《病原微生物學實驗室技術與應用》課件

病原微生物學實驗室技術與應用微生物檢測技術和安全操作規(guī)程課程概述課程目標掌握微生物實驗基本技能主要內容微生物檢測技術與安全操作學習方法第一章：病原微生物實驗室概述基本概念了解病原微生物的定義與特性實驗室分級掌握生物安全實驗室等級劃分安全標準學習生物安全操作規(guī)范病原微生物的定義與分類病原微生物定義能引起人、動植物感染和疾病的微小生物細菌與病毒細菌為原核生物，病毒為非細胞型真菌與寄生蟲真菌為真核生物，寄生蟲體積較大病原微生物實驗室的分級四級實驗室埃博拉等高致病性病原體三級實驗室SARS、炭疽等危險病原體二級實驗室一般致病菌如沙門氏菌一級實驗室非致病微生物研究實驗室生物安全概念生物安全定義防止生物因子對人類、動植物和環(huán)境造成危害的措施包括實驗室安全操作、廢棄物處理和環(huán)境保護生物安全重要性保護實驗人員健康防止病原體擴散確保實驗數(shù)據(jù)準確維護公共衛(wèi)生安全第二章：實驗室設施與設備基礎設施實驗室布局與環(huán)境控制安全設備生物安全柜與個人防護檢測設備顯微鏡與分析儀器培養(yǎng)設備培養(yǎng)箱與滅菌器實驗室基本設施要求實驗室布局清潔區(qū)與污染區(qū)分開通風系統(tǒng)定向氣流，負壓控制洗手消毒設施非手動水龍頭，消毒液生物安全柜Ⅰ級安全柜保護操作者和環(huán)境不保護樣品1Ⅱ級安全柜保護操作者、環(huán)境和樣品常用于二級、三級實驗室2Ⅲ級安全柜全封閉操作用于高危病原體3使用原則預先紫外消毒操作時減少干擾氣流4高壓蒸汽滅菌器工作原理121℃高壓蒸汽破壞微生物結構操作步驟裝載、設置參數(shù)、運行、冷卻常見問題壓力不足、溫度偏低、滅菌不徹底解決方法定期維護、使用生物指示劑驗證顯微鏡的使用光學顯微鏡常規(guī)微生物形態(tài)觀察熒光顯微鏡特異性標記微生物檢測電子顯微鏡病毒等超微結構觀察其他常用設備PCR儀核酸擴增關鍵設備離心機樣品分離處理培養(yǎng)箱微生物培養(yǎng)基礎設備第三章：實驗室安全操作規(guī)程個人防護裝備（PPE）防護服一次性隔離衣連體防護服手套乳膠/丁腈手套雙層防護口罩與護目鏡N95口罩防濺護目鏡無菌操作技術洗手消毒操作前徹底洗手器材準備確保所有器材已滅菌安全柜操作在層流條件下進行接種環(huán)灼燒紅熱冷卻后使用生物安全柜的正確使用1開啟程序開風機→紫外燈消毒30分鐘→關紫外燈→工作區(qū)消毒2操作中注意動作輕緩→避免阻擋氣流→保持工作區(qū)清潔3完成后處理清理工作區(qū)→表面消毒→紫外燈照射4關閉程序紫外燈消毒結束→關紫外燈→關風機實驗室廢棄物處理固體廢棄物高壓滅菌后焚燒雙層生物安全袋密封專人專車運送液體廢棄物含氯消毒劑處理作用30分鐘以上專用下水道排放尖銳物品專用硬質容器收集不過滿，密封牢固高溫高壓處理實驗室事故應急處理事故類型識別泄漏、濺出、暴露、火災人員撤離保持冷靜，按指定路線撤離污染控制使用消毒劑覆蓋污染區(qū)報告記錄詳細記錄事件過程與處理方法第四章：基礎實驗技術微生物培養(yǎng)基制備1培養(yǎng)基種類選擇根據(jù)微生物生長需求選擇2成分稱量配制精確計量各組分3pH調整與滅菌高壓滅菌121℃15-20分鐘4質量控制檢查無菌性、支持力測試接種技術平板劃線法分離純化單菌落傾注平板法測定細菌數(shù)量液體培養(yǎng)接種