DB31T 1160-2019 畜禽養(yǎng)殖過(guò)程細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

畜禽養(yǎng)殖過(guò)程細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范2019-06-14發(fā)布2019-07-01實(shí)施上海市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布■I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由上海市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由上海市畜牧標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。1下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水CLSIM100抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(PerformanceStandardsforAntimicrobi用于測(cè)試抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑制或殺滅作用的試驗(yàn)。藥定量檢測(cè)某一抗菌藥物對(duì)動(dòng)物源性細(xì)菌的體外抑菌活性的一種系列倍比稀釋濃度的抗菌藥物，通過(guò)加入待檢細(xì)菌的菌懸液，經(jīng)一定數(shù)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析得到MIC值。根據(jù)美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)獲得待檢菌對(duì)某2折點(diǎn)breakpoint用以區(qū)分菌株敏感、中介還是耐藥的最低抑菌濃度或抑菌圈直徑。4設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料見(jiàn)附錄A中A.1。5試劑和培養(yǎng)基除非另有說(shuō)明，水應(yīng)符合GB/T6682三級(jí)水的規(guī)定。5.2氯化鈉溶液無(wú)菌0.85%氯化鈉溶液制備方法見(jiàn)A.2。抗菌藥物種類及貯備液和工作液的制備與保存見(jiàn)A.3。本標(biāo)準(zhǔn)采用的培養(yǎng)基如下：—大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基(麥康凱瓊脂培養(yǎng)基),制備見(jiàn)B.3;—緩沖蛋白胨水，制備見(jiàn)B.4。——沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基(膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基),制備見(jiàn)B.6。 腸球菌顯色培養(yǎng)基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養(yǎng)基),制備見(jiàn)B.7?！?.5%氯化鈉肉湯，制備見(jiàn)B.8。 金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基),制備見(jiàn)B.9。Mueller-Hinton肉湯(M-H肉湯),制備見(jiàn)B.10。本標(biāo)準(zhǔn)中常用的質(zhì)控菌株如下：——大腸埃希菌(Escherichiacoli,ATCC25922); 沙門(mén)氏菌(Salmonella,ATCC35218或CVCC5——糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,ATCC29212);—金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC29213)。質(zhì)控菌株使用的代次應(yīng)為3代～5代，一60℃以下超低溫冰箱保存。6操作步驟滅菌棉拭子一端插入家畜肛門(mén)或家禽泄殖腔1.5cm~2.0cm,旋轉(zhuǎn)2圈~3圈，沾上糞便后，將棉3拭子置于10mL運(yùn)送培養(yǎng)基中。采集的樣品于0℃~4℃保存，并使用密封保溫容器運(yùn)送。糞便拭子保存時(shí)間不超過(guò)48h,生鮮乳樣品保存時(shí)間不超過(guò)24h?！抽T(mén)氏菌屬細(xì)菌分離與鑒定見(jiàn)D.2;—金黃色葡萄球菌分離與鑒定見(jiàn)D.4。將質(zhì)控菌株和測(cè)試菌株分別轉(zhuǎn)種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h以得到單個(gè)純將抗菌藥物貯備液用無(wú)菌0.85%氯化鈉溶液或M-H肉湯按附錄A稀釋至工作濃度，使用同樣稀無(wú)菌棉簽用生理鹽水潤(rùn)濕后，挑取培養(yǎng)18h～24h的純菌落3個(gè)~5個(gè)，轉(zhuǎn)移至含2mL～3mL無(wú)菌0.85%氯化鈉溶液或M-H肉湯的試管中混勻，用濁度儀或標(biāo)準(zhǔn)比濁管校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?細(xì)菌含量約為1×10?CFU/mL～2×10?CFU/mL),將調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木河肕-H肉湯稀釋4將接種完畢的96孔藥敏板置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育16h~20h。7結(jié)果觀察和記錄自培養(yǎng)箱中取出藥敏板，置于襯有黑底板的光線下用肉眼觀察結(jié)果。