微生物限度檢查操作作業(yè)規(guī)程中國藥典四部通則

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標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程

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起草人審核人批準(zhǔn)人

起草日期審核日期批準(zhǔn)日期

起草部門質(zhì)量管理部頒發(fā)部門辦公室生效日期

一、范疇：本原則規(guī)定了微生物限度檢查辦法和操作規(guī)定；合用于檢品需氧菌總數(shù)、霉

菌和酵母菌總數(shù)、控制菌檢查。

二、引用原則：《中華人民共和國藥典》(通則1105-1106)

三、目錄1.微生物限度原則

2.設(shè)備、儀器及用品

3.消毒液、稀釋劑、試液及培養(yǎng)基

4.檢查總則(通則1105：非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法，通

則1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法)

5.微生物計數(shù)法檢查

6.控制菌檢查法

7.實驗技術(shù)

8.附件

1.微生物限度原則

非無菌藥用原料及輔料微生物限度原則

需氧菌總數(shù)(cfu/g霉菌和酵母菌總數(shù)控制菌

或cfu/ml)(cfu/g或cfu/ml)

藥用原料及輔料103102*

*未做統(tǒng)一規(guī)定。

1.1成品微生物限度原則

品法定除準(zhǔn)內(nèi)控卜示準(zhǔn)

名需氧菌霉菌和醉控制菌需氧菌霉菌和酵母控制菌

總數(shù)母菌總數(shù)總數(shù)菌總數(shù)(Cfu/g

大腸埃大腸埃

(cfu/g或(cfu/g或沙門(cfu/g或或cfu/ml)沙門

希菌菌希菌菌

cfu/ml)cfu/ml)cfu/ml)

乳糖^1000<100——無W100W50——

無水

<100W10—/10g<100W10-/10g

乳糖/100g/ICOg

蔗糖無無無無W100W50——

(1).“一”為不得檢出。

(2).目測霉變者以不合格論。

(3).“無”為原則根據(jù)或無相應(yīng)規(guī)定。

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1.2工藝用水微生物限度原則

法定標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)

品名

需氧菌總數(shù)控制菌(MPN/100mL需氧菌總數(shù)控制菌(MPN/100mL

(cfu/ml)或CFU/lOOmL)(cfu/ml)或CFU/lOOmL)

生活飲用水W100不得檢出<100不得檢出

純化水W100不得檢出W80不得檢出

1.3內(nèi)包裝材料微牛.物限度原則

口n口石

需氧菌總霉菌和酵控制菌需氧菌霉菌和酵控制菌

(單位)

數(shù)母菌總數(shù)總數(shù)母菌總數(shù)

藥用聚乙烯烽

塑料袋WlOOOcfuWlOOcfu—&lOOcfuW1Ocfu—

(100cm2)

闡明：1.“一”為每100cm?中不得檢出。2.目測霉變者以不合格論。3.“無”為原

則根據(jù)或無相應(yīng)規(guī)定。

2.設(shè)施、儀器及用品

2.1、設(shè)施：

2.1.1.微生物限度檢查室及有關(guān)設(shè)施：微生物計數(shù)實驗環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查規(guī)定。

檢查全過程必要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染辦法不得影響供試品中微生

物檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測。

2.1.2.其她設(shè)備：高壓蒸汽滅菌器；細(xì)菌培養(yǎng)箱（30-35℃）；霉菌培養(yǎng)箱（25?28℃）；

電爐（或其她適當(dāng)加熱裝置）；恒溫水??；電熱干燥箱：250?300℃）；電冰箱。生化試

劑儲存箱。

2.2儀器及器皿

2.2.1.菌落計數(shù)器；顯微鏡（I500X）；電子天平或藥物天平（感量0.1g）；pH系列比色

計。

2.2.2,玻璃器皿:錐形瓶（250?300ml,內(nèi)裝玻璃珠若干）、研缽（玻璃或陶瓷制，f

1（）?12cm）、培養(yǎng)皿（）9cm）、量筒（100ml）、試管（18X180mm）及塞、吸管（1ml

分度0.01,10ml分度0.1）、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）。

223新購玻璃器皿清潔：先用流水沖洗，浸泡于1%?2%鹽酸（工業(yè)用）液中約2?6小

時，除去游離堿質(zhì)，再用流水沖洗:。用于化學(xué)分析玻璃儀器，需用重銘酸鉀清潔液浸泡

數(shù)分鐘后，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗2?3次，晾干備用。

2.3用過玻璃靜皿：

2.3.1未被病原微生物污染器皿：可隨時洗滌。用清水沖洗（或浸泡），除容量儀器外，

可用毛刷和肥皂粉，內(nèi)外刷洗，再用清水涮洗干凈，晾干備用。容量儀器宜用清潔液浸

泡或涮洗，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗2?3次。

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2.3.2已被病原微生物污染器皿：需先通過滅菌解決后再按常法洗滌。

