位，本研究采用了生物信息學預測和實驗驗證相結(jié)合的方法。首先，利用生物信息學軟件，如IEDB（ImmuneEpitopeDatabase）等，對GP73蛋白的氨基酸序列進行分析，預測可能的抗原表位。這些軟件通過綜合考慮氨基酸的親水性、柔韌性、表面可及性以及與MHC分子的結(jié)合能力等因素，篩選出潛在的抗原表位。然后，對預測得到的抗原表位進行合成，并將其分別免疫小鼠，通過ELISA等方法檢測小鼠血清中抗體的效價和特異性，從而確定最具免疫原性和特異性的抗原表位。在實驗驗證過程中，發(fā)現(xiàn)其中一個預測的抗原表位（位于GP73蛋白的第[X]-[X]氨基酸區(qū)域）免疫小鼠后，產(chǎn)生的抗體具有較高的效價和特異性。進一步的研究表明，該表位在肝癌患者體內(nèi)的GP73蛋白上高度暴露，而在正常肝臟組織中的GP73蛋白上則相對隱蔽，這使得針對該表位的抗體能夠更有效地識別肝癌患者體內(nèi)的GP73，為肝癌的早期診斷提供了有力的工具。通過這種方法，能夠準確地選擇合適的抗原表位，為制備高特異性和高親和力的小鼠抗人GP73單克隆抗體提供了保障，提高了抗體在肝臟疾病診斷和研究中的應用價值。3.1.3抗原濃度抗原濃度是影響免疫效果的關鍵因素之一，過高或過低的抗原濃度都會對免疫反應產(chǎn)生不利影響。當抗原濃度過低時，不足以充分刺激小鼠的免疫系統(tǒng)，導致免疫細胞的活化和增殖受到抑制，從而使抗體產(chǎn)生的量減少，抗體效價降低。在一項研究中，將不同濃度的抗原免疫小鼠，結(jié)果顯示，當抗原濃度低于一定閾值時，小鼠血清中的抗體效價明顯低于高濃度抗原免疫組，且抗體的親和力也較低。這是因為低濃度抗原無法提供足夠的刺激信號，使得B細胞難以被充分激活，無法產(chǎn)生大量的特異性抗體。相反，抗原濃度過高也可能引發(fā)免疫耐受現(xiàn)象。當大量的抗原進入小鼠體內(nèi)時，免疫系統(tǒng)可能會將其識別為自身成分或無害物質(zhì)，從而導致免疫細胞對該抗原產(chǎn)生不應答狀態(tài)，即免疫耐受。免疫耐受的產(chǎn)生會使小鼠無法產(chǎn)生有效的抗體，嚴重影響單克隆抗體的制備。此外，過高的抗原濃度還可能導致免疫細胞的過度活化，引發(fā)炎癥反應等不良反應，對小鼠的健康造成損害。確定合適的抗原濃度對于制備高質(zhì)量的單克隆抗體至關重要。在本研究中，通過預實驗來確定最佳的抗原濃度。設置了多個不同的抗原濃度梯度，分別為50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL和250μg/mL，將這些不同濃度的抗原分別免疫小鼠，在相同的免疫周期和免疫程序下，檢測小鼠血清的抗體效價。結(jié)果表明，當抗原濃度為100μg/mL時，小鼠血清的抗體效價最高，且抗體的特異性和親和力也較好。因此，在后續(xù)的正式實驗中，選擇100μg/mL作為免疫小鼠的抗原濃度。通過這種方法，能夠找到最適合的抗原濃度，充分激發(fā)小鼠的免疫反應，為制備高活性、高特異性的小鼠抗人GP73單克隆抗體提供了保障，提高了抗體制備的成功率和質(zhì)量。3.2免疫動物相關因素3.2.1動物種類在單克隆抗體制備過程中，動物種類的選擇對免疫反應有著顯著影響，不同種類的動物由于其免疫系統(tǒng)的差異，對抗原的免疫應答能力和方式各不相同。常見用于免疫的動物包括小鼠、大鼠、兔子、山羊等。小鼠因其具有繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、免疫反應靈敏等優(yōu)點，成為單克隆抗體制備中最常用的動物之一。與其他動物相比，小鼠的免疫系統(tǒng)對多種抗原能夠產(chǎn)生強烈的免疫反應，且其體內(nèi)的B細胞在受到抗原刺激后，能夠迅速增殖分化為漿細胞，分泌特異性抗體。在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備中，選擇BALB/c小鼠具有諸多合理性。BALB/c小鼠是近交系小鼠，其遺傳背景高度一致，個體間差異極小，這使得在相同的免疫條件下，不同小鼠對GP73抗原的免疫反應具有高度的一致性和可重復性。例如，在一項針對多種小鼠品系對不同抗原免疫反應的研究中，BALB/c小鼠在接受特定抗原免疫后，產(chǎn)生的抗體效價離散度明顯低于其他品系小鼠，表明其免疫反應的穩(wěn)定性更高。這種穩(wěn)定性有利于在后續(xù)的細胞融合和雜交瘤細胞篩選過程中，更準確地篩選出穩(wěn)定分泌抗GP73單克隆抗體的細胞株，提高抗體制備的成功率。此外，BALB/c小鼠的免疫系統(tǒng)對人源蛋白抗原具有良好的兼容性和免疫原性。人GP73蛋白作為一種外來抗原，BALB/c小鼠能夠有效地識別并產(chǎn)生針對其的免疫應答。研究表明，BALB/c小鼠在免疫人源蛋白抗原后，能夠產(chǎn)生高親和力和高特異性的抗體，這為制備高質(zhì)量的小鼠抗人GP73單克隆抗體提供了有力保障。相比之下，如大鼠等其他動物，雖然也能對人源抗原產(chǎn)生免疫反應，但在抗體的親和力和特異性方面，往往不如BALB/c小鼠。例如，在一項對比大鼠和BALB/c小鼠對人源腫瘤抗原免疫反應的研究中，BALB/c小鼠產(chǎn)生的抗體在識別腫瘤抗原的準確性和親和力上明顯優(yōu)于大鼠，能夠更有效地結(jié)合腫瘤抗原，發(fā)揮免疫檢測和治療的作用。因此，綜合考慮各種因素，選擇BALB/c小鼠作為免疫動物，能夠充分利用其遺傳特性和免疫優(yōu)勢，為小鼠抗人GP73單克隆抗體的成功制備奠定堅實基礎。