貝類 脂溶性海洋生物毒素的檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

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貝類脂溶性海洋生物毒素的檢測(cè)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

警示—為避免毒素的危害，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。移液管及移液器吸頭等用過的器材、廢棄的提取液等應(yīng)

在次氯酸鈉溶液（5%）浸泡1h以上以使毒素分解。

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了貝類脂溶性海洋生物毒素大田軟海綿酸、鰭藻毒素、蛤毒素、蝦夷扇貝毒素、原多甲

藻酸毒素、環(huán)亞胺毒素等11個(gè)毒素化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法原理、操作步驟及結(jié)果計(jì)算等。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于貝類體中脂溶性海洋生物毒素的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。

3原理

貝類樣品經(jīng)甲醇提取，堿性條件下水解釋放酯化態(tài)生物毒素部分，用HLB固相萃取柱凈化，液相色

譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，外標(biāo)曲線法定量。

4試劑和材料

除非另有說明，以下所用試劑均為分析純?cè)噭疄榉螱B/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

4.1乙腈（CH3CN）：色譜純。

4.2甲醇（CH3OH）：色譜純。

4.3甲酸（HCOOH）。

4.4甲酸銨（HCOONH4）。

4.5氨水（NH3?H2O）：濃度≥25%。

4.6氫氧化鈉（NaOH）。

4.7鹽酸（HCL）：濃度≥36%。

4.8氫氧化鈉溶液(2.5mol/L)：準(zhǔn)確稱取50g氫氧化鈉，用水定容至500mL，室溫保存。

4.9鹽酸溶液(2.5mol/L)：準(zhǔn)確量取104.5mL鹽酸，用水定容至500mL，室溫保存。

4.10甲醇溶液(30%)：量取30mL甲醇加到70mL水中，混合均勻，室溫，現(xiàn)用現(xiàn)配。

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4.11甲醇溶液(20%)：量取20mL甲醇加到80mL水中，混合均勻，室溫，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4.12氨水甲醇溶液(0.3%)：吸取0.3mL氨水，用甲醇定容至100mL，室溫，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4.13脂溶性海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)（附錄A）溶液：OA、DTX1、DTX2、PTX2、YTX、homo-YTX、AZA1、AZA2、

AZA3、GYM、SPX1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量≥97%，避光保存于-20℃。

4.14脂溶性海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別吸取適量的各脂溶性海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（見4.13），

甲醇（見4.2）配制儲(chǔ)備溶液。0.22μm濾膜（見5.12）過濾，-20℃避光保存?zhèn)溆?。各脂溶性海?/p>

生物毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度分別為：OA40ng/mL,DTX140ng/mL,DTX240ng/mL,YTX400ng/mL,Homo-YTX

400ng/mL,PTX21000ng/mL,SPX1200ng/mL,GYM10ng/mL,AZA1200ng/mL,AZA2100ng/mL,AZA3

100ng/mL。

4.15脂溶性海洋生物毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取適量的各脂溶海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（見

4.13），甲醇（見4.2）配制正離子混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1)）和負(fù)

離子混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（（OA、DTX1、DTX2、YTX、homo-YTX）。0.22μm濾膜（5.12）過濾，-20℃