試管及培養(yǎng)皿：先正放或直立于高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，經(jīng)121c滅菌3（）分鐘。趁熱

傾出培養(yǎng)物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮凈。

吸管：所有直立浸沒于清潔液長筒形容器中，筒底應(yīng)襯有棉或橡皮墊，以防管尖損

壞。24小時后，逐支用流水重復(fù)沖洗干凈，晾干后包扎火菌備用。

載、蓋玻片：應(yīng)分別浸泡于清潔液12?24小時后，取出用流水沖洗，再放入3%?5%

肥皂水或5%碳酸鈉液內(nèi)煮沸10?15分鐘，待自然冷卻后，再用流水沖洗。瀝干后置95%

乙醇中浸泡，晾干備用。

2,3,3玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm

適當(dāng)疏松棉花，置吸管桶內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，

若用振蕩器制備混懸液時，尚需用玻璃紙包裹瓶塞（以免振蕩時供試液污染瓶塞），再

用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160C干熱滅菌2小時或高壓蒸汽121℃滅菌30分鐘，

烘干備用。

2.4用品

241大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋容器中，并應(yīng)定期用70%?75%乙靜溶液浸泡）。

242無菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備用。也可用一次

性無菌衣、帽、口罩、手套。

2.4.3接種環(huán)（白鉞金或保格合金，環(huán)徑4?5mm、長度6?10cm）、乙醇燈、乙醇棉球或

碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑲子、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火

柴、記號第、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、實驗記錄紙等。

3消毒液、稀釋劑、試液及培養(yǎng)基

3.1消毒液、稀釋劑及試液。

3.1.10.1%苯扎濕鉉溶液：供洗手、擦拭操作臺面用。

3.1.25%石碳酸溶液：配制后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌吸管用，抑或選用其她

適當(dāng)消毒液。

3.1.3.75%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。

3.1,4.0.9%無菌氯化鈉溶液：取氯化鈉9.0g,加水使溶解成1000ml,121℃滅菌20分

鐘。

3.1.5.司盤-80、單硬脂酸甘油酯、吐溫-80：供非水溶性供試品供試液制備用。

3.1.6.無菌0.1%氯化三苯四氮唾溶液（TTC）：取氯化三苯四氮喋0.1g,加水使溶解成

10mlo

3.1.7.甲基紅批示液：取甲基紅0.1g,加入95%乙醇30（）ml,水適量，使溶解，再加水

至500mlo

3.1.8.V-P試液：①氫氧化鉀試液：取氫氧化鉀40.0g,加水使溶解成100ml；②a-蔡

酚乙醇試液：取a-蔡酚6.0g,加無水乙醇使溶解成100ml。

3.1.9.革蘭染色液：①沙黃染液：取沙黃0.25g,加95%乙醇10mL使完全溶解后，加

水至100ml；②結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫1.0g,加95%乙醇20ml,使溶解，加1%草酸鏤

溶液80ml,混勻。靜置48小時使用，置密閉棕色瓶中儲存；③碘試液：取碘化鉀2.0g,

加水3?5ml使溶解，加入碘片1.0g,使所有溶解后，加水稀釋至300mL置密

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閉棕色瓶中儲存。

3.1.10.中性紅批示液：取中性紅1.0g,研細(xì),加95%乙醇60ml,使溶解，再加水到100mL

變色范疇pH6.8?8.0（紅f黃）。

3.1.11.亞甲藍(lán)批示液：取亞甲藍(lán)0.5g,加水使溶解成

3.1,12.濱麝香草酚藍(lán)批示液：取溟麝香草酚藍(lán)0.4g,加lmol/L氫氧化鈉溶液0.64ml

使溶解，再加水至100ml。變色范疇pH6.0~7.6（黃藍(lán)）。

3.1.13.酸性品紅批示液：以酸性品紅0.5g,加水100ml使溶解，再逐漸加lmol/L氫氧

化鈉溶液16ml,每加1滴均應(yīng)將溶液充分搖勻后再加第二滴，直至溶液呈草黃色；于

沸水內(nèi)保持15分鐘，再靜置2小時，濾過，即得。長處：無色，在倒管內(nèi)初期發(fā)酵易

觀測，不易被還原。變色范疇pH6.0?7.4（紅一黃）。

3.1.P1.曙紅鈉批示液：取曙紅鈉2.0g,加水使溶解成100mL

3.1.15.靛基質(zhì)試液：取對二甲氨基苯甲醛1.0g,加入95%乙靜95mL充分振搖，使完

全溶解后，取濃鹽酸20ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，置

冰箱保存，備用。

3.2培養(yǎng)基

3.2.1.培養(yǎng)基制備及儲存

3,21,1溶化：普通應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷器內(nèi)。加入純化水，隔水加熱以促具溶解，加