大量培養(yǎng)微生物染色技術革蘭氏染色區(qū)分革蘭陽性和陰性細菌抗酸染色結核分枝桿菌等檢測熒光染色特異性高，熒光顯微鏡觀察鏡檢技術濕片法觀察活體微生物運動操作簡便，不需固定染色懸滴法長時間觀察微生物活動避免細菌干燥和死亡油鏡觀察高倍率細節(jié)觀察需使用浸油增加分辨率細菌計數(shù)方法30-300平板計數(shù)法適宜計數(shù)范圍內菌落3最可能數(shù)法稀釋度設置，統(tǒng)計陽性管數(shù)0.1比濁法麥氏比濁管比較或分光光度計第五章：病原細菌檢測技術分離培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物生化鑒定確定細菌種類血清學檢測抗原抗體反應分子生物學檢測核酸特異性識別藥敏試驗確定藥物敏感性細菌分離培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基抑制非目標菌生長鑒別培養(yǎng)基不同菌種呈現(xiàn)不同顏色富集培養(yǎng)基促進目標菌快速生長細菌生化鑒定API系統(tǒng)多種生化試驗條帶根據(jù)顏色變化判讀用于臨床常見細菌自動化鑒定系統(tǒng)VITEK、Phoenix系統(tǒng)計算機輔助判讀快速出結果質譜鑒定技術MALDI-TOFMS蛋白質指紋圖譜精確度高，速度快血清學檢測凝集試驗抗原抗體形成可見凝集物常用于細菌菌株血清型鑒定ELISA試驗酶聯(lián)免疫吸附實驗可定性或定量檢測抗原抗體免疫熒光技術特異性熒光抗體標記直接或間接法檢測分子生物學檢測常規(guī)PCR擴增特定基因片段實時熒光定量PCR邊擴增邊檢測，可定量基因芯片技術高通量多重檢測藥敏試驗紙片擴散法測量抑菌圈判斷敏感性微量稀釋法確定最低抑菌濃度E-test方法梯度擴散技術，簡便準確第六章：病毒檢測技術1分子檢測特異性高，敏感度高2抗原檢測快速，適合現(xiàn)場使用3病毒分離培養(yǎng)金標準，可獲活病毒病毒培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)觀察細胞病變效應雞胚培養(yǎng)流感病毒等培養(yǎng)方法動物接種觀察臨床癥狀與病理變化病毒分離與鑒定1細胞病變觀察細胞融合、變圓、脫落2血凝試驗流感、麻疹等病毒鑒定3中和試驗特異性抗體阻斷病毒感染病毒抗原檢測免疫熒光法熒光標記抗體直接或間接法需要熒光顯微鏡ELISA法酶聯(lián)免疫吸附試驗高通量篩查定性或定量檢測膠體金快速檢測側向層析技術10-30分鐘出結果適合現(xiàn)場快速檢測病毒核酸檢測樣本處理提取病毒RNA/DNART-PCRRNA病毒需逆轉錄為cDNA實時熒光PCR定量檢測病毒載量基因測序病毒溯源和變異分析血清學診斷時間（天）IgM抗體IgG抗體IgM抗體檢測用于急性感染，IgG抗體檢測反映既往感染或免疫狀態(tài)第七章：真菌檢測技術形態(tài)學鑒定菌落特征和顯微結構培養(yǎng)與生化試驗特殊培養(yǎng)基和代謝特性血清學檢測抗原抗體反應特異性識別分子生物學檢測核酸擴增和基因測序真菌培養(yǎng)與鑒定培養(yǎng)基選擇沙氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂形態(tài)學鑒定菌落顏色、質地、生長速度顯微形態(tài)觀察菌絲、孢子形態