如果無(wú)法辨別孔中是否有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)可使用觀察裝置幫助進(jìn)行結(jié)果的判讀。在無(wú)菌生長(zhǎng)的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物溶液的濃度如藥敏板上陰性對(duì)照孔內(nèi)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，液體未見(jiàn)渾濁；陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)有敏板結(jié)果有效，可繼續(xù)判讀菌株MIC。如陰性孔或陽(yáng)性孔異常，則該藥敏板結(jié)果無(wú)效。如藥敏板結(jié)果有效，且質(zhì)控菌株MIC在規(guī)定范圍內(nèi)，則本次試驗(yàn)結(jié)果有效，可繼續(xù)判讀樣品藥敏結(jié)果。如質(zhì)控菌株MIC不在規(guī)定范圍內(nèi)，則本次試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。先進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果有效性判斷，在試驗(yàn)結(jié)果有效的前提下，繼續(xù)判讀樣品MIC,判讀完成后進(jìn)行8質(zhì)量控制和結(jié)果判定每次藥敏試驗(yàn)均應(yīng)采用合適的質(zhì)控菌株進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)控菌株藥敏結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定范圍。質(zhì)控菌株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定的前提下，按照附錄F中F.1～F.3標(biāo)準(zhǔn)判定測(cè)試菌株的敏感性—敏感(S)、中介(I)或耐藥(R)。對(duì)于只給出敏感判斷標(biāo)準(zhǔn)的藥物，只報(bào)告其是否敏感即可。9菌種保存及生物安全措施實(shí)驗(yàn)分離的菌株應(yīng)由具備相關(guān)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室妥善保存。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及廢棄物處理應(yīng)嚴(yán)格按照GB19489中的規(guī)定執(zhí)行。5(資料性附錄)設(shè)備和材料A.1設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：——一次性接種環(huán)；——無(wú)菌培養(yǎng)皿；——無(wú)菌試管；——容量瓶；——麥?zhǔn)媳葷峁芑驖岫葍x；——冰箱：0℃~4℃和—60℃以下；——電子天平：感量0.01g,感量0.00001g;——渦旋儀；——生物安全柜；——微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化鑒定試條；——PCR擴(kuò)增儀。A.2無(wú)菌0.85%氯化鈉溶液稱取0.85g氯化鈉溶于100mL蒸餾水中，115℃滅菌30min。A.3抗菌藥物照品或標(biāo)準(zhǔn)品。A.3.2抗菌藥物貯備液的制備與保存：精密稱定抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌愤m量，加入一定量的溶劑制成1000μg/mL(或最高測(cè)試濃度的10倍)的貯備液，置—60℃以下保存，有效期為半年。A.3.3抗菌藥物工作液的制備：測(cè)試的濃度范圍取決于細(xì)菌的種類和抗菌藥物，選擇的范圍應(yīng)覆蓋參考菌株的MIC終點(diǎn)。使用M-H肉湯和兩倍稀釋法將抗菌藥物制成0.03μg/mL～2048μg/mL之間的一系列濃度梯度，具體濃度范圍見(jiàn)表A.1。6表A.1抗菌藥物濃度范圍稀釋濃度范圍/(μg/mL)稀釋濃度范圍/(μg/mL)阿莫西林阿莫西林恩諾沙星四環(huán)素頭孢他定恩諾沙星甲氧芐啶甲氧芐啶多西環(huán)素替米考星乙酰甲喹7(資料性附錄)B.1運(yùn)送培養(yǎng)基運(yùn)輸培養(yǎng)基成分見(jiàn)表B.1。氯化鈉磷酸二氫鈉(NazHPO?·12H?O)氯化鈣0.1g稱取表B.1中各成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至8.4±0.1,分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。B.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分見(jiàn)表B.2。表B.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分蛋白胨牛肉浸膏氯化鈉稱取表B.2中各成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,121℃高壓滅菌15min,冷至50℃,搖勻后傾注平板。8B.3大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基(麥康凱瓊脂培養(yǎng)基)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基成分見(jiàn)表B.3。表B.3麥康凱瓊脂培養(yǎng)基成分明膠胰酶水解物胨(或酪蛋白)氯化鈉中性紅結(jié)晶紫B.3.2制法稱取表B.3中各成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.1±0.2,分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。緩沖蛋白胨水成分見(jiàn)表B.4。