第2章 沉淀法課件

純化方法第2章沉淀法沉淀法色譜法電泳法第2章沉淀法第二章沉淀法第2章沉淀法第一節(jié)

基本原理與沉淀類型一、基本原理二、制備蛋白質三、制備核酸第2章沉淀法一、基本原理沉淀法也稱溶解度法。基本原理：根據(jù)各種物質的結構差異來改變?nèi)芤旱哪承┬再|（如：pH、極性、離子強度、金屬離子等)，從而使抽提液中有效成分的溶解度發(fā)生變化。第2章沉淀法二、制備蛋白質蛋白質是穩(wěn)定的膠體溶液。其原因有二：水化膜的存在同性電荷的相互排斥作用第2章沉淀法蛋白質沉淀方法鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法蛋白質沉淀法聚乙二醇沉淀法選擇性沉淀法結晶沉淀法第2章沉淀法1．

鹽析法鹽溶(salting-ineffect)：蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度隨鹽濃度的升高而上升。鹽析(salting-outeffect)：當鹽濃度增高到一定數(shù)值時，蛋白質溶解度又逐漸下降，直到蛋白質析出。第2章沉淀法鹽析原理示意圖第2章沉淀法鹽析一般操作步驟：部分雜質“鹽析”，有效成分“鹽溶”離心分離得上清液有效成分等物質“鹽析”，部分雜質“鹽溶”離心收集沉淀物初步純化的有效成分物質第2章沉淀法①

鹽的選擇

蛋白質沉淀，常選用硫酸銨。優(yōu)點：1.

溶解度大，對溫度不敏感。水溫25℃，硫酸銨的飽和溶解度為769g(4.1M)

水溫為0℃，其飽和溶解度為679g(3.9M)；2.

分級效果好。去雜75%以上；3.

有穩(wěn)定蛋白質結構的作用。經(jīng)2-3M硫銨鹽析的蛋白可置低溫保存1年以上；缺點：繼續(xù)純化時，需脫鹽。（1）鹽分級沉淀第2章沉淀法②硫酸銨鹽析A．固體法B．飽和溶液法C．透析法第2章沉淀法第2章沉淀法（2）

脫鹽方法：凝膠過濾法、透析法第2章沉淀法第2章沉淀法2．

有機溶劑沉淀法有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：1、與鹽溶液一樣具有脫水作用，2、有機溶劑的介電常數(shù)比水小，導致溶劑的極性減小。常用的有機溶劑是甲醇、乙醇和丙酮。第2章沉淀法注意：①低溫操作有機溶劑預冷至一10℃，操作在低溫進行。②中性鹽的作用宜在稀鹽溶液或低濃度緩沖液中進行。③多價陽離子的作用有些蛋白質和多價陽離子(如Zn2+、Cu2+等)能結合形成復合物，致使蛋白質在有機溶劑中的溶解度降低。第2章沉淀法3．

蛋白質沉淀法(1)

堿性蛋白質如：魚精蛋白(2)

凝集素如：植物凝集素(3)重金屬第2章沉淀法4．

聚乙二醇沉淀法聚乙二醇〔ployethyleneglycol,PEG〕和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發(fā)生沉淀作用。沉淀條件溫和，不易引起蛋白質變性，而且沉淀較完全，因此應用范圍頗廣。但是，它也受各種因子如pH、離子強度、蛋白質濃度以及聚合物分子量的影響。第2章沉淀法5．

選擇性沉淀法例如：從酵母菌細胞中純化醇脫氫酶時就采用了改變溫度的選擇性沉淀法。將酵母干粉加磷酸氫二鈉溶液于37℃水浴保溫2小時室溫攪拌三小時。離心收集上清液，升溫至55℃，保持20分鐘后，迅速冷卻，離心去除熱變性蛋白。上清液即為熱穩(wěn)定的醇脫氫酶溶液。根據(jù)蛋白質在不同物理化學因子作用下穩(wěn)定性不同的特點。第2章沉淀法酵母干粉＋磷酸氫二鈉離心收集上清液室溫攪拌3小時37℃，2小時熱穩(wěn)定的醇脫氫酶溶液。離心得上清55℃，20分鐘，迅速冷卻第2章沉淀法6．

