熒光分光光度法測(cè)定維生素B2的含量

PAGEPAGE4熒光分光光度法測(cè)定維生素B2的含量實(shí)驗(yàn)報(bào)告——應(yīng)用化學(xué)（環(huán)境檢測(cè)與分析）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析維生素B2的基本原理。2、了解熒光分光光度計(jì)的基本原理、結(jié)構(gòu)及性能，掌握其基本操作。二、實(shí)驗(yàn)原理1什么是熒光？熒光是光致發(fā)光。當(dāng)物質(zhì)的分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射的光。23熒光與環(huán)境因素的關(guān)系取代基的性質(zhì)、溶劑的極性、體系的pH和溫度。維生素B2(VitaminB2)，別名：核黃素(Riboflavin，RF)，是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶,分子式：C17H20N4O6，相對(duì)分子量為：376.37。因其色黃且含有核糖醇，故稱為核黃素。結(jié)構(gòu)式為：由于分子中有三個(gè)芳香環(huán)，具有平面剛性結(jié)構(gòu)，因此它能夠發(fā)射熒光。維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430—440nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535nm附近。維生素B2在pH＝6—7的溶液中熒光強(qiáng)度最大，而且其熒光強(qiáng)度與維生素B2溶液濃度呈線性關(guān)系，因此可以用熒光光譜法測(cè)維生素B2的含量。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為另一物質(zhì)——光黃素，光黃素也是一個(gè)能發(fā)熒光的物質(zhì)，其熒光比維生素B2的熒光強(qiáng)得多，故測(cè)維生素B2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度F與物質(zhì)的濃度c有以下關(guān)系：F＝2.303ФI0εbc當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系：F=Kc這是熒光光語(yǔ)法定量分析的依據(jù)。三、儀器與試劑1、主要儀器：熒光分光光度計(jì)（日立F—7000）；比色皿：1cm；容量瓶：50mL；移液管：5mL。2、試劑：核黃素；維生素B2藥片四、實(shí)驗(yàn)步驟1.溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取2mg核黃素(VB2)，用超純水于50ml棕色容量瓶中定容待測(cè)液的配制：將維生素B2藥片研磨成粉末狀，精確稱取2mg，用超純水于50ml棕色容量瓶中定容；2.掃描激發(fā)光譜和熒光光譜3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在室溫條件下，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0標(biāo)準(zhǔn)溶液于50ml棕色容量瓶中定容。用超純水作空白試樣，測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度值。用所測(cè)結(jié)果繪制熒光強(qiáng)度(F)對(duì)濃度(c)的曲線。4.待測(cè)液VB2含量的測(cè)定及數(shù)據(jù)處理六、總結(jié)、討論1、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：（1）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，為了減少儀器偏差，取不同體積的同種溶液應(yīng)用同一移液管。（2）因熒光是從石英池下部通過，所以拿取石英池時(shí)，應(yīng)用手指捏住池體的上部，不能接觸下部。清洗樣品池后，應(yīng)先用吸水紙吸干四個(gè)面的液滴，再用擦鏡紙往同一方向進(jìn)行輕輕擦拭。（3）在使用熒光分光光度計(jì)時(shí)，須按照既定程序進(jìn)行。在測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和熒光強(qiáng)度時(shí)，必須按順序放入測(cè)定。（4）在測(cè)試樣品時(shí)，應(yīng)注意樣品的濃度不能太高，否則由于存在熒光猝滅效應(yīng)，樣品濃度與熒光強(qiáng)度不呈線性關(guān)系，造成定量工作出現(xiàn)誤差。2、此次實(shí)驗(yàn)，影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性的主要因素是配制溶液時(shí)，操作是否規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)。七、思考題1、試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因？答：由于現(xiàn)代電子技術(shù)具有檢測(cè)十分微弱光信號(hào)的能力，并且熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度也可以增大熒光強(qiáng)度，使測(cè)定的靈敏度提高；而吸收光度法測(cè)定的是吸光度，不管是增大入射光強(qiáng)度，還是提高檢測(cè)器的靈敏度，都會(huì)使透射光信號(hào)與入射光信號(hào)以同樣的比例增大，吸光度值不會(huì)改變，因此靈敏度不能提高。2、維生素B2在pH=6~7時(shí)熒光最強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)為何在