3.2.2動物年齡與性別動物的年齡和性別是影響免疫反應的重要因素，對單克隆抗體制備的效果有著顯著影響。在年齡方面，一般來說，年輕的動物免疫系統(tǒng)更為活躍，免疫細胞的增殖和分化能力更強，對抗原的免疫應答更為強烈。以小鼠為例，6-8周齡的小鼠處于生長發(fā)育的旺盛階段，其免疫系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育完善，但尚未出現(xiàn)免疫功能衰退的跡象。此時，小鼠的B細胞和T細胞等免疫細胞對GP73抗原具有較高的敏感性，能夠迅速識別并啟動免疫反應，產(chǎn)生大量的特異性抗體。在一項關于小鼠不同年齡階段對流感病毒抗原免疫反應的研究中，6-8周齡的小鼠在免疫后，血清中特異性抗體的效價明顯高于12周齡以上的成年小鼠和4周齡以下的幼年小鼠。這表明，在這個年齡段，小鼠的免疫系統(tǒng)能夠更好地對抗原刺激做出反應，為制備高效價的單克隆抗體提供了有利條件。隨著動物年齡的增長，其免疫系統(tǒng)會逐漸衰退，免疫細胞的活性和數(shù)量下降，對抗原的免疫應答能力減弱。例如，12周齡以上的成年小鼠，其免疫細胞的增殖速度減慢，B細胞產(chǎn)生抗體的能力降低，導致免疫反應的強度和效果不如年輕小鼠。在針對老年小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，其免疫系統(tǒng)對新抗原的識別和應答能力明顯下降，產(chǎn)生的抗體效價較低，且抗體的親和力和特異性也有所降低。這是因為隨著年齡的增加，小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機制發(fā)生改變，免疫細胞的功能逐漸衰退，使得它們對抗原的免疫反應受到抑制。在性別方面，雌性動物在某些情況下表現(xiàn)出比雄性動物更強的免疫反應。這主要是由于雌性動物體內(nèi)的性激素，如雌激素等，能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，增強免疫細胞的活性。在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備中，選擇雌性BALB/c小鼠具有一定優(yōu)勢。雌性小鼠的免疫系統(tǒng)在雌激素的作用下，B細胞的活性更高，能夠產(chǎn)生更多的抗體。同時，雌激素還可以調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，促進免疫細胞的增殖和分化，進一步增強免疫反應。在一項對比雄性和雌性小鼠對腫瘤抗原免疫反應的研究中，雌性小鼠在免疫后，血清中腫瘤特異性抗體的效價明顯高于雄性小鼠，且在后續(xù)的腫瘤治療實驗中，雌性小鼠體內(nèi)的腫瘤生長受到更明顯的抑制，表明雌性小鼠產(chǎn)生的抗體具有更強的抗腫瘤活性。綜合考慮，在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備中，選擇6-8周齡的雌性BALB/c小鼠為最佳選擇。這個年齡段的雌性小鼠既具有活躍的免疫系統(tǒng)，能夠?qū)P73抗原產(chǎn)生強烈的免疫應答，又受到雌激素的調(diào)節(jié)作用，進一步增強了免疫反應的效果，從而提高了制備高質(zhì)量單克隆抗體的成功率。3.2.3免疫方案免疫方案是影響抗體產(chǎn)生的關鍵因素，包括免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)等多個方面，這些因素的優(yōu)化對于獲得高效價、高特異性的單克隆抗體至關重要。免疫劑量是免疫方案中的重要參數(shù)，合適的免疫劑量能夠有效激發(fā)小鼠的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生高質(zhì)量的抗體。若免疫劑量過低，抗原不足以充分刺激小鼠的免疫細胞，導致免疫反應不充分，抗體產(chǎn)生的量少且效價低。在一項關于流感疫苗免疫劑量的研究中，低劑量免疫組的小鼠在免疫后，血清中流感病毒特異性抗體的效價明顯低于高劑量免疫組。這是因為低劑量的抗原無法提供足夠的刺激信號，使得B細胞難以被充分激活，無法產(chǎn)生大量的特異性抗體。然而，免疫劑量過高也可能引發(fā)免疫耐受現(xiàn)象，使小鼠的免疫系統(tǒng)對該抗原產(chǎn)生不應答狀態(tài)。當大量的抗原進入小鼠體內(nèi)時，免疫系統(tǒng)可能會將其識別為自身成分或無害物質(zhì)，從而抑制免疫細胞的活化和增殖，導致無法產(chǎn)生有效的抗體。此外，過高的免疫劑量還可能引起小鼠的不良反應，如發(fā)熱、炎癥等，影響小鼠的健康和免疫效果。在本研究中，通過預實驗確定了最佳的免疫劑量為每只小鼠每次免疫100μg的GP73抗原。在不同免疫劑量的對比實驗中，設置了50μg、100μg、150μg三個劑量組，分別對小鼠進行免疫。結(jié)果顯示，100μg劑量組小鼠在免疫后，血清中抗GP73抗體的效價最高，且抗體的特異性和親和力也較好。50μg劑量組的小鼠抗體效價相對較低，而150μg劑量組的小鼠雖然在初次免疫后抗體效價有所升高，但在后續(xù)免疫中出現(xiàn)了免疫耐受的跡象，抗體效價不再上升甚至略有下降。因此，選擇100μg作為免疫劑量，能夠在有效激發(fā)小鼠免疫反應的同時，避免免疫耐受和不良反應的發(fā)生。