(tài)結構生理生化試驗碳源利用、尿素水解等真菌顯微鏡檢查直接鏡檢KOH清除背景，顯示真菌結構懸滴法觀察真菌生長和形態(tài)發(fā)育透明膠帶法保留真菌孢子自然排列方式真菌血清學檢測抗原檢測隱球菌莢膜多糖抗原侵襲性曲霉菌半乳甘露聚糖侵襲性念珠菌甘露聚糖抗體檢測組織胞漿菌抗體球孢子菌抗體肺孢子菌抗體1,3-β-D葡聚糖檢測真菌細胞壁成分侵襲性真菌感染標志物不能區(qū)分真菌種類真菌分子生物學檢測DNA提取破壁關鍵步驟1PCR擴增ITS區(qū)域常用靶標2熒光原位雜交特異性識別真菌3基因測序精確鑒定菌種4第八章：寄生蟲檢測技術糞便檢查技術直接涂片法簡便快速，活動性觀察浮聚法密度小的蟲卵浮于液面沉淀法密度大的蟲卵沉于底部血液寄生蟲檢查厚膜法檢出率高適合低密度感染形態(tài)識別難度大薄膜法形態(tài)清晰種類鑒定準確檢出率低于厚膜法集中法離心或過濾富集提高檢出率適合絲蟲等檢查組織寄生蟲檢查皮膚刮片法疥蟲、利什曼原蟲檢查患處邊緣刮取，顯微鏡觀察組織壓片法囊蟲、旋毛蟲檢查組織壓片透明化后觀察消化法人工胃液消化組織釋放囊內幼蟲便于觀察寄生蟲免疫學檢測免疫熒光法特異性高，操作復雜ELISA法高通量，適合大規(guī)模篩查免疫層析法快速簡便，現(xiàn)場檢測寄生蟲分子生物學檢測1PCR技術高敏感性，種屬特異性識別2LAMP技術恒溫擴增，無需熱循環(huán)儀基因芯片技術多種寄生蟲同時檢測第九章：新型檢測技術1質譜技術快速鑒定微生物種類2基因組學全基因組測序與宏基因組分析3蛋白質組學蛋白表達譜與功能研究4生物芯片高通量多靶點檢測5納米技術納米顆粒與生物傳感器應用質譜技術在微生物檢測中的應用MALDI-TOFMS原理基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜微生物蛋白質指紋圖譜比對頻譜峰圖特征識別優(yōu)勢鑒定速度快（分鐘級）操作簡便，成本低準確率高（＞95%）廣泛適用各類微生物基因組學技術應用價值病原體精準鑒定與分型2宏基因組分析復雜樣本中直接檢測病原體全基因組測序測定完整基因組序列蛋白質組學技術雙向電泳分離復雜蛋白質混合物液相色譜-質譜聯(lián)用高靈敏度蛋白質鑒定病原體研究應用毒力因子與抗藥性研究疫苗與診斷開發(fā)發(fā)現(xiàn)新型診斷標志物生物芯片技術DNA芯片多種病原體同時檢測蛋白質芯片抗原抗體相互作用分析微流控芯片樣本處理與檢測一體化納米技術在病原體檢測中的應用納米顆粒增強檢測信號納米生物傳感器超高靈敏度檢測納米藥物遞送靶向治療感染應用前景現(xiàn)場快速診斷第十章：實驗室質量控制質量管理體系ISO標準與認證內部質量控制日常操作監(jiān)控與評估外部質量評價能力驗證與實驗室間比對生物安全管理風險評估與應急預案實驗室質量管理體系1質量改進持續(xù)改進與優(yōu)化質量控制與評價監(jiān)測評估質量指標標準操作程序統(tǒng)一規(guī)范操作流程質量手冊體系文件與政策ISO15189標準醫(yī)學實驗室質量與能力內部質量控制日期質控值上限下限第6天質控值超出上限，需要檢查原因并糾正外部質量評價接收能力驗證樣品未知樣本檢測挑戰(zhàn)常規(guī)方法檢測按日常程序操作提交結果報告規(guī)定時間內完成結果分析與改進對比其他實驗室結果生物安全管理1風險評估微生物危害等級評估2安全操作規(guī)程標準防護