3.2基因工程的基本操作程序 課件高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

H

的燕四騙花楷量通道法用限制酶切斷DNA用連接酶連接目的基因連接酶3.2基因工程的基本操作程序DNA合

成

儀

顯微注射技術(shù)二、構(gòu)建基因表達(dá)載體1.酶切·

同種限制酶·

防止倒連、自連

→

兩端選擇兩種限制酶·

防止切斷目的基因等

→載體和目的基因選同尾酶·

注意：限制酶特性能被限制性內(nèi)切酶特異性

識(shí)別的切割部位都具有回文序列

：限制酶所識(shí)別序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無論

是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可

以找到一條中心軸線，中軸線

兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的

,稱為回文

序列

在切割部位，

一條鏈正

向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。EcoRIc-十-T

A-A-c

工HindlllT-T-cG-A-A—G-G-A-C-C-T-

A

GTaqlA-G

c-(1)限制酶的識(shí)別序列BamHI2.連接·DNA連接酶④構(gòu)建基因表達(dá)載體

⑤大腸桿菌

88無菌牙簽

·菌落一乙含青霉獻(xiàn)和四環(huán)素含四環(huán)素含四環(huán)素培養(yǎng)、分離純化內(nèi)人垂體①

人生長(zhǎng)激素mRNA組

織

②cDNA③人生K

激

素基

因EroRIPstlHindlAep淅切制后的質(zhì)粒3.鑒定·OPCR

法(注意引

物的設(shè)計(jì))·

自雙抗生素抗性基

因鑒定·

*測(cè)序法火腸桿菌

甲人生長(zhǎng)激素Tef1(-)orinp2)pBLUE-T2984bporiPGEM-34轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中加X-galIPTG菌落藍(lán)色質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)整合在lacz

基因中，在多克隆

位點(diǎn)插入外源目的基因，破

壞了lacZ

基因的結(jié)構(gòu)，大

腸桿菌形成白色的克隆。否則形成藍(lán)色克隆。laczPnPkpnlxholSallHincllHindlIEcoRVEcoRlTAcloning

siteEcoRIPstlSmalBamHSpelxbalNotlSacSacl培養(yǎng)基中加X-galIPTG典型例題轉(zhuǎn)化(transformation)是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表

達(dá)的過程。農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。農(nóng)桿菌細(xì)

胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將

Ti

質(zhì)粒上的T-DNA

(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到

被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色

體DNA

上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這種特點(diǎn)，如果將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA

中，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。根據(jù)受體植物的不同，所用的具體轉(zhuǎn)化方法有

所區(qū)別。例如，可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)

桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得

種子，再進(jìn)行篩選鑒定等。隨著轉(zhuǎn)化方法的突

破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植

物也取得了成功。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞資料卡農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.

將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法一特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多

數(shù)單子葉植物沒有感染能力。Ti

質(zhì)粒上的T-DNA

可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，

并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA

上。Ti質(zhì)粒、目的基因

構(gòu)建

轉(zhuǎn)入

導(dǎo)入植物細(xì)胞植物細(xì)胞

表達(dá)

染色DNA新性狀注意：大多基因表達(dá)載體在受體

細(xì)胞內(nèi)是獨(dú)立存在

的!Ti

質(zhì)粒農(nóng)桿葡合轉(zhuǎn)化過程：

具有趨化性(酚)表達(dá)載體農(nóng)桿

菌插入兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti

質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA

上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti

質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。將目的基因插入

染

色

體

的DNA中構(gòu)建基因表現(xiàn)出新性植物組織培養(yǎng)

狀

的

植

株目

的

基

因?qū)⒛康幕驅(qū)氲街参锛?xì)胞中方法------農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法表達(dá)載體

Ti質(zhì)粒導(dǎo)

入植

物細(xì)

胞轉(zhuǎn)

入農(nóng)

桿

菌重組

Ti質(zhì)粒(2)花粉管通道法

用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA

溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。2.

將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞(1)

方法：顯微注射法(2)

操作：提純含目的基因表達(dá)載體

顯微注射受精卵移植到輸卵管或子宮受精卵發(fā)新性狀動(dòng)物顯微注射技術(shù)(2)常用法：

Ca2+處理

(感受態(tài)細(xì)胞法)常用菌：

大腸桿菌(

3

)

過

程

：Ca2+處

理

感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞3.

將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞(1)微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)

胞吸收DNA胰島素原胰島素cDNAmRNA21提取

逆轉(zhuǎn)錄胰島素

S重組質(zhì)粒質(zhì)

粒原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。實(shí)例：利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物轉(zhuǎn)化、

E·coli胰腺A鏈mRNAC肽B鏈NH?1COOH30S檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因目檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA

頭檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)常用PCR技

術(shù)檢測(cè)DNA水

平

和RNA

水平用抗原抗體雜交技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)水平鑒定—

抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等四、目的基因的檢測(cè)與鑒定

檢查是否成功檢測(cè)一能與目標(biāo)DNA或RNA的一條鏈發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)?；蛱结槾?/p>

測(cè)DNAFDNA

分子限制酶切

①瓊脂糖凝膠電泳硝酸纖維素膜DNA

分子雜交⑦

放

射自

顯

影DNA

片段②電泳③↓變性④↓轉(zhuǎn)膜加入特異

性探針⑥↓洗膜單鏈DNA

或RNA片段，帶有某種標(biāo)記(

2

)