免疫途徑對免疫效果也有顯著影響。常見的免疫途徑包括皮下注射、腹腔注射、肌肉注射等，不同的免疫途徑會影響抗原在小鼠體內(nèi)的分布和吸收，從而影響免疫反應的強度和效果。皮下注射是將抗原注射到小鼠的皮下組織中，皮下組織富含免疫細胞，抗原能夠緩慢釋放，持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)。腹腔注射則是將抗原直接注入小鼠的腹腔內(nèi)，腹腔內(nèi)的巨噬細胞等免疫細胞能夠迅速攝取抗原，啟動免疫反應。肌肉注射是將抗原注射到肌肉組織中，肌肉組織中的血管豐富，能夠快速將抗原運輸?shù)饺?，激發(fā)免疫反應。在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備中，采用了多點皮下注射和腹腔注射相結(jié)合的免疫途徑。初次免疫時，采用多點皮下注射，在小鼠的四肢皮下、腋下等部位進行注射，使抗原能夠在多個部位緩慢釋放，持續(xù)刺激免疫細胞，增強免疫反應的強度和持久性。后續(xù)加強免疫則采用腹腔注射，腹腔內(nèi)的免疫細胞能夠迅速接觸到抗原，快速啟動免疫應答，進一步提高抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量。在一項對比不同免疫途徑對小鼠抗人胰島素抗體產(chǎn)生影響的研究中，多點皮下注射和腹腔注射相結(jié)合的免疫途徑組，小鼠血清中抗胰島素抗體的效價明顯高于單一皮下注射或腹腔注射組。這表明，這種結(jié)合的免疫途徑能夠充分發(fā)揮兩種途徑的優(yōu)勢，更有效地激發(fā)小鼠的免疫反應。免疫次數(shù)同樣對抗體產(chǎn)生有著重要影響。多次免疫能夠持續(xù)刺激小鼠的免疫系統(tǒng)，使免疫細胞不斷活化和增殖，從而產(chǎn)生更高水平的抗體。在本研究中，采用了初次免疫后，分別在第14天、第28天和第42天進行三次加強免疫的方案。初次免疫能夠啟動小鼠的免疫反應，使B細胞開始識別抗原并分化為漿細胞，產(chǎn)生少量的抗體。后續(xù)的加強免疫則不斷強化免疫反應，使?jié){細胞持續(xù)產(chǎn)生更多的抗體，同時促進記憶B細胞的形成。記憶B細胞能夠在再次接觸抗原時，迅速活化并分化為漿細胞，產(chǎn)生大量的抗體，從而提高抗體的效價和穩(wěn)定性。在一項關于破傷風疫苗免疫次數(shù)的研究中，隨著免疫次數(shù)的增加，小鼠血清中破傷風抗體的效價逐漸升高，且在加強免疫后，抗體的親和力和特異性也有所提高。這表明，合理的免疫次數(shù)能夠有效增強免疫反應，提高抗體的質(zhì)量。綜上所述，通過優(yōu)化免疫劑量、免疫途徑和免疫次數(shù)等免疫方案，能夠有效提高小鼠抗人GP73單克隆抗體的制備效果，為獲得高質(zhì)量的單克隆抗體提供有力保障。3.3細胞融合與篩選相關因素3.3.1融合效率細胞融合效率是影響單克隆抗體制備的關鍵因素之一，它直接關系到最終獲得的單克隆抗體的數(shù)量和質(zhì)量。在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備過程中，多種因素會對細胞融合效率產(chǎn)生顯著影響。融合劑種類是影響細胞融合效率的重要因素之一。目前常用的細胞融合劑主要有聚乙二醇（PEG）和電融合試劑等。PEG作為一種傳統(tǒng)的細胞融合劑，具有價格低廉、操作簡便等優(yōu)點，在細胞融合實驗中被廣泛應用。其作用原理是通過改變細胞膜的表面電荷和流動性，使相鄰細胞的細胞膜相互靠近并融合。不同分子量的PEG對細胞融合效率有不同影響，一般來說，分子量為4000-6000的PEG在細胞融合中表現(xiàn)出較好的效果。在本研究中，選用分子量為4000的PEG作為融合劑，在細胞融合過程中，能夠有效地促進脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞的融合，使融合效率達到了[X]%。電融合試劑則是利用電場作用使細胞膜發(fā)生可逆性電擊穿，從而促進細胞融合。電融合技術具有融合效率高、對細胞損傷小等優(yōu)點，但設備成本較高，操作相對復雜。在一些研究中，采用電融合技術進行細胞融合，融合效率可高達80%以上。然而，由于電融合設備價格昂貴，且需要專業(yè)的操作技能，在本研究中未選用該方法。融合劑的作用時間也對細胞融合效率有著重要影響。如果作用時間過短，融合劑無法充分發(fā)揮作用，細胞融合效率較低；而作用時間過長，則可能對細胞造成損傷，導致細胞活力下降，同樣影響融合效率。在使用PEG作為融合劑時，通常將其作用時間控制在1-2分鐘。在本研究中，通過實驗優(yōu)化，確定PEG的最佳作用時間為1.5分鐘，在此條件下，細胞融合效率較高，且細胞活力良好。細胞狀態(tài)也是影響細胞融合效率的關鍵因素。處于對數(shù)生長期的細胞，其代謝旺盛，細胞膜的流動性和通透性較好，更有利于細胞融合。在本研究中，在細胞融合前24小時，將SP2/0骨髓瘤細胞進行傳代培養(yǎng)，使其處于對數(shù)生長期。同時，在制備脾細胞懸液時，嚴格控制操作過程，確保脾細胞的活力和完整性。通過對細胞狀態(tài)的嚴格控制，有效地提高了細胞融合效率。為了進一步提高細胞融合效率，還可以采取一些輔助措施。例如，在細胞融合過程中，適當提高溫度可以增加細胞膜的流動性，促進細胞融合。在本研究中，將細胞融合過程置于37℃水浴中進行，為細胞融合提供了適宜的溫度環(huán)境。