中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化的系列研究

中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化的系列研究南方醫(yī)科大學賈鈺華主要內(nèi)容一、動物模型二、研究內(nèi)容三、研究方法四、研究結(jié)果五、展望前景前言動脈粥樣硬化（AS）是主要發(fā)生在全身大、中彈力血管處的慢性病變（粥樣斑塊）。AS與多種因素密切相關(guān)，其中脂質(zhì)代謝異常、血管內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、病理性血管生成都是誘發(fā)AS的中心環(huán)節(jié)。血液流變學異常、血小板活化及血管內(nèi)皮損傷是AS血的重要生物學表現(xiàn)。AS斑塊是痰濁與血瘀凝結(jié)的結(jié)果。一、動脈粥樣硬化斑塊動物模型1.國家有關(guān)醫(yī)學實驗動物管理的有關(guān)法規(guī)是證候模型研究中動物選擇的基本依據(jù)?，F(xiàn)代醫(yī)學動物實驗學有關(guān)從動物生理特性，研究指標，實驗技術(shù)操作，自然發(fā)病等方面選擇動物的原理為證候模型研究中動物的選擇所遵循。實驗動物在遺傳、微生物質(zhì)量控制方面存在著單純性與代表性的基本矛盾，即動物的品質(zhì)越高，實驗結(jié)果就越均一，但其代表性也越弱。從作為人類模型這一本質(zhì)屬性來說，實驗動物質(zhì)量的首要衡量標準是與人類的相似性，標準化必須服從于相似性。從標準化出發(fā)進行實驗動物的遺傳和微生物控制是錯誤的。2.建立與中醫(yī)學相適應(yīng)的，實證的實驗動物評價、管理體系證候模型研究的動物選擇應(yīng)從中醫(yī)角度考慮體質(zhì)因素。證候模型研究的動物選擇還應(yīng)從中醫(yī)角度考慮技術(shù)因素：豬的皮膚結(jié)構(gòu)與人相似，適合制作溫病模型觀察汗出；豬的舌象與人相似適合于模型舌象觀察；體形較大的動物適合于做按摩治療研究；豚鼠耳蝸較為敏感，常用于“腎主耳”的研究。3.證候模型研究應(yīng)盡量選擇在其日常生活中就能出現(xiàn)相應(yīng)證候的動物。遺傳性證候模型由于具有生物學特性恒定，重復性好的特點，應(yīng)更多地建立。如在病的基礎(chǔ)上篩選出證候較一致的動物模型，如自發(fā)性遺傳性糖尿病陰虛證中國田鼠(Cricetulusgriseus)，將健康中國田鼠在兄弟姐妹鼠間交配，第三、第四代時出現(xiàn)自發(fā)性遺傳性糖尿病，發(fā)生率可達65～90%。4.動脈粥樣硬化動物模型構(gòu)建的方法5.AS痰濁血瘀證候現(xiàn)代生物學基礎(chǔ)(1)動脈粥樣硬化痰濁證候的生物學基礎(chǔ)

脂質(zhì)代謝紊亂——痰濁從痰證論治AS是具有中醫(yī)特色的一種方法結(jié)合脂質(zhì)代謝紊亂，尤其是HDL-C的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運作用，從細胞和分子水平對痰濁型AS的發(fā)病機制進行更深入的研究，將有助于揭示AS痰濁證候的微觀生物學基礎(chǔ)。(2)動脈粥樣硬化血瘀證候的生物學基礎(chǔ)血瘀證:血凝而不行、血泣則不通、凝血蘊里而不散等，說明血在脈中發(fā)生瘀滯的狀態(tài)血行失度、血脈不通皆是產(chǎn)生AS血瘀證候根本原因?，F(xiàn)代研究表明，血液流變學異常、血小板活化及血管內(nèi)皮損傷是AS血瘀證候的重要生物學表現(xiàn)。內(nèi)皮細胞損傷是血管病變的始動因素，內(nèi)皮素(ET)是血管內(nèi)皮細胞損傷特異性指標之一。ET、NO及二者的平衡，血栓素(TXA2)、前列腺素(PGI2)及二者間的平衡(TXA2／PGI2)，組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、組織型纖溶酶原激活劑抑制物(PAI)及二者的比值炎癥病理和纖維化——血瘀證機制。研究證實在AS從早期內(nèi)皮被修飾的脂質(zhì)活化到最終的斑塊破裂都有炎性反應(yīng)的參與。如：AS發(fā)生時諸多細胞炎癥因子的表達與核因子-κB(NF-κB)信號轉(zhuǎn)導通路的開放有關(guān)（3）動脈粥樣硬化痰濁血瘀證與組學技術(shù)高脂血癥及AS不同痰瘀證候可能的血漿標志蛋白與不同的臟腑功能之間存在不同的關(guān)聯(lián)組合。采用代謝組學技術(shù)，探討痰瘀證候的動態(tài)演變、時相特點和由痰致瘀在代謝方面的變化。高脂血癥前期以脂質(zhì)代謝紊亂為特點，隨著病程進展，參與血液凝固過程的乙酰糖蛋白出現(xiàn)，同時酮體及乳酸升高。我們的經(jīng)驗體會無論是大鼠還是小鼠，僅僅用高脂飼料喂養(yǎng)的方法，只能制造高脂血癥模型（痰濁證），很難制作出AS斑塊模型（痰濁血瘀證）；制作出AS斑塊動物模型，雖然有多種方法，如球囊損傷法，但死亡率高，成本大，操作不易；用ApoE-/-小鼠+高脂飼料喂養(yǎng)的方法，成功率高，成本相對較低，操作相對容易，且符合痰濁血瘀證的特征。ApoE-/-小鼠+高脂飼料喂養(yǎng)的方法，是制作痰濁血瘀證AS斑塊模型的理想方法。二、研究內(nèi)容