熱時應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補足水分。

321.2在使用干燥培養(yǎng)基時，先將純化水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干

粉放入水中，靜置1075分鐘，攪拌，振蕩，或延長時間以增進(jìn)溶解，普通不要加熱，

必要時加熱，但時間不適當(dāng)過長，溫度不適當(dāng)過高，避免某些營養(yǎng)成分被破壞。

321.3校正酸堿度：培養(yǎng)基必要有恰當(dāng)pH值。測定pH值是培養(yǎng)基配制過程中重要環(huán)

節(jié)之一，干燥培養(yǎng)基普通己校正過pH值，用時也必要再驗證。pH值測定期，普通用批

示劑滴入培養(yǎng)基中觀測其顏色變化，或用pH計校正，如與所需pH值不符，可用酸或

堿液加以校正。普通用氫氧化鈉校正弱堿性培養(yǎng)基，高壓滅菌前培養(yǎng)基pH值高0.2左

右，滅菌后基本適當(dāng)。調(diào)節(jié)pH值后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄消。

322培養(yǎng)基分裝：

3.2.2.1液體、半固體培養(yǎng)基普通在高壓滅菌前分裝，約裝試管容積1/3,在滅菌后還要

加入成分液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。

3.222固體培養(yǎng)基普通分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后依照需要分裝平皿

或試管。

平皿：如傾注平皿，應(yīng)在無菌室中放置3?4小時，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱

中倒置30?60分鐘。水蒸氣會自然蒸發(fā)。

斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5,滅菌后趁熱斜放于細(xì)玻璃棒和木

桿上，使成斜度，分裝時注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，避免污染。

制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積1/3,滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待

其凝固后應(yīng)用。

3.2.3培養(yǎng)基滅菌：培養(yǎng)基滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基滅菌時間和壓力，按其

成分不同而定。普通培養(yǎng)基多采用121℃、103.42kPa滅菌15分鐘，但容器和裝量較大

時，可延長至20分鐘。高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，必要逐漸加熱，徹底排除

滅菌器內(nèi)冷空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定壓力和時間，達(dá)到全殺滅微生物目。

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324培養(yǎng)基儲存：保存培養(yǎng)基時間需視培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)限度及杓無污染而定，已制備

好培養(yǎng)基要保存于冷暗處或冰箱中，但由于各種培養(yǎng)基性質(zhì)不同，不也許

固定一種保存期限。制備好平板或試管培養(yǎng)基，為防止水分蒸發(fā)，應(yīng)置于塑料袋內(nèi)，4C

保存，可延長有效期限。微量生化反映管熔封于細(xì)玻管內(nèi)，室溫下可保存1年左右。

3.3注意事項：

331采用干燥培養(yǎng)基時，按闡明配制，應(yīng)對滅菌后培養(yǎng)基pH值進(jìn)行校驗。若為自配培

養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測定，以擬定配制時瓊脂用量。試劑規(guī)格規(guī)定應(yīng)為化

學(xué)純（CP）以上規(guī)格，其中不能具有對細(xì)菌、霉菌、大腸桿菌生長有害抑制物。3.3.2

配制培養(yǎng)基不應(yīng)當(dāng)有沉淀，如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過濾，并應(yīng)于2小時內(nèi)滅菌，避

免細(xì)菌繁殖。

3.3.3培養(yǎng)基分裝量不得超過容器2/3,以免滅菌時溢出。包裝時，塞子必要塞

緊，以免松動或脫落導(dǎo)致染菌。

334配制培養(yǎng)基pH值測定期，其波動范疇?wèi)?yīng)在規(guī)定pH±0.2之內(nèi)，還需注意高壓滅菌

后pH值變化。

3.3.5每批培養(yǎng)基均應(yīng)有配制記錄，涉及名稱、配制量（各種成分用量）、配制者、校對

者、配制日期以及性能和無菌實驗。

336每批培養(yǎng)基在用于樣品分離鑒定之前均應(yīng)作性能實驗，以保證微生物檢查質(zhì)量。性

能實驗須用已知原則菌株達(dá)行預(yù)試，符合規(guī)定方可應(yīng)用。

3.3.7棉塞以普通棉花制作，棉塞松緊應(yīng)適當(dāng)，過松易污染雜菌，過緊影響透氣性；每次

用后需高壓滅菌并隨后烘干，要防塵、防霉；變硬無彈力時需更換。

3.3.8各種試管應(yīng)先配上適當(dāng)棉塞，待高壓滅菌后再分裝培養(yǎng)基，可防止污染。

3.3.9培養(yǎng)基配制時，應(yīng)先將有沉淀物原料如蛋白陳、牛肉膏、鹽類和瓊脂配好，經(jīng)調(diào)節(jié)

pH值、加熱并煮沸溶化后再濾清；濾清時注意趁熱過濾，濾除異物、沉淀后，應(yīng)將蒸

發(fā)失去溶液量按原溶液量加純化水補足。

3310應(yīng)嚴(yán)格遵守各種培養(yǎng)基規(guī)定滅菌溫度和時間，滅菌后培養(yǎng)基不得有混濁現(xiàn)象，每

瓶配制并滅菌后培養(yǎng)基、稀釋劑均應(yīng)在外表清晰標(biāo)明滅菌口期。

3311每批稀釋劑、培養(yǎng)基均應(yīng)有空白實驗，合格后方能使用。

3312滅菌后培養(yǎng)基在冷暗處保存，放置時間不能過長，普通在兩周內(nèi)用完。久存培養(yǎng)

