【源版】PCR檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用-培訓(xùn)課件

PCR檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用

劉學(xué)強189941819172017年3月學(xué)習(xí)內(nèi)容PCR快速檢測技術(shù)綜述前言臨床意義PCR檢測的開展條件PCR檢測技術(shù)的基本原理反應(yīng)特點PCR體系反應(yīng)步驟PCR檢測臨床案例（各步驟注意事項）樣品處理提取核酸PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳

PCR快速檢測技術(shù)綜述聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是1985年由美國科學(xué)家發(fā)明的。聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是體外選擇性擴增基因片段的技術(shù)。具有特異、敏感、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點。能在一個試管內(nèi)將所要檢測的目的基因片段短時間內(nèi)擴增至數(shù)百萬倍，肉眼能直接觀察和判斷。前言PCR快速檢測技術(shù)綜述PCR是分子生物學(xué)實驗室的常規(guī)方法，可用于：疾病快速檢測基因組測序制備單鏈模板目的基因的獲得基因組克隆基因突變基因功能和表達調(diào)控的研究臨床意義動物的致病微生物如細菌、病毒、衣原體、支原體等均可通過PCR檢測到。早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，致病微生物感染潛伏期即可被PCR法檢出。對低持續(xù)感染病毒的診斷，有些體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能定量檢測病毒基因，是病毒數(shù)量多少的最直接指標。PCR快速檢測技術(shù)綜述動物疾病檢測設(shè)備試劑昂貴專業(yè)人員的配備程序優(yōu)化PCR實驗的環(huán)節(jié)很多，而且對每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高PCR檢測的開展條件PCR快速檢測技術(shù)綜述PCR定義

PCR(polymerasechainreaction)即聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)，是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-退火-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴增數(shù)百萬倍的一種操作技術(shù)。（為什么擴增？）PCR的基本原理PCR的基本原理PCR的分子基礎(chǔ)—核酸除阮病毒（羊瘙癢病、瘋牛?。┩馑猩w的遺傳物質(zhì)，是PCR擴增的模板。PCR的基本原理名稱RNADNA全稱核糖核酸脫氧核糖核酸基本組成單位核糖核苷酸脫氧核糖核苷酸成分磷酸相同五碳糖核糖脫氧核糖堿基A、G、C、UA、G、C、T結(jié)構(gòu)單鏈雙鏈功能生物體的遺傳、變異和指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成PCR的基本原理PCR的反應(yīng)特點特異性強：PCR以特定靶序列為檢測目標，針對性強，所以具體很強的特異性。靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，理論上可以檢出一個病原體單拷貝基因的存在。簡便、快速：PCR反應(yīng)一般在2～4小時完成擴增反應(yīng)。對標本的純度要求低：幾乎所有的臨床樣品都可以作為PCR的檢測材料。對病原微生物只要求樣品中有完整的靶序列核酸，不一定有存活的病原體。

PCR的基本原理PCR反應(yīng)體系及作用模板DNA或RNA特異性引物？耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+PCR緩沖液模板為混合物，引物決定特異性模板DNAMg2+dNTPTaq酶引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)步驟（由PCR儀完成）變性:目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈退火:兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列配對延伸:DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。PCR的基本原理PCR的基本原理DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及合成單個循環(huán)擴增PCR的擴增變性94℃延伸72

℃退火Tm-5℃PCR的基本原理25~35個循環(huán)放大幾百萬倍變性

94℃

5min

變性

94℃

30s

退火

45～65℃30s25~35個循環(huán)

延伸

72℃

30s～8min

最后一次延伸

72℃

10min

反應(yīng)終止后，將樣品保存于4℃或進行凝膠電泳，以鑒定是否得到特異的擴增產(chǎn)物。PCR的基本原理小結(jié)：人為模擬體內(nèi)的病毒核酸復(fù)制，應(yīng)用一系列檢測儀器及試劑把微觀的體內(nèi)病毒核酸放大成宏觀的可觀測結(jié)果。來自病料的極微量核酸

