傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范 細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)

1傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)本文件適用于傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置中細(xì)菌類傳染病病原體的應(yīng)急檢測。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS233病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則WS288肺結(jié)核診斷下列術(shù)語和定義適用于本文件?？稍谳^短時(shí)間內(nèi)確定目標(biāo)區(qū)域中核苷酸的順序，用于細(xì)菌全基組或病原宏基因測的大規(guī)模并行測序注：又稱“下一代”測序技術(shù)("Next-generation"sequ4實(shí)驗(yàn)室生物安全要求4.1實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)GB19489和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的要求，配備不同類型傳染病感染的個(gè)人防護(hù)裝備，包括但不限于防護(hù)服、手套、外科口罩或醫(yī)用防護(hù)口罩、防護(hù)面屏、防護(hù)帽。防護(hù)服宜每隔4h更換一次。在發(fā)4.2實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)場所、感染性標(biāo)本處置及消毒滅菌等應(yīng)符合WS233中的實(shí)驗(yàn)室生物安全管理2每一批次反應(yīng)過程中應(yīng)至少設(shè)置一個(gè)陰性和陽性對(duì)照，必要時(shí)增加空白對(duì)照。6常用顯微鏡檢查技術(shù)其數(shù)量；觀察標(biāo)本中細(xì)菌動(dòng)力特征(用暗視野顯微鏡觀察)等。6.2.1直接在玻片上涂抹標(biāo)本，涂片應(yīng)薄且均勻。自然干燥或恒溫干燥器上干燥后，經(jīng)甲醇固定或火焰6.2.2革蘭染色脫色時(shí)間因選用不同的脫色劑而異。使用革蘭氏染色儀染色，應(yīng)按照廠家操作說明書抗酸染色鏡檢操作流程應(yīng)按照WS288執(zhí)行。熒光染色顯微鏡檢查步驟如下：a)染色：涂片經(jīng)火焰固定后，滴加金胺“O”染色劑蓋滿玻片，染色30min,流水自玻片一端輕緩沖d)鏡檢：玻片涂膜面向上置于熒光或LED顯微鏡載物臺(tái)，并以卡尺固定后，以低倍鏡搜索發(fā)現(xiàn)疑一般應(yīng)在患者使用抗生素之前采集無菌部位標(biāo)本如血液標(biāo)本直接接種血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，陽性血培養(yǎng)3非無菌部位標(biāo)本，通過直接培養(yǎng)或選擇性增菌培養(yǎng)的方式，針對(duì)不同細(xì)菌采用不同培養(yǎng)基和分離程8分子生物學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)根據(jù)標(biāo)本類型選擇相應(yīng)商品化離心柱法或磁珠法基因組核酸提取試劑盒。選擇非人源性內(nèi)參時(shí)，待提取標(biāo)本中宜加入相應(yīng)的內(nèi)參模板。a)取1接種環(huán)(約2μL～5μL)擴(kuò)大培養(yǎng)物放入裝有500μL純水或TE的1.5mL離心管內(nèi)，混勻；b)100℃加熱10min;d)吸取上清即為PCR模板。8.2.1反應(yīng)體系配制(引物、鏈置換型核酸合成酶、基質(zhì)、模板)后置于指定溫度下(60℃~65℃),經(jīng)一個(gè)步驟即可完成。具體參照相應(yīng)細(xì)菌核酸檢測試劑盒說明書。8.3實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)道)應(yīng)參照相應(yīng)細(xì)菌核酸檢測試劑盒說明書。b)陽性顯示Ct值小于或等于細(xì)菌核酸檢測試劑盒說明書規(guī)定值，且有S形擴(kuò)增曲線。8.4.1根據(jù)PCR儀器和試劑的要求制備反應(yīng)體系，將體系分配到微小分區(qū)或微滴中并封蓋，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用熒光染料或探針監(jiān)測目標(biāo)核酸的擴(kuò)增，配套軟件統(tǒng)計(jì)分析各反應(yīng)中的陽性液滴數(shù)。48.5.1參照相應(yīng)的多病原檢測試劑盒(微流體芯片法)說明書。8.5.3確定各個(gè)病原體靶點(diǎn)陽性擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的標(biāo)本對(duì)符合要求的核酸進(jìn)行文庫構(gòu)建、上機(jī)測序、數(shù)據(jù)分析等。具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照相應(yīng)測序平臺(tái)及試劑盒說明書，根據(jù)應(yīng)急檢測實(shí)際選擇是否執(zhí)行去宿主操作。