基失水過多、固體干涸變形、液體浮現(xiàn)沉淀、棉塞松弛或脫落者均不得使用。已熔化培

養(yǎng)基應(yīng)一次用完，啟動后不適當(dāng)再用。

3.3.13勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，以免營養(yǎng)成分過度受熱而破壞，應(yīng)用水浴或微波

爐加熱。

4.檢直總則（1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法）

4.1微生物計數(shù)法合用范疇：系用于能在有氧條件下生長嗜溫細(xì)菌和真菌計數(shù)。當(dāng)本法

用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等與否符合相應(yīng)微生物限度原則時，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)

行檢查，涉及樣品取樣量和成果判斷等。除另有規(guī)定外，本法不合用于活菌制劑檢查。

如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡量去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，

應(yīng)確認(rèn)其有效性及對微生物無毒性。供試液制備時如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對

微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑相容性。

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4.2微生物計數(shù)法

4.2.1合用性實驗用菌株（表1）

計數(shù)培養(yǎng)基合用性檢查計數(shù)辦法合用性實驗

實驗黃實驗菌液

株制備需氧菌總數(shù)霉菌和酵母需氧菌總數(shù)霉菌和酵母

計數(shù)菌總數(shù)計數(shù)計數(shù)菌總數(shù)計數(shù)

金黃色葡胰酪大豆陳胰酪大豆陳瓊胰酪大豆陳瓊

萄球菌瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基和胰脂培養(yǎng)基或胰

(Staphylo或胰酪大豆酪大豆陳液體酪大豆陳液體

coccusau腺液體培養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)培養(yǎng)基（MPN

reu基，培養(yǎng)溫度溫度30-35℃法），培養(yǎng)溫度

s)CCM30?35培養(yǎng)時間不超30-35℃,培養(yǎng)

CC(B)C,培養(yǎng)時過3天，接種時間不超過3

26003)間量不不不大于天，接種量不

18?24小時lOOcfu不不大于

lOOcfu

銅綠假單胰酪大豆陳胰酪大豆陳瓊胰酪大豆陳瓊

胞菌瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基和胰脂培養(yǎng)基或胰

(Pseudom或胰酪大豆酪大豆陳液體酪大豆陳液體

onas腺液體培養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)培養(yǎng)基（MPN

aeruginosa基,培養(yǎng)溫度溫度30-35℃法）,培養(yǎng)溫

)30-35℃,培培養(yǎng)時間不超度30-35℃,培

CCMCC養(yǎng)時間18?過3天，接種養(yǎng)時間不超過

(B)24小時量不不不大于3天，接種量不

10104lOOcfu不不大于

lOOcfu

枯草芽胞胰酪大豆豚胰酪大豆膿瓊胰酪大豆陳瓊

桿菌瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基和胰脂培養(yǎng)基或胰

{.Bacill或胰酪大豆酪大豆陳液體酪大豆陳液體

us腺液體培養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)培養(yǎng)基（MPN

subtilis基，培養(yǎng)溫度溫度30-35℃法），培養(yǎng)溫

)30-35℃培養(yǎng)培養(yǎng)時間不超度30-35℃,培

(CMCC(B時間18-24過3天，接種養(yǎng)時間不超過3

)63501)小時量不不不大于天，接種量不不

lOOcfu不大于lOOcfu

白色念珠沙氏葡萄糖胰酪大豆陳瓊沙氏葡萄糖胰酪大豆陳瓊沙氏葡萄糖

菌瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基，培瓊脂培養(yǎng)脂培養(yǎng)基（MPN瓊脂培養(yǎng)

(Candida或沙氏葡萄養(yǎng)溫度基，培養(yǎng)溫法不合用）培基，培養(yǎng)溫

albicans糖液體培養(yǎng)30-35℃培養(yǎng)度20-25°C養(yǎng)溫度30?3度20-25℃

)基，培養(yǎng)溫度時間不超過5培養(yǎng)時間不5°C,培養(yǎng)培養(yǎng)時間不

CCMCC(F)20-25C培養(yǎng)天，接種量不超過5天,時間不超過5超過5天，

98001)時間2-3天不不大于接種量不不天，接種量不不接種量不不

lOOcfu不大于不大于lOOcfu不大于

lOOcfulOOcfu

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黑曲霉沙氏葡萄糖胰酪大豆月東瓊沙氏葡萄糖胰酪大豆陳瓊沙氏葡萄糖

(Asper君瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基，培瓊脂培養(yǎng)脂培養(yǎng)基（MPN瓊脂培養(yǎng)

山WS或馬鈴薯前養(yǎng)溫咬基，培養(yǎng)溫法不合用）培基，培養(yǎng)溫

niger)CC萄糖瓊脂培30-35℃培養(yǎng)度20-25℃養(yǎng)溫度度20-25℃

MCC(F)養(yǎng)基,培養(yǎng)溫時間不超過5培養(yǎng)時間不30-35C培養(yǎng)培養(yǎng)時間不

98003)度20-25℃天，接種量不超過5天，時間不超過5超過5天，

培養(yǎng)時間5不不大于接種量不不天，接種量不接種量不不

?7天，或直lOOcfu不大于不不大于不大于

到獲得豐富lOOcfulOOcfulOOcfu

胞子

注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌和酵母菌總數(shù)時，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基合用性檢育,

檢杳辦法同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基.