結晶沉淀法蛋白質沉淀：晶體沉淀無定形沉淀(非晶體)當某一純蛋白質溶液的濃度達到較高(5%-30％)水平時．只要條件適合，就能產(chǎn)生一定形狀的結晶。當?shù)鞍兹芤褐谢煊须s質時，即使條件適合、也得不到整齊的結晶，或無結晶形成。因此，用顯微鏡觀察結晶的有無及形狀，也可作為判斷提純物質純化程度的一種方法。第2章沉淀法三、制備核酸第2章沉淀法

核酸的分離與純化

就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要對象，所以核酸的分離與提取是研究中很重要的基本技術。核酸樣品的質量將直接關系到實驗的成敗。第2章沉淀法核酸的分類DNA

主要存在于細胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質粒DNA。

RNA

存在于細胞質中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。第2章沉淀法核酸制備的一般原則分離純化核酸總的原則：①應保證核酸一級結構的完整性；②排除其它分子的污染。核酸純化應達到的要求：①核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。第2章沉淀法核酸制備的一般原則核酸制備時應注意的事項:①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學因素對核酸的降解。pH4-10③減少物理因素對核酸的降解。機械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。第2章沉淀法核酸制備的一般原則核酸制備的步驟：破碎細胞提取純化第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸酶的抑制和抑制劑

降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當然，幾個條件并用更好。對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設法抑制RNase更重要。第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理DNase抑制①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理RNase抑制①操作要帶手套。②所有器皿要嚴格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的去垢劑

核酸本身帶負電荷，結合帶正電荷的蛋白質。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂；

2．溶解核糖體上面的蛋白質，使其解聚，將核酸釋放出來；

3．對RNase、DNase有一定的抑制作用。第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的去垢劑

SDS

脫氧膽酸鈉

4-氨基水楊酸鈉萘-1.5-二磺酸鈉三異丙基萘磺酸鈉第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的蛋白質變性劑

蛋白質變性劑的作用：

1.使蛋白質變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。

2.使蛋白質變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。

3.某些蛋白質變性劑也有抑制RNase活性和破裂細胞的作用。

第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的蛋白質變性劑

苯酚氯仿鹽酸胍

DEPC第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的酶制劑

DNaseRNase

蛋白酶K

溶菌酶

第2章沉淀法核酸樣品的保存

核酸保存的主要條件是溫度和介質

溫度：

4℃最佳和最簡單

-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存

-20℃保存

保存介質：

TE緩沖溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0

第2章沉淀法第二節(jié)離心分離技術

離心分離技術是借助于離心機旋轉所產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質顆粒的沉降系數(shù)、質量、密度及浮力等因子的不同，而使物質分離的技術。第2章沉淀法一、離心機的種類與用途按用途分：分析用、制備用、分析－制備用按結構特點分：管式、吊籃式、轉鼓式和碟式按離心機轉速分：常（低）速、高速、超速第2章沉淀法1.常速離心機又稱低速離心機最大轉速：8000rpm相對離心力：＜1×104g主要用途：分離細胞、細胞碎片、培養(yǎng)基殘渣等固形物及粗結晶等較大的顆粒。RCF=1.12×10-5×r×n2

RCF=相對離心力

r=旋轉半徑（厘米）n=每分鐘轉數(shù)第2章沉淀法2.高速離心機轉速：1×104－2.5×104rpm相對離心力：1×104－10×105g主要用途：分離各種沉淀物、細胞碎片、較大的細胞器等高速冷凍離心機第2章沉淀法3.超速離心機轉速：2.5×104－8×104rpm相對離心力：5×105g第2章沉淀法二、離心分離方法的選擇離心分離的方法可分為二類：

1.差速離心

2.密度梯度離心

第2章沉淀法原理：采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法，稱為差速離心法。當以一定離心力在一定的離心時間內(nèi)進行離心時，在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在大離心力的條件下進行離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的“沉淀”，如此，多次離心處理，即能把液體中的不同沉降速度的顆粒分批分離出來。常用于分離大小和密度相差較大的顆粒。1、差速離心法第2章沉淀法第2章沉淀法2.密度梯度離心

原理：樣品在密度梯度介質中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質分離的一種區(qū)帶分離方法。每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的介質密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在