不可觀測數(shù)百萬倍模板核酸拷貝

可觀測PCRPCR的基本原理PCR操作流程PCR檢測臨床案例PCR檢測臨床案例樣品處理注意取病變明顯部位1/3組織+2/3生理鹽水避免樣本間污染單樣本內(nèi)可混合不同組織冷凍保存樣品至少一周PCR檢測臨床案例PCR檢測臨床案例提取核酸目的：獲得目的基因模板離心柱型核酸提取試劑盒采用改進的SDS-堿裂解法裂解組織勻漿，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜選擇性地結(jié)合溶液中的核酸，再通過漂洗液將雜質(zhì)和其它成分去除，最后用洗脫緩沖液將純凈核酸從硅基質(zhì)膜上洗脫。PCR檢測臨床案例裂解液、洗液、洗脫液離心吸附柱動物組織過柱洗脫勻漿離心洗滌裂解核酸（模板）PCR檢測臨床案例核酸提取流程提取病料核酸（模板）洗脫核酸PCR檢測臨床案例注意上清液雜質(zhì)，堵避免各步操作樣本間污染RNA降解洗脫液點在硅基質(zhì)膜中央個人防護PCR檢測臨床案例PCR檢測臨床案例核酸（模板DNA或RNA？）小結(jié)PCR檢測臨床案例PCR擴增目的：將微量模板擴增至數(shù)百萬倍PCR反應(yīng)的模板可以是cDNA、基因組DNA或RNA。當用RNA作為模板時，首先要進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后再進行正常的PCR擴增。RNADNA37℃，1h反轉(zhuǎn)錄體系反轉(zhuǎn)錄：RNA病毒擴增前需要反轉(zhuǎn)錄成cDNA，如PRRSV、CSFVPCR檢測臨床案例PCR檢測臨床案例PCR體系模板DNAPCR檢測臨床案例取擴增體系體系瞬離向擴增體系中加入模板設(shè)置程序，開始擴增PCR檢測臨床案例擴增產(chǎn)物暫存4℃，等待電泳擴增產(chǎn)物PCR檢測臨床案例注意防止交叉污染陽性對照非特異性擴增反復(fù)凍融，分裝PCR專用物品個人防護PCR檢測臨床案例PCR檢測臨床案例PCR產(chǎn)物電泳目的：檢測PCR產(chǎn)物中是否存在預(yù)期的基因片段

DNA分子在電泳緩沖液中帶負電荷，在電場中向正極移動。而瓊脂糖凝膠具有分子篩作用，不同大小的核酸，其移動速度有差異。因此，利用這種雙重效應(yīng)達到分離核酸的目的。PCR檢測臨床案例瓊脂糖凝膠電泳所需器材GoldViewMarkerLoadingBuffer梳子TAE瓊脂糖核酸染料可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下發(fā)出熒光，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察分離到的目的基因片段條帶。PCR檢測臨床案例PCR檢測臨床案例電泳儀電泳槽膠槽電泳槽膠板凝膠成像系統(tǒng)TAE

電泳緩沖液膠液++瓊脂糖核酸染料1%~2%0.01%200mlPCR檢測臨床案例配制瓊脂糖膠液微波爐3min瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍PCR檢測臨床案例PCR檢測臨床案例配制瓊脂凝膠溶膠梳子凝膠裝置++膠槽膠板PCR檢測臨床案例組裝凝膠裝置并調(diào)平PCR檢測臨床案例PCR檢測臨床案例倒膠凝膠倒膠，一次倒成凝膠，室溫靜置至少30minPCR檢測臨床案例小心拔去梳子取出膠槽電泳緩沖液沒過膠面PCR檢測臨床案例電泳槽接通電泳儀（電極）PCR檢測臨床案例擴增產(chǎn)物上樣前處理+處理后產(chǎn)物L(fēng)oadingBufferPCR擴增產(chǎn)物點樣（樣品、marker）PCR檢測臨床案例點樣跑膠點樣完畢開始電泳電泳結(jié)束PCR檢測臨床案例凝膠成像圖像采集PCR檢測臨床案例檢測結(jié)果PCR檢測臨床案例2號、7號PRRS陽性（400bp）；8號CSF陽性（170bp）使用完生物安全柜后進行紫外線消毒填