2020水質(zhì)急性毒性的測定 斑馬魚卵法

水質(zhì)急性毒性的測定斑馬魚卵法目 次前言 ⅱ適用范圍 1規(guī)范性用文件 1術(shù)語和義 1方法原理 2干擾和除 2試劑和料 2儀器和備 3樣品 4試驗步驟 5結(jié)果算與表示 7有效性、感性與密度 7質(zhì)量證和質(zhì)控制 8試驗告 8廢棄處置 8附錄A（資性附錄）斑馬魚相關(guān)育階段 9附錄B（資性附錄）斑馬魚魚馴及維持 10附錄C（資性附錄）產(chǎn)卵盒考圖片 附錄D資料性錄）馬魚卵別 12附錄E（料性錄）24細(xì)胞養(yǎng)板試布局置方案 15附錄F（資料附錄）推薦的據(jù)記錄表 16附錄G資料性錄）式法計算EC50 18i水質(zhì)急性毒性的測定斑馬魚卵法適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水質(zhì)急性毒性的斑馬魚卵法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水的急性毒性測定。標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6920 水質(zhì)值的測定玻璃電極法GB/T13267 （）HJ91.1 HJ506 水質(zhì)溶解氧的測定電化學(xué)探頭法HJ/T91 HJ/T164 下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1魚卵fishegg指處于卵膜破裂前整個發(fā)育階段的卵細(xì)胞，斑馬魚卵相關(guān)發(fā)育階段參見附錄A。3.2稀釋倍數(shù)dilutionlevel原水樣占稀釋后水樣總體積分?jǐn)?shù)的倒數(shù)，一般用D來表示。例如，水樣未稀釋，則稀釋倍數(shù)D=1；取250ml水樣稀釋至1000ml（即體積分?jǐn)?shù)為25%），則稀釋倍數(shù)D=4。3.3最低無效應(yīng)稀釋倍數(shù)lowestineffectivedilution測試中不產(chǎn)生測試效應(yīng)的最低稀釋倍數(shù)，本標(biāo)準(zhǔn)指不少于90%魚卵存活時水樣的最低稀釋倍數(shù)，用LID表示。3.4半數(shù)效應(yīng)濃度EC50指暴露48h后使50%斑馬魚卵產(chǎn)生效應(yīng)的原水樣占稀釋后水樣總體積的百分?jǐn)?shù)，用EC50表示。本標(biāo)準(zhǔn)中EC50即半數(shù)致死濃度LC50。13.5參比物質(zhì)referencesubstance測試中，用于驗證方法敏感性的已知陽性對照物質(zhì)，如本標(biāo)準(zhǔn)中3,4-二氯苯胺。方法原理使用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在微孔板對照、陰性對照和陽性對照控制的條件下，將4-細(xì)胞期～128-26℃±1EC50（7.8）種魚3.5cm6月～246B。魚卵確保試驗魚卵受精率≥70%，處于4-細(xì)胞期～128-細(xì)胞期（見附錄A）。試劑6.5～8.510μS/cm的要求。2O）。2O）。NaHCO3)。（KCl）。3,4-（C6H5Cl2N），優(yōu)級純。ρ（HCl）=1.19。2c（HCl）=0.1。量取8.3ml鹽酸（6.2.7），用水定容至1000ml。c（NaOH）=0.1。稱取4g氫氧化鈉（6.2.1），溶于少量水中，用水定容至1000ml。3,4-ρ（C6H5Cl2N）=100。