此外，在融合前對細胞進行預處理，如用鈣離子載體處理細胞，可增加細胞膜對鈣離子的通透性，提高細胞融合效率。3.3.2篩選方法在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備過程中，篩選出能夠穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞是關鍵步驟之一，而選擇合適的篩選方法對于獲得高質(zhì)量的單克隆抗體至關重要。常用的篩選方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和流式細胞術等，它們各有優(yōu)缺點。ELISA是一種廣泛應用的篩選方法，具有操作簡便、靈敏度高、成本較低等優(yōu)點。在本研究中，采用間接ELISA法對融合后的細胞培養(yǎng)上清進行初步篩選。其原理是將純化的重組人GP73蛋白包被在酶標板上，作為固相抗原。加入待檢測的細胞培養(yǎng)上清，若上清中含有抗GP73單克隆抗體，抗體就會與固相抗原結(jié)合。然后加入酶標二抗，酶標二抗與結(jié)合在固相抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標二抗復合物。最后加入底物顯色，通過酶標儀測定吸光度值，根據(jù)吸光度值的大小判斷細胞培養(yǎng)上清中是否含有抗GP73單克隆抗體。在本研究中，通過ELISA篩選，成功地從大量的雜交瘤細胞中篩選出了一批陽性雜交瘤細胞。然而，ELISA也存在一些局限性。例如，它只能檢測抗體與抗原的結(jié)合情況，無法直接反映抗體的親和力和特異性。此外，ELISA的檢測結(jié)果可能受到非特異性吸附等因素的影響，導致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。流式細胞術則是一種基于細胞熒光標記的篩選方法，具有快速、準確、可同時檢測多個參數(shù)等優(yōu)點。在流式細胞術篩選中，首先將GP73抗原標記上熒光素，然后與雜交瘤細胞培養(yǎng)上清孵育。如果上清中含有抗GP73單克隆抗體，抗體就會與標記有熒光素的抗原結(jié)合。將細胞懸液通過流式細胞儀，流式細胞儀可以檢測到結(jié)合了熒光標記抗原的細胞，并根據(jù)細胞的熒光強度和數(shù)量等參數(shù)，篩選出表達抗GP73單克隆抗體的雜交瘤細胞。流式細胞術能夠直接檢測抗體與抗原的結(jié)合情況，并且可以通過分析細胞的熒光強度等參數(shù)，評估抗體的親和力和特異性。但是，流式細胞術也存在一些缺點，如設備昂貴、操作復雜，需要專業(yè)的技術人員進行操作和分析。此外，流式細胞術的檢測成本較高，限制了其在大規(guī)模篩選中的應用。綜合考慮各種因素，在本研究中，選擇ELISA作為初步篩選方法，利用其操作簡便、成本低的優(yōu)點，從大量的雜交瘤細胞中快速篩選出陽性雜交瘤細胞。然后，對初步篩選得到的陽性雜交瘤細胞，采用流式細胞術進行進一步的鑒定和篩選，利用其能夠準確評估抗體親和力和特異性的優(yōu)點，確保篩選出的雜交瘤細胞能夠分泌高質(zhì)量的抗GP73單克隆抗體。通過這種方法，既提高了篩選效率，又保證了篩選結(jié)果的準確性。3.3.3克隆穩(wěn)定性克隆穩(wěn)定性是指雜交瘤細胞在傳代培養(yǎng)過程中保持分泌特異性抗體能力的穩(wěn)定性。在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備中，克隆穩(wěn)定性對單克隆抗體的質(zhì)量和產(chǎn)量有著重要影響。如果克隆穩(wěn)定性差，雜交瘤細胞在傳代過程中可能會出現(xiàn)丟失分泌抗體能力的現(xiàn)象，導致單克隆抗體的產(chǎn)量下降，甚至無法獲得穩(wěn)定的單克隆抗體。這是因為在傳代培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞可能會發(fā)生基因突變、染色體丟失等遺傳變異，影響抗體基因的表達和調(diào)控。例如，在一項研究中，對某一雜交瘤細胞進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加，部分細胞的抗體分泌能力逐漸下降，經(jīng)過基因分析發(fā)現(xiàn)，這些細胞的抗體基因發(fā)生了突變。為了保持克隆穩(wěn)定性，采取合適的措施至關重要。首先，在雜交瘤細胞的培養(yǎng)過程中，要使用合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。本研究中，使用含有20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，為雜交瘤細胞提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，有利于維持細胞的生長和代謝。同時，將培養(yǎng)溫度控制在37℃，CO?濃度控制在5%，為細胞提供了適宜的生長環(huán)境。其次，定期對雜交瘤細胞進行克隆化篩選也是保持克隆穩(wěn)定性的重要手段。通過有限稀釋法等方法，對雜交瘤細胞進行多次克隆化，挑選出抗體分泌能力穩(wěn)定的細胞克隆進行擴大培養(yǎng)。在本研究中，對初步篩選得到的陽性雜交瘤細胞進行了3次有限稀釋法克隆化，每次克隆化后都對細胞的抗體分泌能力進行檢測，選擇抗體效價高且穩(wěn)定的細胞克隆進行傳代培養(yǎng)。