T-WEBIO 0003-2024 人源腫瘤組織活性凍存與復蘇技術(shù)規(guī)范

ICS07.080CCSC04TechnicalspecificationforactivecryopreservationandresuscitationofhumantumorIT/WEBIO0003—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由武漢大學提出。本文件由武漢東湖國家自主創(chuàng)新示范區(qū)生物醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會歸口。本文件起草單位：武漢大學、中國典型培養(yǎng)物保藏中心、武漢賽爾朗靈科技有限公司、武漢大學細胞資源庫、中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所、天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤生物樣本庫、浙江省腫瘤醫(yī)院生物樣本庫、華中科技大學同濟醫(yī)學院、華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院、華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院、武漢兒童醫(yī)院、武漢大學人民醫(yī)院、武漢亞洲心臟病醫(yī)院、湖南省腫瘤醫(yī)院、中南大學湘雅醫(yī)院、中南大學湘雅二醫(yī)院、中南大學湘雅三醫(yī)院、中南大學湘雅口腔醫(yī)學院、復旦大學附屬華山醫(yī)院、陸軍軍醫(yī)大學西南醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院、南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院、湖北省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院、武漢市臨床檢驗中心、武漢市標準化研究院。本文件主要起草人：沈超、劉玉琴、李繼新、王前進、劉霞、吳婕、楊媚媚、何靜、夏司璇、王昱東、熊君、廖聰、李南、周彩虹、李海欣、鄭智國、宇興江、胡志全、楊春光、姜曉兵、章小平、李俊俊、肖晗、吳業(yè)帆、宋啟斌、任海波、何正文、申竑、周恩相、黃菊芳、梁青春、王龍、鄧智元、何雨鳴、陳向軍、馮華、李飛、賈英、任婕、楊斌、李玲、龔潔、黃勇、任雯菁。1T/WEBIO0003—2024人源腫瘤組織活性凍存與復蘇技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了人源腫瘤組織活性凍存的取樣標準、凍存前預處理、深低溫保存、復蘇培養(yǎng)及質(zhì)量檢測的操作程序和一般原則。本文件適用于科研用人源腫瘤組織的活性凍存與復蘇。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T38736-2020人類生物樣本保藏倫理要求GB/T39767-2021人類生物樣本管理規(guī)范GB/T40352.1-2021人類組織樣本采集與處理國衛(wèi)科教發(fā)〔2023〕4號涉及人的生命科學和醫(yī)學研究倫理審查辦法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1組織活性凍存activecryopreservationoftissue將臨床取得的腫瘤組織，經(jīng)過適當?shù)奶幚砗筮M行超低溫保存，且活性凍存的腫瘤組織復蘇后，能分離提取具有活性的原代細胞并傳代。3.2原代細胞primarycell直接從組織中分離培養(yǎng)的細胞，傳代次數(shù)不超過10代。3.3完全培養(yǎng)基completemedium通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清、必要的生長因子等添加劑等物質(zhì)制備而成。4縮略語下列縮略語適用于本文件。PBS：磷酸緩沖液5組織活性凍存5.1組織樣本收集與運輸5.1.1組織樣本的收集、處理應遵循《涉及人的生命科學和醫(yī)學研究倫理審查辦法》和GB/T40352.1-2021的規(guī)定。5.1.2組織樣本的保藏應遵循GB/T38736-2020和GB/T39767-2021的規(guī)定。5.1.3組織樣本采集前應通過倫理委員會審批，具備捐贈者或代理人簽署的《知情同意書》。5.1.4組織樣本采集過程中，直接接觸樣本的所有材料應滿足無菌要求。5.1.5組織取樣的要求，在手術(shù)可控范圍能獲取含腫瘤核心區(qū)和邊緣區(qū)的組織。獲取的組織塊，應在清除表面血塊、壞死組織、脂肪和結(jié)締組織后，推薦剪切至不小于0.5cm×0.5cm×0.5cm組織塊放入保存液內(nèi)。2T/WEBIO0003—20245.1.6所取組織應盡量在4-6h內(nèi)進行組織預處理，盡快經(jīng)程序性降溫后放入液氮凍存；若不能及時進行預處理和凍存，應將所取標本于2℃-8℃臨時存放并運輸。