表B.4緩沖蛋白胨水成分蛋白胨氯化鈉磷酸二氫鈉(Na?HPO?·12H?O)磷酸二氫鉀(KH?PO?)B.4.2制法稱取表B.4中各成分溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。9B.5氯化鎂-孔雀綠增菌液B.5.1溶液A溶液A成分見(jiàn)表B.5。表B.5溶液A成分氯化鈉磷酸二氫鉀B.5.1.2制法稱取表B.5中各成分加入1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0,加熱至70℃溶解。此溶液使用前在4℃冰箱儲(chǔ)存不超過(guò)24h。B.5.2溶液B溶液B成分見(jiàn)表B.6。表B.6溶液B成分氯化鎂(MgCl2·6H?O)B.5.2.2制法按照表B.6用量將MgCl?·6H?O溶于1000mL蒸餾水中。B.5.3溶液C溶液C成分見(jiàn)表B.7。表B.7溶液C成分蒸餾水按照表B.7將孔雀綠溶于100mL蒸餾水中。溶液可室溫保存于棕色玻璃瓶中。B.5.4完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基成分見(jiàn)表B.8。表B.8完全培養(yǎng)基成分溶液B溶液C按表B.8比例配制，調(diào)節(jié)pH,使滅菌后pH為5.2,分裝于試管中，每管10mL。115℃高壓滅菌B.6沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基(膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基)B.6.1成分膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基成分見(jiàn)表B.9。表B.9膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基成分蛋白胨牛肉浸膏去氧膽酸鈉中性紅稱取表B.9中除中性紅和瓊脂以外各成分溶于400mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.3±0.2,再將瓊脂于600mL蒸餾水中煮沸至完全溶解，兩液合并，加入0.5%中性紅溶液6mL,待冷至50℃,搖勻后傾注平板。B.7腸球菌顯色培養(yǎng)基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養(yǎng)基)膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養(yǎng)基成分見(jiàn)表B.10。表B.10膽汁七葉苷疊氦鈉瓊脂培養(yǎng)基成分牛肉浸膏酵母浸膏牛膽粉氯化鈉疊氮化鈉稱取表B.10中各成分溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.1±0.2,121℃高壓滅菌15min,于45℃~50℃保溫培養(yǎng)基，從保溫開(kāi)始至傾注平板的時(shí)間不應(yīng)超過(guò)4h。B.87.5%氯化鈉肉湯7.5%氯化鈉肉湯成分見(jiàn)表B.11。表B.117.5%氯化鈉肉湯成分蛋白胨牛肉浸粉氯化鈉B.8.2制法稱取表B.11中各成分加熱溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.1,分裝于三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。B.9金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基)Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基成分見(jiàn)表B.12。表B.12Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基成分牛肉膏酵母膏丙酮酸鈉氯化鋰(LiCl·6H?O)B.9.2增菌劑30%卵黃鹽水50mL與通過(guò)0.22μm孔徑濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌的1%的亞碲酸鉀10mL混合，4℃冰箱保存。B.9.3制法稱取表B.12中各成分至1000mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2,分裝每瓶95mL,121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱融化瓊脂，冷至50℃,每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞硒酸鉀增菌劑5mL搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在4℃冰箱儲(chǔ)存不應(yīng)超B.10Mueller-Hinton肉湯(M-H肉湯)B.10.1成分M-H肉湯的成分見(jiàn)表B.13。牛肉浸出粉酪蛋白水解物稱取表B.13各成分加入蒸餾水1000mL,攪拌加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2,分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min,定量(等體積)分裝于滅菌試管中。(資料性附錄)采樣登記表畜禽養(yǎng)殖抗菌藥物使用情況采樣登記表見(jiàn)表C.1。表C.1畜禽養(yǎng)殖抗菌藥物使用情況采樣登記表采樣時(shí)間姓名電話□注射□飲水□拌料□注射□飲水口拌料□注射□飲水□拌料(資料性附錄)D.1大腸埃希菌分離與鑒定棉拭子接種于大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,挑取粉紅色、邊緣光滑的可疑菌落，顯色培養(yǎng)基上純化一代，純化后可疑菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基純化一代。