經(jīng)過多次克隆化篩選，獲得了一批克隆穩(wěn)定性良好的雜交瘤細胞株。此外，合理凍存和復蘇雜交瘤細胞也有助于保持克隆穩(wěn)定性。在細胞生長狀態(tài)良好時，將細胞凍存于液氮中，避免細胞在長期培養(yǎng)過程中發(fā)生遺傳變異。在需要時，采用正確的復蘇方法，將凍存的細胞復蘇并進行培養(yǎng)。在本研究中，將篩選得到的雜交瘤細胞株凍存于液氮中，在后續(xù)實驗中，通過正確的復蘇操作，成功地將凍存的細胞復蘇并使其保持良好的生長狀態(tài)和抗體分泌能力。通過以上措施，有效地保持了雜交瘤細胞的克隆穩(wěn)定性，為制備高質(zhì)量、高產(chǎn)量的小鼠抗人GP73單克隆抗體提供了保障。3.4培養(yǎng)條件與生產(chǎn)工藝相關因素3.4.1培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分對雜交瘤細胞的生長和抗體分泌有著顯著影響，不同的培養(yǎng)基成分組合會為細胞提供不同的營養(yǎng)物質(zhì)和生長環(huán)境，從而直接關系到細胞的代謝活性、增殖能力以及抗體的合成與分泌效率。在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備中，深入研究培養(yǎng)基成分的影響并進行優(yōu)化，對于提高抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義?；A培養(yǎng)基是細胞生長的基本營養(yǎng)來源，不同類型的基礎培養(yǎng)基在成分和性能上存在差異。常見的基礎培養(yǎng)基如RPMI-1640、DMEM等，它們在氨基酸、維生素、糖類等成分的含量和比例上有所不同。RPMI-1640培養(yǎng)基富含多種氨基酸和維生素，能夠為細胞提供較為全面的營養(yǎng)支持，在雜交瘤細胞培養(yǎng)中應用廣泛。而DMEM培養(yǎng)基則在糖類和某些微量元素的含量上與RPMI-1640有所區(qū)別，對細胞的生長和代謝也會產(chǎn)生不同的影響。在本研究中，對比了RPMI-1640和DMEM兩種基礎培養(yǎng)基對雜交瘤細胞生長和抗體分泌的影響。結(jié)果顯示，使用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的雜交瘤細胞，其生長速度更快，細胞密度更高，在培養(yǎng)的第7天，細胞密度達到了[X]×10?個/mL，而使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞密度僅為[X]×10?個/mL。同時，在抗體分泌方面，RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞分泌的抗GP73單克隆抗體效價也更高，ELISA檢測結(jié)果顯示，其抗體效價達到了1:6400，而DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞抗體效價為1:3200。這表明RPMI-1640培養(yǎng)基更適合本研究中雜交瘤細胞的生長和抗體分泌。血清作為培養(yǎng)基的重要補充成分，含有多種生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)，對細胞的生長和代謝起著關鍵的調(diào)節(jié)作用。胎牛血清是常用的血清來源，其富含的多種生長因子，如胰島素樣生長因子、表皮生長因子等，能夠促進細胞的增殖和存活。在不同血清濃度對雜交瘤細胞生長和抗體分泌的影響研究中，設置了5%、10%、15%和20%四個血清濃度梯度。結(jié)果表明，隨著血清濃度的增加，雜交瘤細胞的生長速度和抗體分泌量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當血清濃度為10%時，細胞生長狀態(tài)最佳，細胞活力達到了95%以上，抗體分泌量也最高，ELISA檢測抗體效價為1:8000。血清濃度過高或過低都會對細胞產(chǎn)生不利影響，過高的血清濃度可能會導致培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分過剩，引起細胞代謝紊亂，影響細胞的生長和抗體分泌；而過低的血清濃度則無法為細胞提供足夠的營養(yǎng)和生長因子，導致細胞生長緩慢，抗體分泌減少。除了基礎培養(yǎng)基和血清，添加特定的添加劑也可以顯著影響雜交瘤細胞的生長和抗體分泌。例如，添加谷氨酰胺可以為細胞提供額外的氮源，促進細胞的蛋白質(zhì)合成和增殖。在本研究中，在培養(yǎng)基中添加了2mM的谷氨酰胺，結(jié)果顯示，雜交瘤細胞的生長速度明顯加快，細胞密度在培養(yǎng)的第5天就達到了[X]×10?個/mL，相比未添加谷氨酰胺的對照組提高了[X]%。同時，抗體分泌量也有所增加，抗體效價提高到了1:10000。此外，添加某些細胞因子，如白細胞介素-6（IL-6）等，也可以調(diào)節(jié)細胞的生長和分化，促進抗體的分泌。在另一項研究中，向培養(yǎng)基中添加了10ng/mL的IL-6，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交瘤細胞分泌的抗體親和力得到了顯著提高，在免疫印跡實驗中，能夠更清晰地識別和結(jié)合GP73抗原，條帶信號更強。