離體組織的臨時保存和運輸時間應不超過24h。組織預處理及質(zhì)控需在無菌環(huán)境中進行。5.1.7組織樣本信息采集，在采樣管（袋）上標記取樣信息，并記錄其他必要信息，包括但不限于捐贈者編號、性別、年齡、疾病名稱、取材部位病理診斷等，具體表格可參見附錄A，以備后續(xù)查詢。組織樣本信息管理應在符合《中華人民共和國生物安全法》《國家人類遺傳資源管理條例實施細則》等法律法規(guī)的前提下，進行統(tǒng)一管理。5.2組織預處理5.2.1組織清洗將組織從采樣管（袋）中取出置于培養(yǎng)皿中，依次用表面清洗劑1次、PBS緩沖液清洗2次，每次清洗1min。5.2.2組織剪切將清洗后組織移入新的培養(yǎng)皿中，用眼科剪把組織充分剪碎至顆粒狀，最終組織顆粒大小以小于1mm為佳，操作過程中適當?shù)渭由倭縋BS（0.01mol/L、PH7.2-7.4）保持組織濕潤。5.3組織凍存5.3.1加凍存液將剪碎的組織轉(zhuǎn)入離心管中，1000r/min離心5min，去除上清后按組織體積的4倍加入組織凍存液混勻，制備成組織碎片懸液。5.3.2凍存管分裝將上述組織碎片懸液分裝不少于3管，每支凍存管加入1mL組織碎片懸液，并在管身做好標記。標記規(guī)則的設(shè)定應能在樣本庫內(nèi)有效分辨不同地方來源、腫瘤類型等。5.3.3程序降溫和液氮保存將分裝好的組織碎片懸液凍存管放入程序降溫盒，-80℃冰箱中冷凍8-16h，轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期儲存。6質(zhì)量控制與評估6.1組織活性凍存質(zhì)量控制6.1.1組織復溫取凍存組織置于37℃水浴鍋加熱3-5min至完全融化，用復蘇液漂洗1次，1000r/min離心5min收集組織沉淀。6.1.2組織消化用移液管取20mL消化液37℃消化1-3h，顯微鏡下觀察，當大于50%的組織塊分散為細胞及細胞團時，終止消化，用70μm細胞篩過濾收集細胞懸液，1000r/min離心10min收集細胞沉淀。6.1.3去除紅細胞加入紅細胞裂解液，室溫下輕柔上下顛倒混合裂解，1000r/min離心10min收集細胞沉淀；加入5mLpH值為7.2-7.4的磷酸緩沖液（PBS），用PBS漂洗2次，再次離心收集細胞沉淀。6.1.4接種培養(yǎng)將步驟6.1.3所得細胞沉淀，用原代細胞完全培養(yǎng)基重懸后，接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。6.1.5原代細胞增殖能力3T/WEBIO0003—2024將組織復蘇提取細胞進行培養(yǎng)，首次滿瓶時間不超過2周的樣本可加入原代細胞種子庫，滿瓶時間超過2周的樣本建議舍棄并進行無害化處理。納入原代細胞種子庫的細胞樣本，應進行支原體、STR等檢測。6.1.6原代細胞存活率細胞存活率可采用臺盼藍拒染法，不適用該方法的樣本可采用AO/PI等方法，通過手動計數(shù)或自動細胞計數(shù)儀進行檢測。手動計數(shù)檢測細胞存活率宜參考附錄B，自動計數(shù)儀檢測細胞存活率宜依據(jù)儀器檢測說明書進行。組織復蘇后提取的細胞存活率應不低于60%。7安全與防護7.1應具備完善的實驗室安全管理制度，同時對工作人員應進行嚴格的安全培訓，培訓內(nèi)容應包括生物安全二級實驗室操作規(guī)范、人員操作安全等。7.2應建立完整的實驗室設(shè)備使用和操作規(guī)程，保證設(shè)備安全運行。7.3廢棄物的處理7.3.1操作流程中產(chǎn)生的廢棄物應進行無害化處理。7.3.2樣本的銷毀應進行信息登記，包括但不限于樣本編號、銷毀原因、批準和執(zhí)行銷毀的日期、銷毀的操作人員等。4T/WEBIO0003—2024（資料性）樣本信息表供體樣本信息表見表A.1（*為必填項）。表A.1樣本信息表疾病診斷開始日期是否仍存在結(jié)束日期□1.手術(shù)組織□2.穿刺組織□3.其他5T/WEBIO0003—2024細胞存活率計算方法B.1操作步驟細胞存活率就是活細胞的比例，可用臺盼藍拒染法或AO/PI染色方法計數(shù)活細胞。B.1.1臺盼藍拒染法操作步驟如下：a)加5mL培養(yǎng)基徹底混合細胞懸液。b)直接用臺盼藍溶液稀釋樣本。例如：取20μL細胞懸液加入80μL臺盼藍溶液中，稀釋5倍。渦懸振蕩，混合稀釋的細胞樣本。c)計數(shù)器的準備：首先用酒精清潔其小室和蓋玻片，然后用脫脂棉擦干。仔細地將蓋玻片覆蓋兩個小室。d)用微量移液器吸取10μL稀釋的樣本充滿兩個小室，不要過滿或不足。e)計數(shù)4個大方格中的細胞總數(shù)（1mm×1mm×0.1mm）。死細胞染成藍色的死細胞（因為細胞完整性破壞而吸收臺盼藍），活細胞透明有折光（未染色）。B.1.2AO/PI染色方法操作步驟如下：a)準備細胞樣本：從培養(yǎng)物中收獲細胞，使用離心機收集細胞，然后用PBS（磷酸鹽緩沖液）重懸細胞。b)配置染色液：準備10xAO/PI染色液。通常使用吖啶橙和碘化丙啶的混合液，濃度可以根據(jù)具體試劑盒的說明進行調(diào)整。c)染色過程：將10μL細胞懸液與2μL染色液混合