避光保存?zhèn)溆谩８髦苄院Ｑ笊锒舅氐臐舛纫姳?。

表1脂溶性海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（濃度單位：ng/mL）

組別毒素簡(jiǎn)稱濃度1濃度2濃度3濃度4濃度5

PTX250025012562.531.25

AZA1100502512.56.26

AZA2502512.56.253.125

正離子

AZA3502512.56.253.125

GYM52.51.250.6250.3125

SPX1100502512.56.26

OA201052.51.25

DTXA201052.51.25

負(fù)離子DTX2201052.51.25

YTX200100502512.5

homo-YTX200100502512.5

5儀器設(shè)備

5.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源(ESI)。

5.2分析天平：感量0.00001g。

5.3天平：感量0.01g。

5.4勻質(zhì)機(jī)。

5.5渦漩振蕩器。

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5.6離心機(jī)。

5.7水浴鍋。

5.8固相萃取裝置。

5.9真空泵。

5.10pH計(jì)。

5.11固相萃取柱：基質(zhì)為含有N-乙烯吡咯烷酮聚合物的吸附劑，填料質(zhì)量為30mg，體積為1mL，

或者相當(dāng)。

5.120.22μm濾膜

6樣品

用清水將貝類外表清洗干凈。切開閉殼肌打開貝殼，用蒸餾水淋洗貝類內(nèi)部以清除泥沙和其他雜物，

取出貝肉置于孔徑約2mm的金屬篩網(wǎng)上瀝水5min。為保證樣品的均勻性，至少取100g貝肉用勻質(zhì)機(jī)勻

漿30min，充分混勻。

7試驗(yàn)步驟

7.1提取

稱取2.00g貝類組織勻漿于具塞離心管中。加入9.0mL甲醇（見4.2），用渦旋振蕩器混勻1min，3000

rpm離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至20mL的容量瓶中，沉渣再加入9mL甲醇（見4.2）重復(fù)提取一次，合并

兩次提取液，用甲醇（見4.2）定容至20mL，將溶液分成兩份，備用。

7.2水解

為了檢測(cè)酯化態(tài)的OA組毒素含量。取1.0mL（7.1中的一份）放入色譜進(jìn)樣瓶中，加入125μL氫氧

化鈉溶液（4.7），用渦旋振蕩器混勻0.5min，置于76℃水浴40min，冷卻至室溫，加入125μL鹽酸

溶液（4.8）中和，渦旋混勻0.5min，過濾（5.12）后備用。

7.3凈化

固相萃取柱依次用1.0mL甲醇活化、1.0mL30%甲醇平衡。取1.0mL提取液（7.1中的另一份）加2.8

mL水混勻后轉(zhuǎn)入預(yù)處理的固相萃取柱，以約每秒一滴的流速通過固相萃取柱，用1.0mL20%甲醇溶液

淋洗，再以1.0mL氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，搖勻后，0.22μm濾膜（4.17）過濾，液相色譜-

串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。按照7.3步驟凈化水解液。

7.4樣品測(cè)定

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7.4.1正離子模式測(cè)定PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1，液相色譜參考條件如下：

a)色譜柱：C18，50mm×2.1mm，填料粒徑2.5μm，或相當(dāng)者。

b)流動(dòng)相：A：2mM甲酸銨和50mM甲酸的水溶液；B：2mM甲酸銨和50mM甲酸的95%乙

腈水溶液。

c)流速：0.3mL/min。

d)柱溫：25℃。

e)進(jìn)樣量：10μL。

f)流動(dòng)相梯度：0~4min，10%B線性變化至80%B；4~6min，保持80%B，6~6.5min線性變化

至10%B，平衡2.5min。

7.4.2負(fù)離子模式測(cè)定OA、DTX1、DTX2和YTX、homo-YTX，液相色譜參考條件如下：

a)色譜柱：C18，150mm×3.0mm，填料粒徑3.5μm，或相當(dāng)者。

b)流動(dòng)相：A：0.05%的氨水溶液(pH11)；B：含有0.05%氨水的乙腈-水(90/10，v/v)溶液(pH11)。

c)流速：0.4mL/min。

d)柱溫：40℃。

e)進(jìn)樣量：10μL。

g)流動(dòng)相梯度：1~10min，10%B線性變化至90%B；10~13min，保持90%B，13~15min線性變

化至10%B，平衡4min。

7.4.3質(zhì)譜條件

a）離子源：電噴霧離子源。

b）掃描模式：正離子和負(fù)離子模式。

c）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

d）噴霧電壓：4500V。

e）毛細(xì)管溫度：450℃（正離子模式）；600℃（負(fù)離子模式）。

f）源內(nèi)碰撞解離電壓：5V。

g）霧化氣流速：60L/min。

h）輔助加熱氣流速：50L/min。

i）離子碎片參數(shù)見表2。

表2.離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞電壓

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目標(biāo)毒素母離子子離子錐孔電壓V碰撞電壓V

563.2

OA803.5/-80-60

255.1

577.2

DTX1817.5-80-60

255.2

577.2

DTX2803.5-80-60

255.2

1075.5

homo-YTX1155.5-12-45

869.5

1061.7

YTX1141.5-12-48

855.5

823.5

PTX-2876.59039

213.2

824.6

AZA-1842.611046

806.6

838.5

AZA-2856.511046

820.5

810.5

AZA-3828.511046

792.3

490.3

GYM508.49535

392.3

444.2

SPX1692.49040

164.1

7.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液（見4.13）分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測(cè)定相應(yīng)各毒素的峰面積，以