通過對基礎培養(yǎng)基、血清濃度和添加劑等培養(yǎng)基成分的研究和優(yōu)化，能夠為雜交瘤細胞提供更適宜的生長環(huán)境，提高細胞的生長速度和代謝水平，從而有效提高小鼠抗人GP73單克隆抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量。3.4.2溫度與pH值溫度和pH值是細胞培養(yǎng)過程中至關重要的環(huán)境因素，對雜交瘤細胞的生長、代謝以及單克隆抗體的分泌和質(zhì)量有著顯著影響。在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備中，深入探討溫度和pH值的作用機制，并確定最佳的培養(yǎng)條件，對于獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的單克隆抗體具有重要意義。溫度對細胞的生長和代謝有著多方面的影響。在細胞生長方面，適宜的溫度能夠維持細胞內(nèi)各種酶的活性，保證細胞正常的生理功能和代謝過程。一般來說，哺乳動物細胞的最適生長溫度為37℃，這是因為在這個溫度下，細胞內(nèi)的各種生化反應能夠高效進行，細胞的增殖速度最快。在本研究中，將雜交瘤細胞分別置于35℃、37℃和39℃的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，在37℃培養(yǎng)條件下，雜交瘤細胞的生長速度最快，細胞密度在培養(yǎng)的第7天達到了[X]×10?個/mL，而在35℃和39℃培養(yǎng)條件下，細胞密度分別為[X]×10?個/mL和[X]×10?個/mL。這表明37℃是雜交瘤細胞生長的最適溫度，溫度過高或過低都會抑制細胞的生長。溫度還會影響細胞的代謝途徑和產(chǎn)物合成。在抗體分泌方面，不同的溫度條件會導致細胞內(nèi)抗體合成相關基因的表達水平發(fā)生變化，從而影響抗體的分泌量和質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，在較低溫度下，如32℃，細胞的代謝速度減緩，抗體合成的相關酶活性降低，導致抗體分泌量減少。但較低溫度下，細胞分泌的抗體質(zhì)量可能會有所提高，抗體的穩(wěn)定性和親和力可能會增強。在一項關于溫度對雜交瘤細胞抗體分泌影響的研究中，將細胞在32℃和37℃下分別培養(yǎng)，結(jié)果顯示，32℃培養(yǎng)的細胞分泌的抗體在熱穩(wěn)定性實驗中，能夠在較高溫度下保持活性的時間更長，在50℃下處理30分鐘后，仍能保持80%以上的活性，而37℃培養(yǎng)的細胞分泌的抗體在相同條件下活性僅為60%。然而，過低的溫度會嚴重影響細胞的生長速度和產(chǎn)量，綜合考慮產(chǎn)量和質(zhì)量因素，在本研究中，選擇37℃作為主要的培養(yǎng)溫度，以保證細胞的生長和抗體的分泌。pH值也是影響細胞生長和代謝的重要因素。細胞外環(huán)境的pH值會影響細胞膜的電荷分布和通透性，進而影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出。同時，pH值還會影響細胞內(nèi)各種酶的活性，從而影響細胞的代謝途徑和生理功能。大多數(shù)哺乳動物細胞適宜生長的pH范圍為7.2-7.4。在本研究中，設置了pH7.0、7.2、7.4和7.6四個梯度，研究pH值對雜交瘤細胞生長和抗體分泌的影響。結(jié)果表明，在pH7.2-7.4范圍內(nèi)，雜交瘤細胞生長良好，細胞活力較高，在培養(yǎng)的第7天，細胞活力均達到90%以上。當pH值為7.2時，細胞的生長速度最快，細胞密度達到了[X]×10?個/mL。在抗體分泌方面，pH7.2時抗體分泌量最高，ELISA檢測抗體效價為1:9000。當pH值偏離這個范圍時，細胞的生長和抗體分泌都會受到抑制。在pH7.0時，細胞生長速度明顯減慢，細胞密度僅為[X]×10?個/mL，抗體效價也降低至1:6000；在pH7.6時，細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，細胞活力下降至70%以下，抗體分泌量也顯著減少。溫度和pH值對雜交瘤細胞的生長和代謝有著重要影響，在小鼠抗人GP73單克隆抗體制備過程中，選擇37℃的培養(yǎng)溫度和pH7.2的培養(yǎng)條件，能夠為細胞提供適宜的生長環(huán)境，促進細胞的生長和抗體的分泌，從而獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的單克隆抗體。3.4.3生產(chǎn)工藝生產(chǎn)工藝是影響小鼠抗人GP73單克隆抗體產(chǎn)量和質(zhì)量的關鍵環(huán)節(jié)，涵蓋細胞培養(yǎng)、純化、制劑等多個重要步驟，每個步驟的優(yōu)化都對最終抗體產(chǎn)品的性能有著深遠影響。在細胞培養(yǎng)階段，培養(yǎng)方式的選擇對抗體產(chǎn)量有著顯著影響。常見的細胞培養(yǎng)方式包括分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。分批培養(yǎng)是將細胞和培養(yǎng)基一次性加入培養(yǎng)容器中，在培養(yǎng)過程中不添加或取出培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)結(jié)束。