《雜交苜蓿種子真實(shí)性鑒定SSR分子標(biāo)記法》征求意見(jiàn)稿

T/HXCYxxx—2025本文件規(guī)定了SSR分子標(biāo)記法鑒定雜交苜蓿種子真實(shí)性的術(shù)語(yǔ)和定義、儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)步驟、結(jié)果分析等內(nèi)容。本文件適用于雜交苜蓿種子真實(shí)性鑒定、品種的審定、新品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)及種子市場(chǎng)監(jiān)管。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T2930.4《草種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)》DB62/T4094《草品種真實(shí)性檢驗(yàn)規(guī)程SSR標(biāo)記法》3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1簡(jiǎn)單重復(fù)序列simplesequencerepeat(SSR)是由1-6個(gè)核苷酸為基本單位，通過(guò)連續(xù)串聯(lián)重復(fù)形成的DNA片段，長(zhǎng)達(dá)通常在幾十個(gè)至幾百個(gè)bp之間，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)單元的數(shù)量在不同個(gè)體或物種中高度可變，形成多態(tài)性標(biāo)記，是遺傳分析的重要工具。3.2瓊脂糖凝膠電泳agarosegelelectrophoresis是一種基于分子大小分離DNA片段的常用分子生物學(xué)技術(shù)。瓊脂糖凝膠電泳利用瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)，在電場(chǎng)作用下，使帶負(fù)電的核酸分子（DNA）從負(fù)極向正極遷移，通過(guò)凝膠孔徑的分子篩效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)不同大小核酸片段的分離。分離后的核酸可通過(guò)染色進(jìn)行可視化分析。3.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction(PCR)是一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)模擬DNA天然復(fù)制過(guò)程，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。DNA雙鏈變性：高溫（約95℃)使雙鏈DNA解鏈為單T/HXCYxxx—20252鏈模板；引物退火：降溫（通常是55℃~65℃)使特異性引物與單鏈DNA的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合；鏈延伸：中溫（約72℃)下，DNA聚合酶以單鏈為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，以5'→3'方向合成新鏈；重復(fù)循環(huán)上述步驟，實(shí)現(xiàn)DNA指數(shù)增長(zhǎng)。3.4引物primer是人工合成的短核苷酸序列（通常在18bp～30bp能夠通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與模板DNA特異性結(jié)合，引導(dǎo)DNA聚合酶從3'端開(kāi)始合成新鏈。3.5聚丙烯酰胺凝膠電泳polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)是一種基于分子大小、電荷或構(gòu)象分離DNA的高分辨率電泳技術(shù)。以聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)，通過(guò)交聯(lián)聚合反應(yīng)，利用電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)帶電分子遷移。4縮略詞下列縮略語(yǔ)適用于本文件。bp:basepair，堿基對(duì)DNA：deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核苷酸DNAmarker:用于比較DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)工具TBE：電泳緩沖液Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐熱DNA聚合酶dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸ddH2O：雙蒸水（超純水）LoadingBuffer：上樣緩沖液因基因組存在著能夠世代遺傳的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，雜交種子具有雙親等位標(biāo)記互補(bǔ)帶型。根據(jù)父母本的特征分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)在雜交種中的譜帶，可判斷該雜交種的真?zhèn)涡?。SSR分子標(biāo)記技術(shù)因其多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，是遺傳分析的重要工具。設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用電泳進(jìn)行分離，分析其長(zhǎng)度多態(tài)性，達(dá)到雜交苜蓿種子真實(shí)性鑒定。T/HXCYxxx—202536儀器設(shè)備高壓滅菌鍋、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋（30-100℃)、超純水儀、電子天平、凝膠成像系統(tǒng)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、垂直電泳槽及配套制膠工具、搖床、磁力攪拌器等。7所需試劑所用試劑均為分析純。7.1DNA提取使用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取。（液氮、研缽等）7.2瓊脂糖凝膠電泳Buffer等。7.3PCR擴(kuò)增引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×Buffer緩沖液、ddH2O、Mg2+、Mix反應(yīng)混合液。7.4聚丙烯酰胺凝膠電泳無(wú)水乙醇、碳酸鈉、四甲基乙二胺、過(guò)硫酸銨、去離子甲酰胺、冰醋酸、硝酸銀、甲醛、氫氧化鈉等。引物信息見(jiàn)表1。