DB22-T3601-2023-人參銹腐病菌分子檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法-吉林省

ICS65.020.20CCSB1622吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T3601—2023人參銹腐病菌分子檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法DetectionofIlyonectriarobustacausingginsengrustyrootrotbyquantitativereal-timePCR吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3601—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林參王植?？萍加邢薰?。本文件主要起草人：陳長(zhǎng)卿、姜云、高潔、徐懷友、盧寶慧、楊麗娜、姜伊琳。IDB22/T3601—2023人參銹腐病菌分子檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法1范圍本文件確立了人參銹腐病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測(cè)方法，給出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)原理，規(guī)定了試劑和材料、儀器設(shè)備、樣品采集與制備、分析步驟、結(jié)果判定、廢棄物處理和防止污染的措施。本文件適用于人參根和土壤中銹腐病菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T28067甘蔗黃葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法3術(shù)語(yǔ)和定義一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方4根據(jù)人參銹腐病強(qiáng)壯土赤殼菌I.robusta組蛋白Histone基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。利用熒光信號(hào)伴隨目的PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)的原理，收集PCR擴(kuò)增過(guò)程的熒光信號(hào)值。隨著PCR擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，根據(jù)Ct值判斷供試樣品是否含有人參銹腐病強(qiáng)壯土赤殼菌。51DB22/T3601—2023通用要求除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。試劑5.2.1水，GB/T6682，一級(jí)。5.2.2植物基因組DNA提取試劑盒。5.2.3土壤總DNA提取試劑盒。5.2.45.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒。引物引物序列上游引物：5′-CCGCCGACCTGACCTGACCGTCCGCC-3′，下游引物：5′-ATGATGTTTGATGCGAGACGTAA-3′。5.3.2引物配制引物用水稀釋成10μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?儀器設(shè)備天平：感量0.001g。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：激發(fā)/檢測(cè)波長(zhǎng)范圍350nm～750nm，可用熒光染料（SYBRGreenⅠ）；升降溫速度≥3.0℃/s；均一性≤±0.5℃；準(zhǔn)確性≤±0.3℃；溫度范圍4℃～100℃。離心機(jī)：離心轉(zhuǎn)速12000rpm以上。微量移液器：0.1μL～2.5μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。恒溫水浴鍋。72DB22/T3601—2023無(wú)菌一級(jí)水。樣品采集與制備7.2.1人參采集新鮮人參根，裝入密封袋，置于冰盒中，在實(shí)驗(yàn)室用研磨機(jī)將參根打碎，充分混合，4℃保存不超過(guò)12h，也可-80℃長(zhǎng)期保存。7.2.2土壤每25m人參田塊采用梅花形采樣法，不少于5點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)取人參根際土壤樣品50g，裝入密2封袋，充分混合，置于冰盒中，4℃保存不超過(guò)12h，也可-80℃長(zhǎng)期保存。8分析步驟基因組DNA提取準(zhǔn)備人參根樣品和土壤樣品，參照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明要求提取基因組DNA。采用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA濃度和純度。當(dāng)DNA濃度為100ng/μL～200ng/μL，A260/A280比值為1.8～2.0之間時(shí)，DNA模板適宜熒光定量PCR擴(kuò)增。用無(wú)菌一級(jí)水將模板DNA濃度稀釋成50ng/μL用于熒光定量PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系試劑2×SYBRGreenMix正向引物（10μmol/L）反向引物（10μmol/L）DNA模板擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，空白對(duì)照和陰性對(duì)照的熒光曲線平直或低于陽(yáng)性對(duì)照熒光值的15%，表明反應(yīng)體系工作正常。否則，表明PCR反應(yīng)體系不正常，應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)。3DB22/T3601—20239結(jié)果判定與表述結(jié)果判定在PCR反應(yīng)體系正常工作的前提下，Ct值＞30為陰性，≤30為