數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求如下：a)標(biāo)本經(jīng)過高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)，應(yīng)該在去除接頭、低質(zhì)量數(shù)據(jù)和宿主基因組序列后再進(jìn)行下一步分析；b)測序完成后，對(duì)Q20和Q30進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，標(biāo)本測序的堿基質(zhì)量應(yīng)同時(shí)符合：Q201≥9c)每個(gè)標(biāo)本的高質(zhì)量序列(Q20)數(shù)目應(yīng)大于2×10?條，對(duì)于宿主含量較多而又未在核酸提取步驟進(jìn)行去宿主操作的標(biāo)本，數(shù)據(jù)量適當(dāng)增加到4×10?~8×107條。數(shù)據(jù)質(zhì)控后對(duì)標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋，宜選用得到廣泛認(rèn)可的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，包括但不限于FoodandDrugAdministrationdAtabaseforReferenceGradeDataCentreforMicroorganisms(WDCM),Geno于已知物種，數(shù)據(jù)庫中序列相似度95%以上，覆蓋度90%以上。數(shù)據(jù)質(zhì)控后進(jìn)行物種相對(duì)豐度計(jì)算，并記錄計(jì)算方法或軟件。除特殊方法外，應(yīng)將高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)比對(duì)到組裝好的參考基因集或合適的數(shù)據(jù)庫上，按相似度95%以上，覆蓋度90%以上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到基因水平上的相對(duì)豐度分布情況，再將注釋到同一物種和同一屬的分類水平的基因序列相對(duì)豐度進(jìn)行疊5結(jié)果判定規(guī)則如下。a)結(jié)合《人間傳染的病原微生物目錄》或其他相關(guān)的病原微生物目錄篩選出物種注釋中的致病菌和條件致病菌的信息，針對(duì)不同標(biāo)本類型并結(jié)合檢出病原微生物的種類進(jìn)行解讀，確認(rèn)致病微傷口)。正常有菌部位應(yīng)綜合分析檢出細(xì)菌是否為導(dǎo)致感染的致病病原。b)對(duì)于條件致病菌3,應(yīng)綜合考慮臨床表現(xiàn)和物種豐度等信息謹(jǐn)慎進(jìn)行判斷。c)對(duì)于致病菌，當(dāng)種特異性序列數(shù)較低時(shí)(小于3條)一般不考慮為致病病原，但檢出菌為敏感度較低的菌株，如結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，布魯氏菌，諾卡菌等以及烈性傳染病的時(shí)候(包括鼠疫，炭疽等),應(yīng)結(jié)合臨床癥狀考慮感手段予以確認(rèn)或排除。如果疑似暴發(fā)疫情標(biāo)本大部分都報(bào)告相應(yīng)序列且能夠排除標(biāo)本之間或環(huán)境污染時(shí)即可認(rèn)定其為此次疫情的致病菌。e)對(duì)于鑒定出可分離培養(yǎng)的病原菌，應(yīng)按相應(yīng)操作指南對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)。9.1.2實(shí)驗(yàn)完成后按照試劑盒要求的時(shí)間觀察結(jié)果，當(dāng)檢測線和質(zhì)控線均為陽性結(jié)果時(shí)，判定對(duì)9.2酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)應(yīng)細(xì)菌ELISA檢測試劑盒說明書。9.2.2以空白對(duì)照調(diào)零，讀取酶標(biāo)儀器上各孔450nm和(或)492nm等波長的OD值，參照說明書要求酶催化底物液發(fā)光，具體流程參照相應(yīng)細(xì)菌化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒說明書。9.3.2根據(jù)化學(xué)發(fā)光試劑盒的生物參考區(qū)間判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每一批次化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)做質(zhì)控品，或抗體結(jié)合產(chǎn)生肉眼可見凝集反應(yīng)。按照試劑盒要求的時(shí)間觀察結(jié)果，出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)判為陽6[1]GB/T40226—2021環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法[2]WS271—2007感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]WS/T498—2017細(xì)菌性腹瀉臨床實(shí)驗(yàn)室診斷操作指南[4