單細胞DNA甲基化研究基礎(chǔ)篇：從實驗策略到數(shù)據(jù)分析方法簡介

單細胞DNA甲基化研究基礎(chǔ)篇：從實驗策略到數(shù)據(jù)分析方法簡介DNA甲基化是細胞分裂過程中遺傳的一種表觀遺傳標(biāo)記，影響細胞的生物學(xué)功能。而單細胞水平上的全基因組甲基化分析將有助于深入了解轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞異質(zhì)性。單細胞DNA甲基化研究怎么做？來自韓國的科研人員在《Biomolecules》發(fā)表綜述文章，介紹了單細胞DNA甲基化分析方法，包括實驗策略和數(shù)據(jù)分析；此外，還介紹了相關(guān)科研應(yīng)用并討論了未來的發(fā)展。注：此篇綜述沒有介紹5mC分析方法，雖然介紹了許多多組學(xué)方法，但每種方法的單獨分析過程未作深入討論。實驗方法單細胞DNA甲基化分析方法簡述亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法被認為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準。由于它的高轉(zhuǎn)化率（>99%）、可重復(fù)性和通過商業(yè)試劑盒的簡單易用性而受到研究人員的青睞。然而，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法采用了導(dǎo)致DNA降解的苛刻反應(yīng)條件，PBAT的開發(fā)即是為了解決降解造成的損失問題。在單細胞DNA甲基化分析方法中最大限度地減少DNA損失的關(guān)鍵策略RRBS和WGBS是流行的全基因組甲基化分析方法。

這兩種方法都包括亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和NGS制備。主要區(qū)別在于，RRBS使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶和大小選擇來篩選富含GC的區(qū)域。WGBS（特別是MethylC-seq）的優(yōu)勢在于能夠覆蓋基因組中的大部分CpGs。與RRBS相比，WGBS的純化和篩選過程相對簡單。在WGBS中防止亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過程中的降解損失被認為是相對重要的，因此許多基于WGBS的單細胞方法往往是基于PBAT的。多組學(xué)方法是根據(jù)甲基化分析方法與其他分析方法（RNA、染色質(zhì)可及性）相結(jié)合來區(qū)分的。例如scM&T-seq是基因組和轉(zhuǎn)錄組測序（G&T-seq）與scBS-seq的結(jié)合，G&T-seq是一種基于Smart-seq2識別DNA和RNA的方法。此外，應(yīng)用于單細胞甲基化分析方法的技術(shù)，如PBAT，也可以類似地應(yīng)用于NOME-seq，NOMe-seq可以根據(jù)核糖體的存在與否，利用GpC甲基轉(zhuǎn)移酶的染色質(zhì)可及性差異，確認雙硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA中開放染色質(zhì)和CpG甲基化。scCOOL-seq、iscCOOL-seq和scNome-seq可以一起監(jiān)測染色質(zhì)可及性和CpG甲基化。無轉(zhuǎn)換的方法通過轉(zhuǎn)化以外的方法觀察甲基化主要分為兩類：利用甲基胞嘧啶的親和結(jié)合和利用限制性內(nèi)切酶對甲基胞嘧啶的敏感性。MBD-seq和MeDIP-seq是具有代表性的基于親和性的方法?；谟H和力的方法不適合在單細胞規(guī)模上應(yīng)用，因為這些方法基于DNA片段產(chǎn)生平均DNA甲基化譜，這不允許區(qū)分單個細胞中DNA甲基化模式的差異。然而，與基于親和力的方法不同，基于MSRE的方法可以被改進，使用MSRE的單細胞方法的細化可以在Methyl-seq中看到，scCGI-seq測量甲基化的方式與Methyl-seq類似。數(shù)據(jù)分析DNA甲基化數(shù)據(jù)分析方法在測序?qū)嶒炛螅≧RBS或WGBS，需要對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。預(yù)處理步驟可分為數(shù)據(jù)質(zhì)控（QC）、序列修剪和比對，例如使用FastQC測量總體的基本測序數(shù)據(jù)質(zhì)量，使用TrimGalore！、fastp和Trimmomatic等軟件修剪，下表列出了常用的比對工具。亞硫酸氫鹽測序序列比對軟件