稱取0.05g3,4-二氯苯胺（6.2.6），溶于少量標(biāo)準(zhǔn)稀釋水（6.2.16）中，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水（6.2.16）500247.06個月。3,4-ρ（C6H5Cl2N）=3.7。3.73,4-（6.2.10）（6.2.16）1008.2.126℃±12O）=11.76。稱取11.76g氯化鈣（6.2.2），溶于少量水中，用水定容至1000ml?？蓛Υ?個月。2O）=4.93。稱取4.93g硫酸鎂（6.2.3），溶于少量水中，用水定容至1000ml。可儲存6個月。ρ（NaHCO3）=2.52。稱取2.52g碳酸氫鈉（6.2.4），溶于少量水中，用水定容至1000ml?？蓛Υ?個月。ρ（KCl）=0.22。稱取0.22g氯化鉀（6.2.5），溶于少量水中，用水定容至1000ml?？蓛Υ?個月。。將氯化鈣儲備液（6.2.12）、硫酸鎂儲備液（6.2.13）、碳酸氫鈉儲備液（6.2.14）和氯化鉀儲備液（6.2.15）四種儲備液各25ml混合，用水定容至1000ml。7.1冷藏采樣箱：2℃～8℃；0～140.10mg/L～200.130×；7.5冰箱：冷藏室2℃～8℃；冷凍室≤-18℃；26℃±1℃；2.5市售；20cm×10C），7.10溫度計：0℃～50℃；533樣品1000（按照HJ91.1HJ/T91HJ/T164水樣采集后，立即于2℃～848（≤-18℃）1000500ml～7002個月。溫度252℃～8pH按照GB/T6920方法測定水樣pH值。當(dāng)pH值＜6.5或pH值＞8.5時，使用鹽酸溶液（6.2.8）或氫氧化鈉溶液（6.2.9）調(diào)節(jié)水樣pH值至6.5～8.5，盡量減少酸堿調(diào)節(jié)液的用量，以減少對水樣濃度的影響。測定并記錄調(diào)節(jié)后的水樣pH值，按后續(xù)步驟進行水樣測定。當(dāng)pH值的影響需要反映在試驗結(jié)果中或者調(diào)節(jié)pH值會引起水樣物理變性或化學(xué)反應(yīng)時，則不調(diào)節(jié)水樣pH值。根據(jù)水樣測定的實際需求，也可對pH值調(diào)節(jié)前后的水樣同時開展試驗比較。HJ506（9.3）450%359.3～9.6100%～0%LID為保證最高稀釋倍數(shù)水樣魚卵存活率≥90%、最低稀釋倍數(shù)水樣魚卵存活率盡可能＜490%，一般選擇連續(xù)的4個～5個（魚卵存活率與水樣濃度的大致對應(yīng)關(guān)系已知時選2個～3個）稀釋倍數(shù)水樣，水樣的稀釋參照表1。表1水樣的稀釋數(shù)D原水樣占稀釋后水樣總體積分?jǐn)?shù)（%）形成的稀釋水樣稀釋水樣的組成（ml）所需標(biāo)準(zhǔn)稀釋水所需水樣體積所得稀釋水體積1100.010原水樣200200250.02倍稀釋水樣100原水樣100200333.03倍稀釋水樣140原水樣70210425.04倍稀釋水樣1002倍稀釋水樣100200616.76倍稀釋水樣1003倍稀釋水樣100200812.58倍稀釋水樣1004倍稀釋水樣100200128.312倍稀釋水樣1006倍稀釋水樣100200166.216倍稀釋水樣1008倍稀釋水樣100200244.224倍稀釋水樣10012倍稀釋水樣100200323.132倍稀釋水樣10016倍稀釋水樣100200………………EC50100%0%（一般≤2）58.2.126℃±1試驗步驟配種2/312（7.6）按以上步驟至少進行3組種魚的配種。（6.2.16）2545粒按照附錄D.170%3E2。60（7.4）4-～128-（（（7.8）1以上操作過程應(yīng)在魚卵（9.2）靜置45min后60min內(nèi)完成。