方

法

：RNA

分子雜交

(3)方法：抗原-抗體雜交各種RNA

各種蛋白質(zhì)qSDS-聚丙烯-酰胺凝膠電泳硝酸纖維素膜抗原一抗體雜交⑤放射自顯影①

電泳②

轉(zhuǎn)膜③

記④

洗膜的抗體加入標(biāo)①

電

泳②

轉(zhuǎn)膜③

加入特異

中性探針④

洗膜瓊脂糖凝-

膠電泳硝酸纖-維素膜⑤放射

自顯影分子雜交例

：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。(4)個(gè)體生物學(xué)水平鑒定鑒定—

抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等基因編輯·1.CRISPR/Cas9·一設(shè)計(jì)合適的向?qū)蛄小?/p>

自將向?qū)蛄泻虲as9基因構(gòu)建基因表達(dá)載體·

為轉(zhuǎn)化·

④表達(dá)并組裝Cas9/gRN

A復(fù)合體·

⑤定點(diǎn)切割(敲除絕大部分外顯子/敲除個(gè)別外顯子，移碼突變)

·

⑥鑒定(PCR:

擴(kuò)增出的條帶小或者無條帶/分子雜交/測(cè)序)目Cre-lox

介導(dǎo)的基因組特定位點(diǎn)重組·

1、兩個(gè)loxP

位點(diǎn)位于同一條DNA

鏈上且方向相同，

Cre

重組酶

敲除loxP

間的序列；·

2、兩個(gè)loxP

位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相反，

Cre

重組酶

誘導(dǎo)loxP

間的序列翻轉(zhuǎn)；·

3、兩個(gè)loxP

位點(diǎn)位于不同的DNA鏈或染色體上，

Cre重組酶誘

導(dǎo)兩條DNA

鏈發(fā)生交換或染色體易位。Inversion

Deletion

Translocation

GeneX知乎@蓋波和他的小魚干XeneGGenexCrex?uasImage

by

Larissa

Haliw篩選高效表達(dá)外源基因的基因座●外源基因置換

至高表達(dá)基因

座上。疾病動(dòng)物模型的

建立●可使某一基因

在特定的組織、

特定的時(shí)段被剔除，減輕由

于在全體細(xì)胞

中敲除產(chǎn)生的

副作用?；虻亩c(diǎn)刪除C外源基因的定點(diǎn)

整合C探究和實(shí)踐DNA

的粗提取與鑒定血紅素基α鏈紅血球β

鏈鐵原子β

鏈a

鏈探究-實(shí)踐

DNA

的粗提取與鑒定(

一)基礎(chǔ)知識(shí)1、提取大分子的基本思路是什么?選用一定的物理、化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分

子。2、提取DNA

分子的基本思路是什么?利用DNA

與RNA、

蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)上的差異，提取DN

A,去除其他成分。日

描

述DNA在NaCL

溶液中的溶解度曲線。在NaC1溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨

NaC1溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14

mol/L時(shí)，DNA

溶解度最小；當(dāng)NaC1

溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA

的溶解度又逐漸增大。如何通過控制NaC1

溶液的濃度使DNA

在鹽溶液中溶解或析出?先用2mol/L

NeC1溶液溶解DNA,

再加入蒸餾水，使其溶液濃度從2mol/L下降到0.14mol/L,使DNA

在鹽溶液中析出。資料：當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2

mol/

工時(shí)，DNA

的溶解度最大溶解度NaCI濃度圖5-1DNA在NaCI溶液中的溶

解度曲線酒精是一種常用有機(jī)溶劑，但DNA卻不能溶于酒精(特別是95%冷卻酒精),但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。問：采用DNA

不溶于酒精的原理，可以達(dá)到什么目的?將DNA

和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離合高溫-大多數(shù)蛋白質(zhì)

在60～80℃時(shí)變性沉淀，而DNA在80℃以上才會(huì)變性。為洗滌劑一溶解細(xì)胞膜，去除

脂

質(zhì)

、

蛋

白

質(zhì)但對(duì)DNA沒有影響。3、DNA

對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性一蛋白酶一水解蛋白質(zhì)，對(duì)DNA沒有影響。圖5

-

2

洗滌劑瓦解細(xì)胞膜的示意圖4、DNA

的鑒定在沸水浴條件下，DNA

遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，因此用二苯胺試劑鑒定DNA

分子。DNA

+二苯胺

沸水澄→

藍(lán)色方法步驟·30g

洋蔥加10ml

研磨液充分研磨·

過濾，4℃放置幾分鐘，取上清液(也可離心1500r/min,5min)·

加入等體積預(yù)冷酒精(95%),靜置2-3min·

玻璃棒卷起絲狀物，吸去水分(或者離心10000

r/min,5min)·

溶于5ml,2mol/

工的NaCl

中，加入4ml二苯胺試劑，沸水浴

5min研缽(加研磨液充分研磨，直至出現(xiàn)大量泡沫)過濾至塑料燒杯3-4mL

體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精取5

g

菜花+

2-3mL研磨液輕輕震蕩，出現(xiàn)白色絮狀物1d1破碎細(xì)胞溶解核內(nèi)DNA析出含DNA的

黏稠物過濾