甲基化分析的主要目的是探索構(gòu)成樣本、器官和疾病狀態(tài)（包括癌癥）之間差異的表觀遺傳學(xué)證據(jù)。為了發(fā)現(xiàn)這些差異，需要一個暗示此概念的數(shù)值，一個廣泛使用的術(shù)語是β值。在甲基化調(diào)用后，進行后續(xù)分析，如可視化分析的t-SNE，聚類分析，以及識別差異甲基化胞嘧啶（DMCs）或差異甲基化區(qū)域（DMRs）上述方法主要依賴于單個CpG位點的甲基化水平。最近的甲基化分析利用了每個reads的甲基化模式來診斷疾病，尤其是癌癥。這種新的分析概念是基于甲基化的生物學(xué)特性，即除非出現(xiàn)從頭甲基化，否則相鄰CpG位點之間有保持甲基化的趨勢。該讀取模式方法能夠檢測具有疾病信號的DNA分子，并且具有增加疾病信號檢測機會的可能性。例如，一項大型液體活組織檢測研究設(shè)計了一個集成分類器，根據(jù)讀取模式分析對腫瘤類型進行分類，并在早期癌癥的檢測中顯示出顯著的結(jié)果。此外，通過甲基化模式對腫瘤衍生的DNA分子進行量化是觀察腫瘤負擔(dān)的另一種方法。甲基化模式分析在癌癥臨床環(huán)境中的應(yīng)用

應(yīng)用細胞發(fā)育生殖細胞或胚胎細胞的成熟受到特定基因表達的影響，這與DNA中的甲基化水平相關(guān)。例如基于植入前的胚胎細胞的甲基化特征，利用單細胞甲基化測序，通過對早期胚胎系追蹤的研究，研究植入前細胞甲基化的機制及其現(xiàn)象。研究團隊觀察到非CpG甲基化在卵母細胞成熟過程中不斷積累，說明非CpG甲基化與CpG甲基化在卵母細胞成熟過程中的作用不同。與疾病相關(guān)的研究在疾病患者中，DNA甲基化的模式與健康人不同。在各種疾病中，癌癥尤其具有正常細胞所不具有的DNA甲基化模式，從而導(dǎo)致基因表達水平的差異。在對具有這種異質(zhì)性的癌癥研究中，需要使用多組學(xué)方法，將基因組變異和RNA表達結(jié)合起來進行分析。例如一個研究小組最近開發(fā)了一種稱為scTrio-seq2的方法，它整合了單細胞轉(zhuǎn)錄組和單細胞甲基化測序數(shù)據(jù)。多項研究表明使用單細胞甲基化測序（sc-methyl-seq）的多組學(xué)方法可以克服先前方法的局限性，并且具有更好的鑒別能力。因此，sc-methyl-seq可用于各個領(lǐng)域，以解決與生物過程和疾病相關(guān)的基本問題。單細胞DNA甲基化研究仍存在一些問題。其中第一個問題是亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的降解問題，這是目前的金標(biāo)準。然而，在數(shù)量有限的單細胞尺度上，由于降解而造成的損失比在體積尺度上更嚴重。為了解決這個問題，采用了PBAT等技術(shù)，但其性能無法與使用大量DNA的方法相比。近年來，利用TET酶活性的方法，如TAPS和EM-seq，已經(jīng)被開發(fā)出來，并作為一種解決慢性降解問題的方法而受到關(guān)注。另一個問題是一個明確的標(biāo)準分析過程還沒有建立。由于這些挑戰(zhàn)，目前最好的方法是引入多組學(xué)方法進行交叉驗證。隨著數(shù)據(jù)采集的成本正在逐漸降低和數(shù)據(jù)聯(lián)盟的建立（例如國際人類表觀基因組聯(lián)盟（IHEC）等），全面數(shù)據(jù)的積累可以提供一個了解甲基化的機會。關(guān)于甲基化證據(jù)的積累將使大家有可能找到因不同組織類型、不同實驗或環(huán)境條件以及異質(zhì)性疾?。ㄈ绨┌Y）而波動的甲基化熱點區(qū)域。此外，通過積累的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)細胞類型的特異性標(biāo)記，將有利于通過單細胞DNA甲基化數(shù)據(jù)的可視化來進行細胞異質(zhì)性分析，包括在t-SNE圖中分配細胞集群。相信對甲基化及其在疾病中的生物學(xué)作用之間關(guān)系的理解將隨著未來進一步的數(shù)據(jù)而得到揭示。2021為了讓您能快速獲取我們發(fā)布的優(yōu)質(zhì)文章推送，建議您經(jīng)常：文末點擊“在看”、點“贊”、分享將『國家基因庫大數(shù)據(jù)平臺』公眾號“星標(biāo)”與小編“留言互動”更多優(yōu)質(zhì)內(nèi)容請點擊下方名片，關(guān)注“國家基因庫大數(shù)據(jù)平臺”和“深圳國家基因庫”公眾號。參考文