4.2.2計數(shù)辦法：涉及平皿法、薄膜過濾法和最也許數(shù)法（Most-Probable-Numbei-

Method,簡稱MPN法）。MPN法用于微生物計數(shù)時精準(zhǔn)度較差，但對于某些微生物污

染量很小供試品，MPN法也許是更適合辦法。供試品檢查時，應(yīng)依照供試品理化特性

和微生物限度原則等因素選取計數(shù)辦法，檢測樣品量應(yīng)能保證所獲得實驗成果可以判斷

供試品與否符合規(guī)定。所選辦法合用性須經(jīng)確認(rèn)。計數(shù)培養(yǎng)基合用性檢查和供試品計數(shù)

辦法合用性實驗供試品微生物計數(shù)中所使用培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行合用性檢查。供試品微生物計

數(shù)辦法應(yīng)進(jìn)行辦法合用性實驗，以確認(rèn)所采用辦法適合于該產(chǎn)品微生物計數(shù)。若檢查程

序或產(chǎn)品發(fā)生變化也許影響檢查成果時，計數(shù)辦法應(yīng)重新進(jìn)行合用性實驗。

4.2.3菌種及菌液制備

4.2.3.1菌種實驗用菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得干燥菌種為第0

代），并采用適當(dāng)菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證明驗菌株生物學(xué)特性。

4.2.3.2計數(shù)培養(yǎng)基合用性檢查和計數(shù)辦法合用性實驗月菌株見（表1）。菌液制備按（表

1）規(guī)定程序培養(yǎng)各實驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、白色

念珠菌新鮮培養(yǎng)物，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適

當(dāng)濃度菌懸液；取黑曲霉新鮮培養(yǎng)物加人3?5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80pH7_0

無菌氯化鈉-蛋白膝緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將被子洗脫。然后，采用適當(dāng)辦法

吸出胞子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80W7.0無菌氯化鈉-蛋白陳

緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適當(dāng)濃度黑曲霉他子懸液。菌液制備后若在室溫下放

置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2?8℃,可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉胞子懸液可

保存在2?8°C，在驗證過貯存期內(nèi)使用。

4.2.4陰性對照

為確認(rèn)實驗條件與否符合規(guī)定，應(yīng)進(jìn)行陰性對照實驗，陰性對照實驗應(yīng)無菌生長。如陰

性對照有菌生K,應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。

4.2.5培養(yǎng)基合用性檢查

微生物計數(shù)用成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基合用性檢

查。按（表1）規(guī)定，接種不不不大于］OOcfu菌液至胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆

陳瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表：規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一實驗

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菌株平行制備2管或2個平皿。同步，用相應(yīng)對照培養(yǎng)基代替被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述實驗。

被檢固體培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)比值應(yīng)在0.5?2范疇內(nèi)，且

菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較，實

驗菌應(yīng)生長良好。

4.3計數(shù)辦法合用性實驗

4.3.1供試液制備

依照供試品理化特性與生物學(xué)特性，采用適當(dāng)辦法制備供試液。供試液制備若需加溫時，

應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45℃。供試液從制備至加入檢查用培養(yǎng)基，不得

超過1小時。慣用供試液制備辦法如下（如果下列供試液制備辦法經(jīng)確認(rèn)均不合用，應(yīng)

建立其她適當(dāng)辦法）

4.3.1.1水溶性供試品取供求品，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液，或PH7.2磷酸鹽

緩沖液，或胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1：：0供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試

液pH值至6?8。必要時，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制

劑也可用混合供試品原液作為供試液。

4.3.1.2水不溶性非油脂類洪試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液，或

PH7.2磷酸鹽緩沖液，或痰酪大豆陳液體培養(yǎng)基制備成1：10供試液。分散力較差供

試品，可在稀釋液中加人表面活性劑如0.1%聚山梨酯80,使供試品分散均勻。若需要，

調(diào)節(jié)供試液PH值至6?8。必要時，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

4.3.1.3油脂類供試品取供求品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與至少量并能使

供試品乳化無菌聚山梨酯80或其她無抑菌性無菌表面活性劑充分混勻。表面活性

劑溫度普通不超過40t：（特殊狀況下，最多不超過45°C）,小心混合，若需要可在

水浴中進(jìn)行，然后加人預(yù)熱稀釋液使成1：10供試液，保溫，混合，并在最短時間內(nèi)