對(duì)已純化的菌落，使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或生化試條進(jìn)行生化鑒定。大腸埃希菌分離與鑒定流程圖見(jiàn)圖D.1。動(dòng)物肛門(mén)或泄殖腔拭子動(dòng)物肛門(mén)或泄殖腔拭子運(yùn)送培養(yǎng)基接種于大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃,培養(yǎng)18h～24h挑取大腸埃希菌可疑菌落純化大腸埃希菌圖D.1大腸埃希菌分離與鑒定流程圖D.2沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌分離與鑒定棉拭子置于緩沖蛋白胨水中，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,取100μL預(yù)增菌液置于10mL氯化鎂-孔雀綠培養(yǎng)基中，42℃±1℃培養(yǎng)22h～24h,隨后將增菌液混勻，接種于沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基，42℃±1℃培養(yǎng)22h～24h,挑取沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基上無(wú)色半透明或粉紅色，菌落中心黑色或幾乎全黑色的可疑菌落，接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基純化一代。對(duì)已純化的菌落，應(yīng)使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或生化試條進(jìn)行生化鑒定。沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌分離與鑒定流程圖見(jiàn)圖D.2?；蛘咄ㄟ^(guò)附錄E的方法進(jìn)行分子生物學(xué)運(yùn)送培養(yǎng)基緩沖蛋白胨水預(yù)增菌，36℃±1℃,培養(yǎng)18h～24h接種氯化鎂一孔雀綠增菌液，42℃±1℃,培養(yǎng)22h～24h生化鑒定PCR鑒定圖D.2沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌分離與鑒定流程圖D.3腸球菌屬細(xì)菌分離與鑒定棉拭子接種于腸球菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,挑取褐色可疑菌落，顯色培養(yǎng)基上純化一代，純化后可疑菌落接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基純化一代。對(duì)于已純化的菌落，使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或生化試條進(jìn)行生化鑒定。腸球菌屬細(xì)菌分離與鑒定流程圖見(jiàn)圖D.3。接種于腸球菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃,培養(yǎng)18h～24h圖D.3腸球菌屬細(xì)菌分離與鑒定流程圖取1mL生鮮乳樣品至9mL?.5%氯化鈉肉湯中，振蕩混勻后36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,將培養(yǎng)物劃線接種到金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,挑取灰黑色至黑色可疑菌落化鑒定。金黃色葡萄球菌分離與鑒定流程圖見(jiàn)11mL生鮮乳+9mL7.5%氯化鈉肉湯，混勻后金黃色葡萄球菌5×TBE緩沖液成分見(jiàn)表E.1。乙二酸四乙酸二鈉用接種環(huán)從營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑選16h～24h的純培養(yǎng)物，置于0.5mL滅菌生理鹽水中，12000r/min離心2min,棄上清液。再加0.5mL滅菌蒸餾水，懸浮并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷卻后以12000r/min離心2min,取上清液為PCR模板。陰性對(duì)照模板為滅菌95℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,64℃退火30s,72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸電壓110V,電泳時(shí)間30min。如果某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶與沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照的條帶在一(資料性附錄)細(xì)菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的判斷標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控范圍F.1大腸埃希菌和沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控范圍見(jiàn)表F.1。表F.1大腸埃希菌和沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控范圍臨床折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)*質(zhì)控菌株MIC范圍SIRβ-內(nèi)酰胺類β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶阿莫西林/克拉維酸4頭孢他啶828四環(huán)素類多西環(huán)素8四環(huán)素84葉酸合成抑制劑一甲氧芐啶/磺胺甲呼唑一恩諾沙星 大腸埃希菌4多肽類4喹噁啉類乙酰甲喹一一一一b“--”表示