標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7.4.5試樣溶液測(cè)定

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將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到峰面積，根據(jù)基質(zhì)標(biāo)注曲線得到試樣溶液中各毒素

的質(zhì)量濃度。在上述檢測(cè)條件下，試樣溶液中各毒素的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中毒素的保留時(shí)間之間的偏

差應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)工作液中毒素的定性離子的相對(duì)豐度一致，其豐度比偏差應(yīng)符合表

3要求。各毒素的特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄B。

表3.定性測(cè)定相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

相對(duì)離子豐度50%20%至≤50%10%至≤20%≤10%

允許的相對(duì)偏差±20%±25%±30%±50%

7.5空白試驗(yàn)

除不加試樣外，按（7.1，7.2，7.3）步驟得到空白溶液，測(cè)定方法同（見7.4）。

8結(jié)果計(jì)算與表述

8.1結(jié)果計(jì)算

樣品中各脂溶性海洋生物毒素的含量按公式(1)計(jì)算。

(cc)V

Xi0····································(1)

im

式中：

Xi——試樣中脂溶性海洋生物毒素的含量(μg/kg)/濕重；

ci——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中得到的試樣中脂溶性海洋生物毒素溶液濃度(ng/mL)；

c0——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中得到的空白試驗(yàn)中脂溶性海洋生物毒素溶液濃度(ng/mL)；

V——樣品溶液最終定容體積(mL)；

m——最終樣品溶液所代表試樣質(zhì)量(g)；

以重復(fù)性條件下平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)。

8.2總毒力計(jì)算

脂溶性海洋生物毒素的毒性因子列于附錄C。樣品中脂溶性海洋生物毒素的含量則按照毒性因子，

統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為Wneq來表示，計(jì)算公式(2)：n

WeqXr

nii……(2)

i1

Wneq——表示各毒素(OAs、PTXs、AZAs、YTXs)的總毒力；

Xi——表示相對(duì)應(yīng)的脂溶性海洋生物毒素的含量(μg/kg)；

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ri——毒性因子。

9精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的15%。本方法的批內(nèi)

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤37%。

9.1其他

本方法各毒素的定量限示于表4中。本方法在0.08μg/kg~200μg/kg添加濃度水平上的回收率為

80%~120%。

表4.脂溶性海洋生物毒素定量限

目標(biāo)毒素定量限（μg/kg）

OA6.6

DTX19.9

DTX213.2

PTX279.2

YTX85.8

homo-YTX6.6

AZA12.31

AZA23.3

AZA31.65

GYM0.33

SPX13.3

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附錄A

（資料性附錄）

脂溶性海洋生物毒素

毒素簡(jiǎn)稱中文名稱英文名稱分子式分子量CASNo.

OA岡田軟海綿酸Okadaicacid(OA)C44H68O13805.0278111-17-8

DTX1鰭藻毒素-1Dinophysistoxin-1C45H70O13819.0381720-10-7

DTX2鰭藻毒素-2Dinophysistoxin-2C44H68O13805.00139933-46-3

PTX-2扇貝毒素-2Pectenotoxin-2C47H70O14859.0797564-91-5

YTX蝦夷扇貝毒素YessotoxinC56H84O21S21157.38196309-94-1

homo-YTX類蝦夷扇貝毒素1-HomoyessotoxinC56H84O21S21157.38196309-94-1

AZA-1原多甲藻酸-1Azaspiracid-1C47H71NO12842.1214899-21-5

AZA-2原多甲藻酸-2Azaspiracid-2C48H73NO12856.1265996-92-7

AZA-3原多甲藻酸-3Azaspiracid-3C46H69NO12828.04265996-93-8

GYM環(huán)亞胺毒素GymnodimineC32H45NO4507.71173792-58-0

13-Desmethyl-spirolide

SPX113-去甲螺旋內(nèi)酯CC42H61NO7691.5334974-07-1

C

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附錄B

（資料性附錄）

特征離子質(zhì)量色譜圖

負(fù)離子和正離子模式下脂溶性海洋生物毒素特征離子色譜圖如圖B.1和圖B.2所示。

圖B.1負(fù)離子模式下脂溶性海洋生物毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液特征離子質(zhì)量色譜圖

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圖B.2正離子模式下脂溶性海洋生物毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液特征離子質(zhì)量色譜圖