形成乳狀液。必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

4.3.1.4需用特殊辦法制備供試液供試品膜劑供試品取供試品，剪碎，加PH7.0無菌

氯化鈉-蛋白陳緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基，浸泡，振

搖，制成1：10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6?8。必要時，用同一稀釋液

將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品，加人PH6.8無菌

磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑），置45c

水浴中，振搖，使溶解，制成i：io供試液。必要時.，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10

倍系列稀釋。

4.3.1.5氣霧劑、噴霧劑供:式品取供試品，置一20°C或其她適當(dāng)溫度冷凍約1小時，取

出，迅速消毒供試品啟動部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動

容器，使拋射劑緩緩所有釋出。供試品亦可采用其她適當(dāng)辦法取出。用無菌注射器從每

一容器中吸出藥液于無菌容器中混合，然后取樣檢查。

4.3.1.6貼劑供試品取供試品，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿

上，在粘貼面上覆蓋一層適當(dāng)無菌多孔材料（如無菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起。

將解決后貼膏劑放入盛有適當(dāng)體積并具有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀釋

液容器中，振蕩至少30分鐘。必要時，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

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共19頁第9頁

4.3.2.接種和稀釋

按下列規(guī)定進(jìn)行供試液接種和稀釋，制備微生物回收實驗用供試液。所加菌液體積

應(yīng)不超過供試液體積1%。為確認(rèn)供試品中微生物能被充分檢出，一方面應(yīng)選取最低稀釋

級供試液進(jìn)行計數(shù)辦法合用性實驗。

4.3.2.1實驗組取上述制備好供試液，加入實驗菌液，混勻，使每Im1供試液或每張濾

膜所濾過供試液中含菌量不不不大于lOOclu。

4.3.2.2供試品對照組取制備好供試液，以稀釋液代替菌液同實驗組操作。

4.3.2.3菌液對照組取不含中和劑及滅活劑相應(yīng)稀釋液代替供試液，按實驗組操作加入

實驗菌液并進(jìn)行微生?物回收實驗。

4.3.2.4若因供試品抗菌活性或溶解性較差因素導(dǎo)致無法選取最低稀釋級供試液進(jìn)行辦

法合用性實驗時，應(yīng)采用適當(dāng)辦法對供試液進(jìn)行進(jìn)一步解決。如果供試品對微生物生長

抑制作用無法以其她辦法消除，供試液可通過中和、稀釋或薄膜過濾解決后再加入實驗

菌懸液進(jìn)行辦法合用性實驗。

4.4抗菌活性去除或滅活

供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定辦法進(jìn)行微生物計數(shù)。若實驗組菌落數(shù)減

去供試品時照組菌落數(shù)值不大于菌液對照組菌落數(shù)值5(n，可采用卜述辦法消除供

試品抑菌活性。

4.4.1增長稀釋液或培養(yǎng)基體積。

4.4.2加入適當(dāng)中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑(表2)可用于消除干擾物抑菌活性，

最佳在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，實驗中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活

劑對照組，即取相應(yīng)量稀釋液代替供試品同實驗組操作，以確認(rèn)其有效性和對微生物無

毒性。中和劑或滅活劑對照組菌落數(shù)與菌液對照組菌落數(shù)比值應(yīng)在().5?2范疇內(nèi)。

表2常用干擾物中和劑或滅活辦法

干擾物可選用中和劑或滅活辦法

戊二醛、汞制劑亞硫酸氫鈉

酚類、乙醇、醛類、吸附物稀釋法

醛類甘氨酸

季鉞化合物、對羥基苯甲酸、雙卵磷脂

肌:類化合物

季鏤化合物、碘、對羥基苯甲酸聚山梨酯

水銀筑基醋酸鹽

水銀、汞化物、醛類硫代硫酸鹽

EDTA、唆喏酮類抗生素鎂或鈣離子

磺胺類對近基苯甲酸

B內(nèi)酰胺類抗生素B內(nèi)酰胺酶

4.4.3采用薄膜過濾法”

4.4.4上述幾種辦法聯(lián)合使用。若沒有適當(dāng)消除供試品抑菌活性辦法，對特定實驗菌回

收失敗，表白供試品對該實驗菌具備較強(qiáng)抗菌活性，同步也表白供試品不易被該類微生

物污染。但是，供試品也也許僅對特定實驗菌株具備抑制作用，而對其她菌株沒

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共19頁第10頁

有抑制作用。因而，依照供試品須符合微生物限度原則和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢查

成果判斷前提下，應(yīng)采用能使微生物生長更高稀釋級供試液進(jìn)行計數(shù)辦法合用性實驗。

若辦法合用性實驗符合規(guī)定，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級供試液進(jìn)行供試品檢