（7.8）（7.6）Bh暴露試驗。（a）魚卵卵黃囊外側(cè)胚胎中后部，無體節(jié)者為體節(jié)未形成。尾部未分離正常發(fā)育的魚卵，胚胎的尾部會伸長，與卵黃囊相分離。若無，則表明尾部未分離。若48h后，胚胎尾部分離程度與24h時相比未有明顯變化，同樣也判定為尾部未分離。無心跳將上述暴露試驗的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板（7.8）置于倒置顯微鏡或體視顯微鏡（7.4）下按表2要求進行魚卵鏡檢。24h48h6表2魚卵鏡檢觀測要求測試終點卵凝結(jié)體節(jié)未形成尾部未分離無心跳觀測方式顯微鏡或肉眼顯微鏡顯微鏡顯微鏡觀測時間暴露24h+++-暴露48h++++注：“+”表示觀測、判斷并記錄，“-”表示無需此觀測。每批水樣試驗時，按附錄E試驗布局及9步驟進行對照試驗。以標(biāo)準(zhǔn)稀釋水（6.2.16）為水樣進行微孔板對照試驗。陰性對照以標(biāo)準(zhǔn)稀釋水（6.2.16）為水樣進行陰性對照試驗。陽性對照以3,4-二氯苯胺工作液（6.2.11）為水樣進行陽性對照試驗。98.2.180%2626℃±1℃。90%的結(jié)果LID=2。EC50G1位。六家實驗室對陰性對照水樣（6.2.16標(biāo)準(zhǔn)稀釋水）進行了6次重復(fù)測定：存活率介于90%～100%。（6.2.113,4-640%～60%。六家實驗室分別對陰性對照水樣（6.2.16標(biāo)準(zhǔn)稀釋水）、ρ=1.3mg/L、ρ=3.7mg/L、ρ=6.3mg/L3,4-760.0%～5.8%4.5%～8.5%、9.7%～18.1%1.8%、3.5%、13.6%12.9%、15.5%、17.1%12.7%、16.8%、23.4%；后者魚卵10.6%。（65.3%～5.5%1.9%14.5%、14.8%14.2%、14.0%。六家實驗室對陽性參比物質(zhì)3,4-二氯苯胺（EC50=3.1mg/L）進行了斑馬魚卵急性毒性EC5067.3%0.91.2。培養(yǎng)48h后，微孔板對照組魚卵不得死亡，否則相應(yīng)多孔細(xì)胞培養(yǎng)板所對應(yīng)的數(shù)據(jù)無效。進行試驗。培養(yǎng)48h后，陰性對照組魚卵存活率≥90%；陽性對照培養(yǎng)48h后，陽性對照組魚卵死亡率＞10%。試驗報告要求包括但不限于以下幾個信息：a）樣品的名稱、性質(zhì)、來源、保存方法及保存時間；b）試驗前樣品的pH值、溶解氧濃度及前處理方法；c）e）（50%）303,4-8附錄A（資料性附錄）斑馬魚卵相關(guān)發(fā)育階段合子期1-細(xì)胞期卵裂期4-細(xì)胞期卵裂期8-細(xì)胞期囊胚期128-細(xì)胞期囊胚期球形囊胚期穹頂原腸期30%外包原腸期75%外包原腸期尾芽體節(jié)期6體節(jié)體節(jié)期18體節(jié)原基期孵化期幼魚9附錄B（資料性附錄）斑馬魚種魚馴養(yǎng)及維持1周（可GB/T13267）。用水使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水（6.2.16）（NaCl300μS/cm～500μS/cm水質(zhì)水中不應(yīng)含有余氯，溶解氧飽和度應(yīng)至少保持在80%，pH值介于6.5～8.5。水溫26℃±1℃。光照16h/8、14h/10h12h/12h的光/540左右。負(fù)荷保證每尾種魚1g/L～1.5g/L水的活動空間。餌料以市售豐年蟲卵為種魚餌料，按所購商品說明孵化蟲卵后喂食。6月～241.5周～210附錄C（資料性附錄）產(chǎn)卵盒參考圖片cm