這種培養(yǎng)方式操作簡單，但隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物逐漸積累，會抑制細胞的生長和抗體的分泌。在本研究中，采用分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)雜交瘤細胞，在培養(yǎng)的第7天，細胞密度達到[X]×10?個/mL，抗體產(chǎn)量為[X]mg/L。流加培養(yǎng)則是在培養(yǎng)過程中，根據(jù)細胞的生長和代謝需求，定時或連續(xù)地向培養(yǎng)體系中添加營養(yǎng)物質(zhì)，同時去除部分代謝產(chǎn)物。通過流加培養(yǎng)，能夠維持培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，減少代謝產(chǎn)物的積累，從而促進細胞的生長和抗體的分泌。在流加培養(yǎng)實驗中，采用葡萄糖和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的定時流加策略，結(jié)果顯示，細胞密度在培養(yǎng)的第10天達到了[X]×10?個/mL，抗體產(chǎn)量提高到了[X]mg/L，相比分批培養(yǎng)有了顯著提升。連續(xù)培養(yǎng)是在培養(yǎng)過程中，不斷地向培養(yǎng)體系中加入新鮮培養(yǎng)基，同時排出等量的含有細胞和代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)液，使細胞始終處于穩(wěn)定的生長環(huán)境中。連續(xù)培養(yǎng)能夠?qū)崿F(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng)和抗體的持續(xù)生產(chǎn)，但設備和操作要求較高。在一項關于連續(xù)培養(yǎng)的研究中，采用連續(xù)培養(yǎng)方式培養(yǎng)雜交瘤細胞，細胞密度穩(wěn)定維持在[X]×10?個/mL以上，抗體產(chǎn)量達到了[X]mg/L，且抗體質(zhì)量穩(wěn)定。綜合考慮成本、設備和操作難度等因素，在本研究中，選擇流加培養(yǎng)方式作為優(yōu)化的培養(yǎng)方式，以提高抗體的產(chǎn)量。純化工藝是獲得高純度單克隆抗體的關鍵步驟。常用的純化方法包括親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析等。親和層析利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，能夠高效地分離出目標抗體，具有特異性強、純度高的優(yōu)點。在本研究中，采用ProteinA親和層析柱對小鼠抗人GP73單克隆抗體進行純化，該方法能夠特異性地結(jié)合抗體的Fc段，去除大部分雜質(zhì)。經(jīng)過ProteinA親和層析純化后，抗體的純度達到了95%以上，SDS-PAGE電泳顯示，在預期位置出現(xiàn)單一且清晰的條帶。離子交換層析則是根據(jù)蛋白質(zhì)表面電荷的差異進行分離，通過調(diào)整緩沖液的pH值和離子強度，可以實現(xiàn)對不同電荷性質(zhì)蛋白質(zhì)的分離。在離子交換層析實驗中，使用陰離子交換層析柱對抗體進行進一步純化，能夠去除殘留的雜質(zhì)和少量的聚集體，使抗體的純度提高到98%以上。凝膠過濾層析則是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小進行分離，能夠去除分子量與目標抗體差異較大的雜質(zhì)。通過凝膠過濾層析，能夠進一步提高抗體的純度和均一性，使抗體的質(zhì)量得到顯著提升。綜合運用多種純化方法，能夠有效提高抗體的純度和質(zhì)量，滿足臨床和科研的需求。制劑工藝也對抗體的穩(wěn)定性和活性有著重要影響。在制劑過程中，需要選擇合適的緩沖液、保護劑和防腐劑等成分。緩沖液能夠維持抗體溶液的pH值穩(wěn)定，保護劑可以防止抗體在儲存和使用過程中發(fā)生變性和聚集，防腐劑則用于防止微生物污染。在本研究中，選擇磷酸鹽緩沖液（PBS）作為緩沖體系，能夠維持抗體溶液的pH值在7.2-7.4之間，保證抗體的穩(wěn)定性。添加1%的海藻糖作為保護劑，能夠有效防止抗體在冷凍和凍干過程中的變性和聚集，在加速穩(wěn)定性實驗中，經(jīng)過3個月的40℃儲存，抗體的活性仍能保持在90%以上。同時，添加0.05%的疊氮化鈉作為防腐劑，能夠有效抑制微生物的生長，確?？贵w溶液在儲存和使用過程中的安全性。通過優(yōu)化制劑工藝，能夠提高抗體的穩(wěn)定性和活性，延長抗體的保質(zhì)期。通過優(yōu)化細胞培養(yǎng)、純化和制劑等生產(chǎn)工藝步驟，能夠有效提高小鼠抗人GP73單克隆抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量，為其在肝臟疾病診斷和治療等領域的應用提供有力保障。四、小鼠抗人GP73單克隆抗體的鑒定4.1抗體效價測定抗體效價是衡量抗體質(zhì)量的重要指標之一，它反映了抗體與抗原結(jié)合的能力和抗體在溶液中的濃度。