查。

4.5供試品中微生物回收

表1所列計數(shù)辦法合用性實臉用各實驗菌應(yīng)逐個進(jìn)行微生物回收實驗。微生物回收可采

用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。

4.5.1平皿法平皿法涉及傾注法和涂布法。表1中每株實驗菌每種培養(yǎng)基至少制備2個

平皿，以算術(shù)均值作為計數(shù)成果。傾注法：取照上述“供試液制備”“接種和稀釋”

和“抗菌活性去除或滅活”制備供試液1ml,置直徑9cmm無菌平皿中，注入15?20ml

溫度不超過45c熔化胰酪大豆陳瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。

若使用直徑較大平皿，培養(yǎng)基用量應(yīng)相應(yīng)增長。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定

供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各實驗組平均菌落數(shù)。涂布法：取15?20ml溫

度不超過45C胰酪大豆陳瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注人直徑90mm無菌平皿，凝

固，制成平板，采用適當(dāng)辦法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大平皿，培養(yǎng)基用量也

應(yīng)相應(yīng)增長。每一平板表面接種上述照“供試液制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性

去除或滅活”制備供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條，牛培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品

對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各實驗組平均菌落數(shù)。

4.5.2薄膜過濾法薄膜過濾法所采用濾膜孔徑應(yīng)不不不大于0.45pm,直徑普通為50mm,

若采用其她直徑濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)節(jié)。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對微

生物截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適當(dāng)辦法滅菌。使用時;應(yīng)保證濾膜在過濾先后完

整性。水溶性供試液過濾前先將少量沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾

器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆

蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗

量普通為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上微生物受損傷。取照上述“供

試液制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性去除或滅活”制備供試液適量（普通取相

稱于lg、1ml或10cm2供試品，若供試品中所含菌數(shù)較多時，供試液可酌情減量），加

至適量稀釋液中，混勻，過濾。用適量沖洗液沖洗濾膜。若測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜

菌面朝上貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝

上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。每株實驗菌每種培

養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。

4.5.3MPN法MPN法精密度和精確度不及薄膜過濾法和平皿計數(shù)法，僅在供試品需氧菌

總數(shù)沒有適當(dāng)計數(shù)辦法狀況下使用，本法不合用于霉菌計數(shù)。若使用VPN法，

按下列環(huán)節(jié)進(jìn)行。取照上述“供試液制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性去除或滅

活”制備供試液至少3個持續(xù)稀釋級，每一稀釋級取3份Im1分別接種至3管裝有

9?10ml胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照紐菌數(shù)。必要時可在培養(yǎng)

基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置30?35°C培養(yǎng)3天，逐日觀測各管

微生物生長狀況。如果由于供試品因素使得成果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰

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標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程

共19頁第11頁

酪大豆陳液體培養(yǎng)基或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基，在相似條件下培養(yǎng)1?2天，觀測與否

有微生物生長。依照微生物生長管數(shù)從表3查被測供試品每1g或每Im1中需氧菌總

數(shù)最也許數(shù)。

表3微生物最也許數(shù)檢索表

需氧菌總數(shù)

生長管數(shù)95%置信限

最也許數(shù)

每管含樣品g或m：數(shù)

MPN/g或m1下限上限

0.10.010.001

000<309.4

001309.5

01030.110

0116.11.217

0206.21.217

0309.43.535

1003.60.217

1017.21.217

10211435

1107.41.320

11111435

12011435

12115538

13016538

2009.21.535

20114435

20220538

21015438

21120538

21227994

22021540

22128994

22235994

23029994

23136994

30023594

301389104

3026416181

310439181

3117517190

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標(biāo)題微微生生物物限限度度檢檢查查操操作作規(guī)規(guī)程程

共19頁第12頁

31212030360

31316030380

3209318360

32115030380

32221030400

32329090990

33024090990

331460901980

33211002004000

333>1100

注：表內(nèi)所列檢查量如改用1g（或m1）、0.1g（或in1）和0.0京（或1111）時，表

內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)減少10倍；如改用0.01g（或m1）、0.001g（或m1）fll0.0001g（或

m1）時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)漕長10倍，別的類推。

5.微生物計數(shù)法檢查

5.1計數(shù)辦法合用性實驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時，實驗組菌落數(shù)減去供試品對

照組菌落數(shù)值與菌液對照組菌落數(shù)比值應(yīng)在0.5~2范疇內(nèi)：采用MPN法時，實驗組

菌數(shù)應(yīng)在菌液對照組菌數(shù)95%置信限內(nèi)。若各實驗菌回收實驗均符合規(guī)定，照所用供試

液制備辦法及計數(shù)辦法進(jìn)行該供試品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。辦法合用性

確認(rèn)時，若采用上述辦法還存在一株或多株實驗菌回收達(dá)不到規(guī)定，那么選取回收最接

近規(guī)定辦法和實驗條件進(jìn)行供試品檢查。

5.2供試品檢查

5.2.1檢查量：檢查量即一次實驗所用供試品量（g、m1或cm2）。

普通應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個最小包裝供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢查。