20cm

底部格柵產(chǎn)卵盒俯視圖1cm1cm雄魚7.5cm雌魚2.5cm斑馬魚配種1cm1cm7.5cm雄魚雌魚雄魚2.5cm魚卵斑馬魚產(chǎn)卵及魚卵收集圖C.1 產(chǎn)卵示意圖11附錄D（資料性附錄）斑馬魚卵鑒別肉眼觀察下“發(fā)白、不透明、空殼”的魚卵為未受精卵。正常魚卵未受精魚卵圖D.1 受精卵眼鑒別 發(fā)白、不透明魚卵空殼魚卵胚胎不發(fā)育的魚卵圖D.2 受精卵微鏡鑒別產(chǎn)卵及魚卵初篩（9.2）步驟中，轉(zhuǎn)移至結(jié)晶皿并靜置45min后的受精魚卵顯微鏡下分裂異常的情況鑒別如下圖。分裂正常的情況參考附錄A。12 卵膜破裂的魚卵有囊泡的魚卵分裂異常的魚卵發(fā)育不對稱的魚卵無卵膜的魚卵圖D.3 裂異常卵顯微鑒別正常的魚卵凝結(jié)的魚卵圖D.4 凝結(jié)鑒別D.2.2體節(jié)未形成體節(jié)已形成體節(jié)未形成圖D.5 節(jié)未形鑒別13D.2.3尾部未分離尾部分離尾部未分離圖D.6 部未分鑒別D.2.4無心跳注：圖中箭頭所指為斑馬魚心臟所在位置，若未觀測到該處有節(jié)律的震動，則表明無心跳。圖D.7 卵無心鑒別14附錄E（資料性附錄）24孔細(xì)胞培養(yǎng)板試驗布局設(shè)置方案陽性對照（3.7mg/L3,4-二氯苯胺）圖E.1 24孔細(xì)胞養(yǎng)板試布局設(shè)方案15附錄F（資料性附錄）推薦的數(shù)據(jù)記錄表樣品類別□地水 下水 生污水 □業(yè)水采樣時間 月 日試驗時間 年 至 年 ： 儀器名稱及型號儀器編號分析方法名稱及編號樣品pH值（）是否需調(diào)節(jié)□是值）□否樣品溶解氧濃度（mg/L）標(biāo)準(zhǔn)稀釋水溶解氧濃度（mg/L）3,4-二氯苯胺工作液溶解氧濃度（mg/L）樣品溫度（℃）3,4-二氯苯胺工作液溫度（℃）種魚組號123………產(chǎn)卵量（粒）受精率（%）結(jié)果表示最無應(yīng)釋度LID= EC50= 置區(qū)= 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制陰對存率 %是否滿足質(zhì)控要求（存活率≥90%）□是 □否陽對死率 %是否滿足質(zhì)控要求（死亡率＞10%）□是 □否人員

核員

審人 16孔細(xì)胞培養(yǎng)板水樣稀釋倍數(shù)/水樣稀釋濃度/陰、陽性對照暴露時間測試效應(yīng)（○卵凝結(jié)、△體節(jié)未形成、∞尾部未分離、×無心跳）/（%）微孔板對照水樣1D=（或水樣百分比濃度或陰、陽性對照）24hA1A2A3A4A5A6B1B2B3B4B5B648hA1A2A3A4A5A6B1B2B3B4B5B6D=（或水樣百分比濃度或陰、陽性對照）24hC1C2C3C4C5C6D1D2D3D4D5D648hC1C2C3C4C5C6D1D2D3D4D5D6…………24hA1A2A3A4A5A6B1B2B3B4B5B648hA1A2A3A4A5A6B1B2B3B4B5B6……24hC1C2C3C4C5C6D1D2D3D4D5D648hC1C2C3C4C5C6D1D2D3D4D5D6…………24hA1A2A3A4A5A6B1B2B3B4B5B648hA1A2A3A4A5A6B1B2B3B4B5B6……24hC1C2C3C4C5C6D1D2D3D4D5D648hC1C2C3C4C5C6D1D2D3D4D5D6備注人員

核員

人員 17附錄G（資料性附錄）寇式法計算EC50EC50計算寇式法計算EC50要滿足下列條件：a）每個稀釋水樣濃度實驗組的動物數(shù)要相同；b）各實驗組稀釋水樣濃度要按等比級數(shù)分組；100%0%計算公式如下：lgEC50

Xk

uud(im

p3pmpu)i 4

（G.1）式中：Xk——參與計算的稀釋水樣最大濃度的對數(shù)值；d——稀釋水樣相鄰濃度比值的對數(shù)或相鄰兩組濃度的對數(shù)差；pi——參與計算的各稀釋水樣濃度組的死亡率（以小數(shù)表示）；pm），Pm≤1，當(dāng)試驗數(shù)1