AS的發(fā)生發(fā)展中具有諸多因素。本課題組近年來，采用在體與離體水平相結(jié)合的方法，使用中醫(yī)藥干預AS模型小鼠與細胞，從抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及減少病理性血管生成等方面，進行防治AS的系列研究。冠心病等AS疾病屬中醫(yī)胸痹、心悸怔忡、心痛范疇。其病因病機是本虛標實。氣虛、痰瘀互阻是重要的病理因素。痰瘀互結(jié)以致病，補氣活血是主要防治方法。二、研究內(nèi)容基于對冠心病等AS疾病病機的充分認識，在臨床上采用中藥復方定心方（DXR）治療冠心病多年收到了良好療效。DXR重用赤芍和丹參為君，活血化瘀、涼血止痛，取“去瘀生新”之義；以歸心肝經(jīng)之黃連、苦參為臣，解毒清熱，瀉火寧心；佐以三七、瓜蔞活血祛痰，茯苓、黨參健脾益氣，靈芝、酸棗仁養(yǎng)心安神；諸藥合而共奏益氣養(yǎng)心、活血解毒、清熱祛痰之功效。二、研究內(nèi)容二、研究內(nèi)容近幾年的研究內(nèi)容主要有六個方面：一、定心方上調(diào)ApoE-/-小鼠PTEN表達抑制動脈粥樣硬化形成的研究；二、定心方經(jīng)Ang1-Tie2通路干預人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管生成的實驗研究；三、定心方通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路減輕ox-LDL誘導的HUVEC氧化應(yīng)激損傷的機制；二、研究內(nèi)容四、梔子苷通過miR-101/MKP-1/MAPK通路抑制動脈粥樣硬化炎癥的機制研究；五、梔子苷對動脈粥樣硬化并發(fā)非酒精性脂肪肝ApoE-/-小鼠炎癥和氧化應(yīng)激的影響；六、三七皂苷R1上調(diào)miR-146a水平和減輕ApoE-/-小鼠肝臟炎癥損傷的研究三、研究方法1.在體水平實驗動物：SPF級8周齡雄性ApoE-/-小鼠90只，8周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠作為空白對照。飼養(yǎng)室溫18～26℃，相對濕度55%左右，光照時間為12h。飼養(yǎng)籠具及引水瓶定期消毒。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只。高脂飼料（0.15%膽固醇，21%豬油，78.85%原糧）由廣東省醫(yī)學實驗動物中心配制。小鼠分組：雄性ApoE-/-小鼠，隨機分為9組，每組10只。分別為模型組，辛伐他汀組，DXR低、中、高劑量組，梔子苷組，三七皂苷低、中、高劑量組，所有小鼠均高脂飼料喂養(yǎng)，并以同周齡雄性C57BL/6J小鼠作為空白對照組。三、研究方法DXR低、中、高劑量組分別以9.30g/kg、18.59g/kg、37.18g/kg藥液灌胃，辛伐他汀組以5mg/kg藥液灌胃，梔子苷以50mg/kg藥液灌胃，三七皂苷R1低、中、高劑量組分別為12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg，腹腔注射給藥，其他組給予等劑量生理鹽水灌胃。各組小鼠自由飲水，根據(jù)小鼠體重(每兩周測量1次)，以校正給藥量，藥液灌胃均每日1次，連續(xù)12周。三、研究方法三、研究方法2.離體水平人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）購自于CascadeBiologics公司，細胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃，5%的CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，2~3d傳代一次，實驗采用對數(shù)生長期的細胞。三、研究方法含藥血清的制備實驗分組：以含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞18h，待細胞貼壁后，分為5組：空白對照組、模型組、DXR高、中、低劑量組?？瞻讓φ战M加入10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，其余各組加入10％FBS的DMEM培養(yǎng)液+ox-LDL，終濃度為100ug/ml。以上各組共同繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去上清后，空白對照組加入含15％空白大鼠血清的DMEM培養(yǎng)液，模型組加入10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，定心方高中低劑量組分別加入20%、15%、5%含DXR含藥血清的DMEM培養(yǎng)液，共同培育24h后收集細胞。生化檢測HE、Masson染色免疫組化RT-qPCRWesternBlot

ELISA

三、研究方法三、研究方法細胞劃痕實驗內(nèi)皮細胞遷移實驗雞胚尿囊膜實驗

小管形成實驗1、定心方上調(diào)ApoE-/-小鼠PTEN表達抑制動脈粥樣硬化形成的研究①DXR給藥組血脂水平較模型組明顯降低，表明DXR有降脂作用；②模型組小鼠血清中總超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶，總抗氧化能力較空白對照組明顯降低，而丙二醛水平明顯升高。DXR治療后血清中總超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶，總抗氧化能力升高，丙二醛水平降低，表明DXR有抑制ApoE-/-小鼠氧化應(yīng)激的作用；

四、研究結(jié)果③與空白對照組小鼠相比，所有ApoE-/-小鼠均有斑塊形成。經(jīng)不同劑量DXR治療后主動脈病變減輕，DXR高劑量組管腔狹窄程度減輕最為明顯，斑塊面積最?。虎苣Ｐ徒M小鼠主動脈PTEN水平較空白對照組明顯降低，而經(jīng)過辛伐他汀及DXR不同劑量治療后均可升高PTEN水平。

四、研究結(jié)果2、定心方經(jīng)Ang1-Tie2通路干預人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管生成的實驗研究①受DXR干預小鼠的斑塊內(nèi)CD34標記的小血管數(shù)目明顯減少，證明DXR具有抑制小鼠血管生成的作用；

四、研究結(jié)果注：A.空白組B.模型組C.辛伐他汀組D.DXR低劑量組E.DXR中劑量組F.DXR高劑量組（200倍光鏡下視野）②DXR中劑量組和高劑量組對ox-LDL誘導的血管內(nèi)皮細胞的遷移具有抑制作用。DXR含藥血清組也具有降低血管內(nèi)皮細胞在體外分化成管狀結(jié)構(gòu)的能力；③受DXR含藥血清干預的HUVEC中的Ang1蛋白和Tie2蛋白表達量上調(diào)，與血管生成相關(guān)的VEGF蛋白表達量下降。說明DXR含藥血清可以激活人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的Ang1-Tie2通路，進而調(diào)控下游指標VEGF，實現(xiàn)對血管生成的調(diào)控；

四、研究結(jié)果④雞胚尿囊膜實驗證明，受DXR含藥血清干預的雞胚組形成的一級血管與二級血管數(shù)量顯著低于模型組。

四、研究結(jié)果

3、定心方通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路減輕ox-LDL誘導的HUVEC氧化應(yīng)激損傷的機制①DXR可顯著降低MMP9表達與MMP9/TIMP1比值，并上調(diào)TIMP1表達；②DXR可促進ox-LDL誘導的HUVEC分泌NO及SOD，起到抗氧化應(yīng)激作用；③DXR各組細胞的p-PI3K、p-Akt蛋白表達均顯著降低。

四、研究結(jié)果4、梔子苷通過miR-101/MKP-1/MAPK通路抑制動脈粥樣硬化炎癥的機制研究

①梔子苷降低小鼠血脂血糖水平，調(diào)控糖脂代謝紊亂；②梔子苷減小動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)斑塊大小，減緩纖維斑塊的發(fā)展；③梔子苷顯著降低小鼠血清中炎癥因子如TNF-α、IL-6的表達；④梔子苷可以上調(diào)MKP-1表達，降低p38的活化程度；⑤梔子苷顯著下調(diào)miR-101的轉(zhuǎn)錄水平

四、研究結(jié)果5、梔子苷對動脈粥樣硬化并發(fā)非酒精性脂肪肝ApoE-/-小鼠炎癥和氧化應(yīng)激的影響①梔子苷能夠有效降低ApoE-/-小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基酶水平；②梔子苷能夠降低小鼠肝臟中TNF-α、IL-6水平，具有抑制炎癥及減輕肝損傷的作用；

四、研究結(jié)果③梔子苷顯著降低肝臟中丙二醛水平，升高總超氧化物歧化酶水平。④HE染色表明梔子苷能夠有效減少AS斑塊面積，同時能夠一定程度抑制肝臟脂肪變性。

四、研究結(jié)果

6、三七皂苷R1上調(diào)miR-146a水平和減輕ApoE-/-小鼠肝臟炎癥損傷的研究

①模型組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基酶含量顯著高于空白對照組，使用中、高劑量三七皂苷R1干預后，小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與天冬氨酸氨基酶的含量顯著降低；②肝臟組織形態(tài)學結(jié)果也表明，與模型組比較，三七皂苷R1能明顯減輕AS小鼠肝細胞的脂肪變性，改善肝功能；

四、研究結(jié)果③三七皂苷R1干預小鼠后，TNF-α和IL-6均顯著下降，且高劑量組療效更為顯著，表明三七皂苷R1能明顯抑制AS炎癥因子的表達；④三七皂苷R1及辛伐他汀干預后進一步升高肝臟miR-146a水平，從而發(fā)揮其抑制炎癥的作用。這可能是三七皂苷R1減輕AS小鼠肝損傷及炎癥反應(yīng)的重要分子機制。

四、研究結(jié)果

中醫(yī)藥因其獨特的辨證論治理論體系及全面調(diào)節(jié)機體機能的特色，在干預AS的研究方面取得了一定的進展。