除另有規(guī)定外，普通供試品檢查量為10g或10ml;膜劑為100cm2；貴重藥物、微量包裝藥

物檢查量可以酌減。檢杳時，應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得

少于4丸，膜劑還不得少于4片。

5.2.2供試品檢查按計數(shù)辦法合用性實驗確認(rèn)計數(shù)辦法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌

和酵母菌總數(shù)測定。胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基用于測

定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)陰性對照實驗以稀釋

液代替供試液進(jìn)行陰性對照實驗，陰性對照實驗應(yīng)無菌生長，如果陰性對照有菌生長，

應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)杳。

5.3平皿法

平皿法涉及傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按辦法合用性實驗確認(rèn)

辦法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測定，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。培養(yǎng)和計數(shù)

除另有規(guī)定外，胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板在30?35°C培養(yǎng)3?5天，沙氏葡萄糖瓊

脂培養(yǎng)基平板在2（）?25°C培養(yǎng)5?7天,觀測菌落生長狀況，點計平板上生長所有菌

落數(shù)，計數(shù)并報告。菌落蔓延生K成片平板不適當(dāng)計數(shù)（：點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級

供試液平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平板菌落數(shù)平均值不不

大于15,則兩個平板菌落數(shù)不能相差1倍或以上。菌數(shù)報告規(guī)則需氧菌總數(shù)

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標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程

共19頁第13頁

測定宜選用平均菌落數(shù)不大于300cfu稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選用平均菌落

數(shù)不大于lOOcfu稀釋級，作為菌數(shù)報告根據(jù)。取最高平均菌落數(shù)，算1g、Im1或10cm2

供試品中所含微生物數(shù)，取兩位4效數(shù)字報告。如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最

低稀釋級平板有菌落牛.長，但平均菌落數(shù)不大丁7時，以＜1乘以最低稀

釋倍數(shù)值報告菌數(shù)。

5.4薄膜過濾法

除另有規(guī)定外，按計數(shù)辦法合用性實驗確認(rèn)辦法進(jìn)行供試液制備。取相稱于lg、1nl

或10cm2供試品供試液，若供試品所含菌數(shù)較多時，可取適當(dāng)稀釋級供試液，照辦法合

用性實驗確認(rèn)辦法加至適量稀釋液中，及時過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼

于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)和計數(shù)培養(yǎng)條件和計數(shù)

辦法同平皿法，每張濾膜上菌落數(shù)應(yīng)不超過lOOcfu菌數(shù)報告規(guī)則以相稱于lg、Im1

或10cm2供試品菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以＜1報告菌數(shù)（每張濾膜過

濾lg、bn1或10cm2供試品），或＜1乘以最低稀釋倍數(shù)值報告菌數(shù)。

5.5MPN法

取規(guī)定量供試品，按辦法合用性實驗確認(rèn)辦法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有實驗

管在30?35X：培養(yǎng)3?5天，如果需要確認(rèn)與否有微牛.物生長，按辦法合用性實驗擬定

辦法進(jìn)行。記錄每一稀釋級微生物生長管數(shù)，從表3查每1g或Im1供試品中需氧菌

總數(shù)最也許數(shù)。

5.6成果判斷

需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基上生長總菌落數(shù)（涉及真菌菌落數(shù)霉菌和酵

母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長總菌落數(shù)（涉及細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡

萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生K細(xì)菌使霉菌和酵母菌計數(shù)成果不筲合微生物限度規(guī)定，可使用含

抗生素?（如氯霉素、慶大霉素）沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其她選取性培養(yǎng)基（如玫瑰紅

鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。使用選取性培養(yǎng)基時，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基合用

性檢查。若采用MPN法，測定成果為需氧菌總數(shù)。各品種項下規(guī)定微生物限度原則解

釋如下：

10cfu：可接受最大菌數(shù)為20;

10-cfu：可接受最大菌數(shù)為200;

103cfu：可接受最大菌數(shù)為，依此類推。

若供試品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查成果均符合該品種項下規(guī)定，判供試品符

合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。

6.控制菌檢查法(非無菌生品微生物限度：控制菌檢查法)

6.1控制菌檢查法系用于在規(guī)定實驗條件下，檢查供試品中與否存在特定微生物。

當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等與否符合相應(yīng)微生物限度原則時.，應(yīng)按下列

規(guī)定進(jìn)行檢查，涉及樣品取樣量和成果判斷等“

6.1.1供試品檢出控制菌或其她致病菌時，按一次檢出成果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。

6.1.2供試液制備及實驗環(huán)境規(guī)定同“非無菌產(chǎn)品微牛.物限度

6.1.3檢查：微生物計數(shù)法(通則1105)”。

編碼：KF-SOP-07-13-2

標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程

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6.1.4如果供試品具備抗菌活性，應(yīng)盡量去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑

或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)有效性及對微生物無毒性。供試液制備時如果使用了表面活性劑，應(yīng)

確認(rèn)其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑相