血涂片制備和染色ppt課件

1、,血液一般檢驗 主講人:李學(xué)民,復(fù)習(xí) 血液標本采集和抗凝劑選擇,血標本： 全血：血細胞+血漿;臨床血液學(xué)檢查，血細胞計數(shù)、分類和形態(tài) 學(xué)檢查 血漿：全血除去血細胞；血漿病理性和生理性化學(xué)成分的測定，內(nèi)分泌激素、凝血因子（鈣除外）、血栓和止血檢查 血清：離體后血液自然凝固后析出的液體成分（除纖維蛋白原等凝血因子）；臨床化學(xué)和臨床免疫學(xué)檢查，可見血漿與血清的主要區(qū)別是，血清中不含纖維蛋白原。,一、采血方法,靜脈采血法 部位：主要是肘靜脈。還可以在：手背、內(nèi)踝、股靜脈，幼兒可采用頸外靜脈采血 注意事項:抽血時只能外抽不能內(nèi)推，以免形成空氣栓塞,部位：WHO推薦中指或無名指尖內(nèi)側(cè)為宜，耳垂采血受溫度影

2、響大；半歲以下拇指或足部，特殊人員視情況而定。 采血步驟及注意事項：應(yīng)嚴格實行一人一針制；穿刺的深度的適當，切忌用力擠壓，以免混入組織液，影響檢驗結(jié)果。用消毒干棉球擦去第一滴血，以后流出的血液可以使用。,皮膚采血法（毛細血管采血法）,二、抗凝劑選擇,抗凝：用物理或化學(xué)方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固 抗凝劑：能夠阻止血液凝固的物質(zhì)，稱抗凝劑,乙二胺四乙酸（EDTA）鹽,抗凝原理：螯合鈣離子 使用方法：15g/L濃度EDTA 和血液 1：10 適用范圍：血細胞形態(tài)、血小板計數(shù)。但影響血小板聚集和白細胞吞噬功能所以不適合做凝血象檢驗及血小板功能試驗,草酸鹽 （sodium

3、oxalate）,草酸鈉 、草酸鉀、草酸銨 原理：草酸鹽可與血中鈣離子生成草酸鈣沉淀，從而阻止血液凝固 用范圍： 凝血象檢查,肝素（heparin）,原理：低濃度時抑制因子a、和PF3之間的作用，加強抗凝血酶（AT-）滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成,還能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子的作用；高濃度時阻斷凝血酶和纖維蛋白的反應(yīng) 適用方法： 1g/L濃度的肝素鈉與血液 1：10 優(yōu)點：抗凝能力強、不影響血細胞體積、不易溶血、能耐高溫 適用范圍：紅細胞檢驗（紅細胞計數(shù)、血紅蛋白測定、紅細胞比積）和多種生化分析,枸櫞酸鹽（枸櫞酸三鈉）,原理：螯合鈣離子 使用方法：配成109 mmol/L的濃度和

4、血液1：9 106 mmol/L的濃度和血液1：4 適用范圍：止血學(xué)檢驗、血沉、輸血保養(yǎng)液（毒性小）,3. 血液標本檢驗后的處理,血源性污染是醫(yī)源性污染的主要來源之一，檢驗后的血液標本處理不當，其危害極大。對于檢驗完畢的血液標本首先要進行高壓滅菌，然后再進行無害化處理。帶有血液的檢驗器材要用消毒液浸泡。采血用的注射器要進行毀形、消毒并進行無害化處理。,四： 血液涂片制備,血涂片的顯微檢查是血液細胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷具有重要的價值，近年來血細胞分析儀的廣泛應(yīng)用，血涂片的觀察也可作為判斷儀器結(jié)果的簡易方法。 血涂片的用途：血細胞形態(tài)學(xué)檢驗、網(wǎng)織紅、 寄

5、生蟲檢驗。,1：玻片的清潔,將載玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20分鐘，再用熱水將肥皂、血膜洗去，自來水反復(fù)沖洗，必要時用95%的乙醇浸泡1小時，擦干備用。 新玻片常有游離堿質(zhì)，用重鉻酸鉀洗液或稀鹽酸（濃鹽酸稀釋10倍）浸泡24小時，再徹底洗滌。 使用玻片時，要手持玻片邊緣，以保持玻片干燥、清潔、中性、無油膩。,2、血液涂片制備,將推玻片向1的方向稍抽回，當血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動。,圖1-3 血涂片制備示意圖（上：側(cè)面觀，下：正面觀）,血涂片質(zhì)量評價,均勻、厚薄、頭體尾、邊緣、兩側(cè) 注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚 一張良好血涂片的標準是：厚薄適宜、頭體尾分明

6、、細胞分布均勻、邊緣整齊、兩側(cè)及兩頭留有空隙，血膜長度約4厘米。,五、血液細胞染色,染料：生物學(xué)染色劑，將生物組織細胞和病原體染色，在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)。 發(fā)色基團和助色基團使生物學(xué)染色劑產(chǎn)生顏色和被染組織親合。,堿性染料：為陽離子染料，能接受質(zhì)子，染細胞核 的染料。如亞甲藍、天青。 酸性染料：為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。主要有熒 烷-氧雜蒽染料和偶氮染料兩類，能結(jié)合 細胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、 嗜酸性顆粒成分等。 復(fù)合染料：同時具有陰、陽離子型的染料如瑞氏染料,細胞染色原理：,一般以它們的物理現(xiàn)象和/或化學(xué)現(xiàn)象為依據(jù)。 物理作用：毛細管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等 化學(xué)作用：1.染料的化

7、學(xué)成分：助色基團的存在，堿性染料在溶媒中為陽離子型，易與組織和細胞內(nèi)帶負電荷的酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。 2.蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同 數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時還有其 它活性基團。在游離狀態(tài)時， -NH2獲得一個H+變成 帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個H+變成帶負電的-COO-。分別與不同染料結(jié)合。 3.周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pHpI（ pI 為等電 點），則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之， pHpI，則結(jié)合堿性染料。,（一）瑞氏染色法,瑞氏染料 由酸性染料伊紅（eosin,E-）和堿性染料亞甲

8、藍(methylene blue,M+)組成復(fù)合染料。亞甲藍為氯鹽，即氯化美藍，有色部分為陽離子。美藍容易氧化天青。伊紅通常為鈉鹽。將伊紅和美藍溶解在甲醇中，即瑞氏染料。 M+CL + NaE- ME + NaCL 美藍 伊紅 伊紅化美藍（瑞氏染料）,染色原理,細胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細胞核蛋白和淋巴細胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍或天青結(jié)合，染紫藍色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性

9、顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。,圖1-4 瑞氏染色原理示意圖,PH對細胞染色有影響,細胞各種成分均為蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負電荷增多，易與美藍或天青結(jié)合，染色偏藍。因此細胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用玻片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞氏染液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各種細胞染色反應(yīng)異常，以致識別困難，甚至造成錯誤。,試劑,Wright染液：瑞氏染粉0.1g, 甲醇60.0ml 甲醇的作用：1、溶解瑞氏染料。2、有強大的脫水力，

10、可將細胞固定為一定形態(tài)，固定血膜。3、使蛋白質(zhì)沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結(jié)構(gòu)，增加細胞與染料接觸表面積，提高對染料的物理吸附作用，增強染色效果。 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.4-6.8）：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g, 蒸餾水加到1000ml。 配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。,瑞氏染色方法,1. 用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。 2. 加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。 3. 滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。 4. 用清水沖洗，待干后鏡檢。,【質(zhì)量控制】,血膜要干透后才能染色，否則染色時易脫落. 染色時間與染液濃度、室溫及細胞多少有關(guān)，

11、一般染液淡、染色時間長些效果好。 染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。 沖洗時不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防止染料 沉著。沖洗時間也不能長。 染色過淡，可復(fù)染。 染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色.,【染色結(jié)果評價】,正常情況：血膜外觀呈淡琥珀色。在顯微鏡下紅細胞染成粉紅色，在厚薄均勻處略有碟狀感。白細胞胞質(zhì)中的顆粒能顯示出各種細胞的特有色彩，細胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。 染色環(huán)境偏酸：則紅細胞和嗜酸性顆粒偏紅，白細胞核呈淺藍色或不著色，染色過酸pH3.5時，則呈現(xiàn)一片紅色，白細胞中除嗜酸性顆粒外均不著色。 染色環(huán)境偏堿：則所有細胞呈灰藍色，微偏堿者紅細胞暗紅、白細胞顆粒深暗。嗜酸性顆粒可

12、染成暗褐色甚至黑紫色或藍色。中性顆粒也偏粗染成紫黑色，血膜過厚的地方呈綠色。,（二）姬姆薩染色法,原理 吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié) 果與瑞特染色法基本相同。但本法對細胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。,吉姆薩染料 1.0g 甘油 66.0ml 甲醇（AR） 66.0ml 染色方法 1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 將血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水沖洗,待干后鏡檢,試劑,（三） 瑞氏-吉姆薩染色,【原理】 將瑞特染料和吉姆薩染料按一定比例混合后對細胞進行染色，其染色原理同瑞特和吉姆薩染色法，但染色效果更佳，因為其綜合了瑞士和吉姆

13、薩染色法的優(yōu)點。,【瑞氏-吉姆薩染色試劑】,瑞特染料 1.0g 吉姆薩染料 0.3g 甲醇 加至500ml 先將瑞特染料和吉姆薩染料充分研磨混勻，甲醇溶解倒入容器中，未溶解完的繼續(xù)加入甲醇研磨，重復(fù)多次，最后把染液加至500ml。,瑞氏-吉姆薩染色方法,血片滴加染液5滴蓋滿血膜，2min后加入pH6.4-6.8磷酸鹽緩沖液（同瑞氏染液）緩沖液10滴，10min后用流水沖洗干凈，待干后鏡檢。,【方法學(xué)評價】,瑞氏染液和吉姆薩染液對細胞進行染色時有各自的顯色特征，前者對細胞質(zhì)和顆粒著色較好，后者對細胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰。因此將二者結(jié)合，能取長補短、集中優(yōu)勢，用該混合染液對血細胞進行染色，其細胞核、細胞

14、質(zhì)和細胞內(nèi)顆粒均著色鮮艷，對比鮮明。瑞氏-吉姆薩混合染色法是臨床上廣泛使用的方法。,六、血細胞顯微鏡計數(shù)法,精選,六、血細胞顯微鏡計數(shù)法,（一）原理 用一定的稀釋液將標本作定量稀釋，混勻充入計數(shù)池中，在顯微鏡下計數(shù)一定容積中的血細胞數(shù)，經(jīng)換算求得每升血液中的血細胞總數(shù)。,血細胞計數(shù),人工顯微鏡計數(shù)法,自動血細胞計數(shù)儀法,直接計數(shù)法,間接計數(shù)法,半自動 （二、三分群）,全自動 （五分群）,顯微鏡細胞計數(shù)法,【測定方法及評價】 將樣本做適當稀釋（或濃縮），充入細胞計數(shù)池，在顯微鏡下計數(shù)計數(shù)板中一定體積內(nèi)細胞數(shù)，經(jīng)換算得每升標本的細胞數(shù)。 如：血液RBC、WBC、PLT、嗜酸細胞、嗜堿細胞、淋巴細胞

15、和單核細胞直接計數(shù)，體液細胞計數(shù)（尿中細胞管型、精液中精子計數(shù)、腦脊液及漿膜腔積液細胞計數(shù)）等。 該法計數(shù)誤差較大，費時、費力，已不能適應(yīng)大批量標本的測定，將逐漸被血細胞分析儀所取代。,【試劑】 各種不同的專用稀釋液或染色稀釋液。 【器材】 （1） 顯微鏡 （2） 微量吸管：Hb吸管：10、20l兩刻度 毛細玻璃吸管：10、20l兩刻度 一人一管，定期用水銀稱重法進行校正 誤差應(yīng) 1% （3）計數(shù)板：血細胞計數(shù)板，常用改良Neubauer計數(shù)板 計數(shù)板的構(gòu)造： （4）血蓋片 規(guī)格24mm20mm0.6mm， 要求：表面平整（不平整性0.002mm），高倍鏡檢查無裂痕，且本身有一定的重量。,血細胞計數(shù)板的構(gòu)造,24200.6mm,1855 年 發(fā)明計數(shù)紅細胞的計數(shù)板 血細胞計數(shù)板法是最可靠和最經(jīng)典計數(shù)技術(shù) 改良Neubauer 計數(shù)板,計數(shù)池劃線,1 mm,1mm,精選,計數(shù)池,計數(shù)池劃線,美國國家標準局（NBS） 1941年規(guī)定：計數(shù)池大方格每邊長度的誤差應(yīng)在 1%內(nèi)（10.01mm）;血蓋片與計數(shù)池間縫隙深度應(yīng)在2%以內(nèi)(0.10.002mm)。,【操作】（以血WBC計數(shù)為例）,WBC稀釋液0.38ml+血20l 混勻后30s后灌板,靜置23min后 以