表1引物信息表引物名稱正向序列（5‘-3’）反向序列（3‘-5’）MTB60AAGAATGACGAAGAGGCGAATCAGAAATTCCCTCCCATTGAFcact60CCTCCCTAACTTTCCAACATGGATCAACGTGTCTTTCAFct32TTTTTGTCCCACCTCATTAGTTGGTTAGATTCAAAGGGTTAC4MTLEC2ACGGAAAGATTCTTGAATAGATCTGGTTCGCTGTTCTCATGMTB330ATCAACGTGTTGTCACCTCCTTCCATAAGCATTGTCGCTTGB14B03GCTTGTTCTTCTTCAAGCTCACCTGACTTGTGTTTTATGCMTB45TCCTTGAGAGGTTTACAAAGCATCAATGGTACCTCATTTCAACAAMTB340GACTTTGATTGGAAGGCCAAATCCACCACAAATCACAGGAAMTB200ATTAGTGTGCGGGTCACCTCAGTTTCGTACTCCCTCCGGTMMT42CGTCGTTTACTCAAACGACACCGCGTGTTTCTGCTGATTCATMMTB76AAAAAGGGATCGGCACACTTGAGGACACAGTCTCCGTGAGCMTRmiR045ATGACTTCAACCATAACTCCAAAAAGAAAAAGAGGCTGACATMTRmiR054TAGCTAGCAATGAAAACCACTCAAGCACAGAAGAAAAGTTGAMTRmiR072ACTCCAATTGTGGCTATAAAAGGTCCATGAGCTAACAAACTA9試驗(yàn)步驟9.1取樣供檢的樣品按GB/T2930.4《草種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法進(jìn)行發(fā)芽，從發(fā)芽的幼苗中取樣進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)對(duì)父、母本幼嫩葉片進(jìn)行取樣。9.2DNA提取本文件采用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行苜蓿DNA的提取，提取流程按照DNA提取試劑盒流程說(shuō)明書進(jìn)行。9.3DNA質(zhì)量檢測(cè)將2μL的DNA樣品與1μL的6×LoadingBuffer充分混合均勻后點(diǎn)于0.8%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀下進(jìn)行拍照觀察。凝膠配制1）配制TBE溶液：稱取108g的Tris堿、55g硼酸、EDTA-Na29.3g于燒杯中，加800ml去離子水?dāng)嚢枞芙?，用NaOH調(diào)節(jié)PH值為8.0，混合均勻，定容至1L;（2）T/HXCYxxx—20255稱取0.4g瓊脂粉置于100ml錐形瓶中，加入20ml1×TBE后，放到加熱器加熱至瓊脂糖完全融化;（3）待瓊脂糖完全融化后，加入2μl核酸染料，混合均勻后，冷卻;（4）將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠沿制膠槽邊沿小心緩慢地倒入內(nèi)槽玻璃板上，待瓊脂糖凝膠溶液緩慢展開(kāi)，直至整個(gè)制膠槽內(nèi)槽表面形成均勻無(wú)氣泡的膠層，室溫靜置;（5）待凝膠完全凝固后，垂直輕拔出梳子，取出膠帶，放入電泳槽中，用于上樣。9.4引物篩選利用親本DNA，在核心引物中篩選出具有較好多態(tài)性、親本間DNA片段差異較大，條帶清晰的引物，作為特定引物對(duì)供檢樣品進(jìn)行檢測(cè)。9.5PCR擴(kuò)增9.5.1反應(yīng)體系10μL的反應(yīng)體系包含2μL的DNA，正反引物各0.4μL、5μLMix反應(yīng)混合液和2.2μL超純水。9.5.2反應(yīng)程序94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃下延伸1min，循環(huán)35次，在72℃下延伸10min。注：此程序中退火溫度根據(jù)引物進(jìn)行調(diào)節(jié)。9.5.3擴(kuò)增產(chǎn)物PAGE電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物基因型用PAGE電泳檢測(cè)，本標(biāo)準(zhǔn)使用100孔垂直電泳槽進(jìn)行PAGE電泳檢測(cè)的方法。9.6PAGE電泳9.6.1凝膠制備（1）先取六對(duì)十二板玻璃板，加洗潔精，用自來(lái)水洗凈每板玻璃板表面灰塵和污漬直至光滑無(wú)污漬（避免凝膠過(guò)程中產(chǎn)生氣泡再用蒸餾水沖洗，直立晾干，用95%的酒精擦拭玻璃板后，晾干備用;（2）取適量的剝離硅烷均勻地涂抹在短玻璃板上，取同量的親和硅烷，均勻地涂抹在長(zhǎng)玻璃板上，干燥待用3）將兩塊玻璃板對(duì)向放置，四邊對(duì)齊后用夾子T/HXCYxxx—20256夾牢兩個(gè)豎邊，備用4）量取40ml的8%聚丙烯酰胺（提前配好）于100ml燒杯中5）向燒杯中分別加入40μl的四甲基乙二胺和200μl的過(guò)硫酸銨，迅速混勻6）將混合均勻的溶液沿孔邊緣緩緩倒入，使溶液充滿兩板之間而不外漏。灌膠過(guò)程中應(yīng)緩慢避免出現(xiàn)氣泡。同時(shí)，也不宜過(guò)慢，以免在還未灌完膠時(shí)出現(xiàn)已凝固的情況7）灌膠完成后，插上梳子（不能左右搖晃放置2h以上，使其完全凝固8）膠完全凝固之后，緩慢拔出梳子，拔梳子過(guò)程中要垂直拔出，不能左右搖晃9）將配好的5×TBE倒入電泳槽下槽，用夾子將制好的膠固定在電泳槽兩側(cè)，在電泳槽的上側(cè)倒入5×TBE沒(méi)過(guò)膠面。預(yù)電泳10min~20min。在膠板兩側(cè)點(diǎn)入2μl的2000bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，依次將2μl的PCR產(chǎn)物迅速注入點(diǎn)樣孔內(nèi)（避免出現(xiàn)氣泡同時(shí)記錄好點(diǎn)樣順序。加樣完成后，在200V恒壓下電泳2h。9.6.3銀染顯色（1）關(guān)閉電泳槽，切斷電源，去掉夾子，回收電泳槽上槽的5×TBE于燒杯中。取下玻璃板并沖洗，緩慢取下涂有剝離硅烷的玻璃板，將涂有親和硅烷的玻璃板置于盛有固定液（提前配制）的盤中。放在80rmp的搖床上，搖晃15min2）取出膠板（帶有凝膠的玻璃板將膠板放入盛有1L蒸餾水的盤內(nèi)5min3）硝酸銀溶液配制：稱取2g的硝酸銀，加的搖床上，搖晃15min5）取出膠板，放入盛有1L蒸餾水的盤內(nèi)清洗6）顯示溶液配制：稱取20g氫氧化鈉，加入1000ml的蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻后，加入5ml甲醛溶液，搖勻，使其充分混合備用;（7）取出清洗過(guò)的膠板，放入顯示溶液中，放置在80rmp的搖床上，直至條帶清晰8）出現(xiàn)清晰條帶后，加入配制好的終止液。待終止后