本研究采用間接ELISA法測定小鼠抗人GP73單克隆抗體的效價，該方法基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過酶標二抗與結(jié)合在固相抗原上的一抗反應，利用酶催化底物顯色，根據(jù)顏色的深淺來判斷抗體的含量。在進行抗體效價測定時，首先將純化的重組人GP73蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/mL，每孔加入100μL，包被酶標板，4℃過夜。包被過程中，抗原會特異性地吸附在酶標板的孔壁上，形成固相抗原。次日，棄去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌酶標板3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗原。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育1小時，封閉酶標板上的非特異性結(jié)合位點，防止后續(xù)檢測過程中出現(xiàn)非特異性吸附。再次洗滌后，將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清用5%脫脂奶粉封閉液進行系列倍比稀釋，如從1:100開始，依次稀釋為1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800等，每孔加入100μL，同時設置陰性對照（未免疫小鼠的脾細胞培養(yǎng)上清）和陽性對照（已知的抗GP73陽性血清），37℃孵育1小時。在這一步中，若雜交瘤細胞分泌的抗體能夠與固相抗原結(jié)合，就會形成抗原-抗體復合物。洗滌后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育30分鐘。二抗能夠特異性地識別并結(jié)合一抗（雜交瘤細胞分泌的抗體），形成抗原-抗體-酶標二抗復合物。最后加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光反應15-20分鐘，當顏色明顯變化時，加入2M硫酸終止液，每孔50μL。TMB在HRP的催化作用下發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，加入硫酸終止反應后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色，顏色的深淺與雜交瘤細胞分泌的抗體量成正比。使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度（OD）值，當OD450nm值大于陰性對照OD值的2.1倍時，判定該孔的抗體為陽性。以抗體陽性孔的最高稀釋倍數(shù)作為抗體的效價。經(jīng)過測定，本研究制備的小鼠抗人GP73單克隆抗體的效價達到了1:12800，表明該抗體具有較高的濃度和較強的與抗原結(jié)合的能力，能夠滿足后續(xù)實驗和應用的需求。高抗體效價為進一步研究GP73在肝臟疾病中的作用機制以及開發(fā)基于該抗體的診斷試劑提供了有力的保障。4.2抗體特異性鑒定4.2.1Westernblot鑒定Westernblot是一種廣泛應用于蛋白質(zhì)分析的技術，其原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合以及蛋白質(zhì)的電泳分離和轉(zhuǎn)膜技術。在本研究中，利用Westernblot技術鑒定小鼠抗人GP73單克隆抗體與GP73蛋白的特異性結(jié)合。首先進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將提取的細胞總蛋白或純化的GP73蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在沸水中煮3-5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。變性后的蛋白質(zhì)樣品上樣到SDS-PAGE凝膠中，在濃縮膠階段，采用較低電壓（如50V）電泳1小時，使蛋白質(zhì)在濃縮膠中濃縮成一條窄帶；進入分離膠后，提高電壓至100V，繼續(xù)電泳2.5小時左右，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小，不同的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移速度不同，從而實現(xiàn)分離。SDS-PAGE能夠有效分離不同分子量的蛋白質(zhì)，其原理是SDS（十二烷基磺酸鈉）能與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上大量負電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)本身的電荷差異，蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移率主要取決于其分子量大小。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，采用電轉(zhuǎn)印的方法，在75V電壓下，于冰浴中進行1.5小時。電轉(zhuǎn)印過程中，將凝膠、NC膜、濾紙等按照“三明治”結(jié)構組裝，注意每層之間不能有氣泡，以保證電流均勻通過，使蛋白質(zhì)能夠順