DB21-T3054-2018-犬巴貝斯蟲熒光定量PCR檢測方法-遼寧省

ICS11.220DB21B41遼寧省地方標準DB21/T3054—2018犬巴貝斯蟲熒光定量PCR檢測方法DetectionoffluorescentquantitationPCRforBabesiacanis遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3054—2018目次前123456789言..............................................................................II范圍................................................................................1規(guī)范性引用文件......................................................................1縮略語..............................................................................1原理................................................................................1儀器和器材..........................................................................1試劑和引物..........................................................................2樣品的采集和前處理..................................................................2操作步驟............................................................................2檢測過程中防止交叉污染的措施........................................................310廢棄物處理.........................................................................4IDB21/T3054—2018前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由遼寧省畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。本標準起草單位：遼寧省動物疫病預防控制中心、遼寧省動物醫(yī)學研究院。本標準主要起草人：高志峰、張才、楊國麗、鄧文超、張健、馬建山、高原、蘭德松。IIDB21/T3054—2018犬巴貝斯蟲熒光定量PCR檢測方法1范圍本標準規(guī)定了犬巴貝斯蟲的熒光定量PCR檢測方法的技術要求，包含規(guī)范性引用文件、縮略語、原理、儀器和器材、試劑和引物、樣品的采集和前處理、操作步驟、檢測過程中防治交叉污染的措施、廢棄物處理等。本標準適用于在生物安全Ⅱ級（BSL-2）以上的實驗室進行全血液樣品中犬巴貝斯蟲核酸的檢測，適用于犬巴貝斯蟲病的確診及流行病學調(diào)查。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術要求中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告2003年第302號《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告2017年第25號《病死及病害動物無害化處理技術規(guī)范》3縮略語該部分對本技術規(guī)范中用到的縮略語進行了注解：DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）4巴貝斯蟲病是指由巴貝斯科的原蟲所引起的一種梨形蟲病，主要以侵害家畜的紅細胞為特征的血液原蟲病。犬巴貝斯蟲病是一種經(jīng)硬蜱傳播的血液原蟲病，臨床上以嚴重貧血、高熱、黃疸、呼吸困難為特征。根據(jù)犬巴貝斯蟲（Babesiacains,B.canis）裂殖子基因序列設計一對引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點，通過變性、退火和延伸，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA。51DB21/T3054—20185.1低溫高速離心機（最大離心力12000rpm）.5.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。5.3生物安全柜。5.4熒光PCR擴增儀。5.5分析天平。5.6離心管：1.5ml離心管和0.2mlPCR專用離心管。5.7微量可調(diào)移液器：1000μl，200μl，100μl，50μl，20μl，10μl，2μl。6試劑和引物注：本技術規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所有實驗使用的試劑等級均為不含RNA或RNase的分析純或生化試劑；所有試劑均用無菌的容器分裝。6.15mMol/L的Tris/HCl(pH7.5～8.0)6.2滅菌雙蒸水6.370%乙醇6.4犬巴貝斯蟲陽性對照組基因6.5特異性引物：正向引物：5’-TGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTG-3’反向引物：5’-TCCATGCTGAAGTATTCAAGACACA-3’。6.6基因組DNA純化試劑盒100次、購自TaKaRa公司，常溫保存6.7熒光定量試劑盒FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)。產(chǎn)品在-15至-25℃條件下可穩(wěn)定存放至標簽上的有效期之前。若存放于2～8℃條件，僅可短期儲存不超過1個月。7于犬前肢臂頭靜脈取300μl抗凝血，4℃保存，4h內(nèi)使用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA。將采樣時避免接觸血液，盡量使用一次性采血針及配套采血管（EDTA，2Na-EDTA，肝素均可）采血。采集或處理的樣品在2～8℃條件下保存應不超過24h；若需長期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融(凍融不超過3次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6～8h之內(nèi)運送88.1.1按處理血液樣品數(shù)準備1.5ml離心管，并各加入GenTLESolutionI500μl。8.1.2把混合均勻的100μl血液，加入到分裝好的GenTLESolutionI的離心管中，立即振蕩數(shù)秒鐘。不管處理多少樣品，血液加入到GenTLESolutionI中，要立即進行振蕩混合，否則有可能降低收取的DNA量。2DB21/T3054—20188.1.3室溫放置10min以上，然后在室溫條件下12000rpm離心5min。離心時，請注意離心管在離心機里的擺放方向要統(tǒng)一，離心管的小耳朵朝上。此時幾乎看不到DNA沉淀。若離心溫度低，會對收取的DNA量和純度有影響，請于20℃以上離心。8.1.4用移液器小心除去管中溶液，此時沉淀看不清，緊貼在離心管外側（帶小耳朵一側）的內(nèi)壁上，除去溶液時，請一定注意微量移液器吸頭不要碰到離心管外側的內(nèi)壁，插到離心管內(nèi)側的底部，注意不要吸走沉淀物。8.1.5加入1ml的GenTLESolutionII。此時GenTLESolutionII應沿著離心管內(nèi)側的內(nèi)壁加入到離心管中。特別注意操作步驟4（除去GenTlESolutionI和血液混合物）以及操作步驟10（除去GenTLESolutionIII和異丙醇混合物）的實驗操作特別重要，請嚴格按操作方法進行。8.1.6輕柔地上下顛倒離心管數(shù)次，室溫12000rpm以上離心2min，用微量移液器小心地除去上清溶液（方法參見實驗操作4）。劇烈振蕩將影響收量和純度。8.1.7向離心管中加入GenTLESolutionIII500μl，輕微振蕩10s充分混合。8.1.8室溫12000rpm離心5min，把上清溶液移至另一個新的離心管中。8.1.9加入等體積（約500μl）的異丙醇，輕柔地上下顛倒數(shù)次，均勻混合。8.1.104℃、12000rpm離心5min，小心除去上清溶液。GenTLESolutionIII中含有影響酶反應的物質(zhì)，所以一定要除凈上清溶液，但應注意不要吸走沉淀。8.1.11加入1ml的70%乙醇清洗沉淀，4℃、12000rpm離心5min，小心地除去上清溶液（方法參見4）。8.1.12干燥沉淀。因為該方法提取的DNA較大，完整性好，所以請一定不要干燥過度。Tube（離心管）中看不到有明顯的液體或沒有乙醇氣味后，就可以加入TE進行溶解。如果沉淀已經(jīng)變白，說明干燥過度，此時加入TE，可能沉淀不能完全溶解，DNA的收量可能會受到影響。8.1.13根據(jù)下一步實驗需要，用10～50μl適當?shù)?mMol/L的Tris/HCl(pH7.5～8.0)溶解沉淀。（1）2×SYBRMasterMix10.0μl；（2）20μmol/l正反向引物各0.1μl；（3）去離子水7.8μl；（4）樣品2μl，其中2個管分別加入2μl滅菌雙蒸水和2μl陽性對照基因。8.2.4震蕩混勻后使用離心機離心，此時拿出Tube時應小心不可以讓聚集在管底的液體彈起。8.2.5放入熒光定量PCR儀，反應條件為：95℃3min，95℃15s，60℃60s，72℃30s，35個循環(huán)。8.2.6熒光定量PCR反應結束后，從熒光定量PCR儀直接調(diào)取熒光定量PCR溶解曲線數(shù)據(jù)，進行溶解曲線分析。當樣品的