生物制藥工藝學(xué)第4章萃取法

1、第四章 萃取法,第一節(jié) 溶劑萃取法,廣義的溶劑萃取法(solvent extraction)包括液-固萃取和液-液萃?。?液-固萃取又稱(chēng)浸取、浸提,液-液萃取指用一種溶劑將物質(zhì)從另一種溶劑（如發(fā)酵液）中提取出來(lái)的方法。,溶劑萃取法優(yōu)點(diǎn)： 操作可連續(xù)化，速度快，生產(chǎn)周期短； 對(duì)熱敏物質(zhì)破壞少； 采用多級(jí)萃取時(shí)，溶質(zhì)濃縮倍數(shù)大、純化度高。 缺點(diǎn)： 由于有機(jī)溶劑使用量大，對(duì)設(shè)備和安全要求高，需要各項(xiàng)防火防爆等措施。,一、基本概念,（一）萃取與反萃取 被提取的溶液稱(chēng)為料液，其中欲提取的物質(zhì)稱(chēng)溶質(zhì)，而用以進(jìn)行萃取的溶劑稱(chēng)為萃取劑(extractant) 達(dá)到萃取平衡后，大部分溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中，這種含有

2、溶質(zhì)的萃取劑溶液稱(chēng)為萃取液，而被萃取出溶質(zhì)以后的料液稱(chēng)為萃余液。,萃取一般指用有機(jī)溶劑將物質(zhì)從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相的過(guò)程。 反萃取(stripping或back extraction)是將萃取液與反萃取劑（一般為水溶液）相接觸，使某種被萃入有機(jī)相的溶質(zhì)轉(zhuǎn)入水相的過(guò)程，可看作是萃取的逆過(guò)程。,（二）、分配定律,能斯特分配定律：在一定溫度、一定壓力下，某一溶質(zhì)在互不相溶的兩種溶劑間分配時(shí)，達(dá)到平衡后，在兩相中的活度之比為一常數(shù)。如果是稀溶液，可以用濃度代替活度，即： K 稱(chēng)為分配系數(shù),應(yīng)用分配定律時(shí)，須符合下列條件： 必須是稀溶液，即適用于接近理想溶液的萃取體系； 溶質(zhì)對(duì)溶劑的互溶度沒(méi)有影響； 溶質(zhì)在

3、兩相中必須是同一分子形式，即不發(fā)生締合或解離。,在萃取過(guò)程中，溶質(zhì)在兩相的分子形式常常并不相同，仍然采用類(lèi)似分配定律的公式作為基本公式。這時(shí)候溶質(zhì)在萃取相和萃余相中的濃度，實(shí)際上是以各種化學(xué)形式進(jìn)行分配的溶質(zhì)總濃度，它們的比值以分配比(distribution ratio)表示：,（三）、萃取因素,萃取因素也稱(chēng)萃取比，其定義為被萃取溶質(zhì)進(jìn)入萃取相的總量與該溶質(zhì)在萃余相中總量之比。通常以E表示。若以Vl和V2分別表示萃取相和萃余相的體積，M1和M2分別表示溶質(zhì)在萃取相和萃余相中的平衡濃度。萃取因素（E）為：,（四）、分離因素,料液中的溶質(zhì)并非是單一的組分，除了所需產(chǎn)物（A）外，還存在有雜質(zhì)（B）

4、。分離因素(separation factor)，常用表示，其定義為：在同一萃取體系內(nèi)兩種溶質(zhì)在同樣條件下分配系數(shù)的比值,二、溶劑萃取法的基本原理,抗生素在不同的pH條件下，可以有不同的化學(xué)狀態(tài)，其分配系數(shù)亦有差別，若適度改變pH，可將抗生素自水相轉(zhuǎn)入有機(jī)相，或從有機(jī)相再轉(zhuǎn)入水相，這樣反復(fù)萃取，可以達(dá)到濃縮和提純的目的,三、萃取方法和理論收率的計(jì)算,（一）單級(jí)萃取,萃取因素E為 式中 VF料液體積；Vs萃取劑的體積；C1溶質(zhì)在萃取液的濃度； C2溶質(zhì)在萃余相的濃度；K表觀分配系數(shù)； m濃縮倍數(shù),萃余率： 理論收率：,例如： 潔霉素在20和pH10.0時(shí)表觀分配系數(shù)（丁醇/水）為18。用等量的丁

5、醇萃取料液中的潔霉素，計(jì)算可得理論收率 若改用1/3體積丁醇萃取， 理論收率：,（二）多級(jí)錯(cuò)流萃取,萃余率： 理論收率,紅霉素在pH 9.8時(shí)的分配系數(shù)（醋酸丁酯/水）為44.5，若用1/2體積的醋酸丁酯進(jìn)行單級(jí)萃取，則： 理論收率 若用1/2體積的醋酸丁酯進(jìn)行二級(jí)錯(cuò)流萃取，則 理論收率,多級(jí)逆流萃取,n級(jí)萃取后，萃余率為： 理論收率為,青霉素在0和pH2.5時(shí)的分配系數(shù)（醋酸丁酯/水）為35，若用1/4體積的醋酸丁酯進(jìn)行二級(jí)逆流萃取， 則： n2，理論收率,若改為二級(jí)錯(cuò)流萃取，第一級(jí)用1/4體積的醋酸丁酯，第二級(jí)用1/10體積的醋酸丁酯，則,第二節(jié) 影響溶劑萃取的因素,一、乳化和破乳化 （一

6、）乳狀液的形成和穩(wěn)定條件 乳化劑多為表面活性劑。分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：一般是由親油基和親水基兩部分組成的，即一端為親水基團(tuán)或極性部分 ，另一端為疏水性基團(tuán)或非極性部分（烴鏈） 。,乳化劑使乳狀液穩(wěn)定與以下因素有關(guān)： （1）界面膜形成 （2）界面電荷的影響 （3）介質(zhì)黏度,每一種表面活性劑都有親水和疏水基團(tuán)，兩種基團(tuán)的強(qiáng)度的相對(duì)關(guān)系稱(chēng)為HLB值（hydrophile-lipophile balance）。完全不親水（HLB=0）和完全親水（HLB=20）的兩種極限乳化劑作為標(biāo)準(zhǔn)，其它表面活性劑的HLB值就處于這兩種極限值之間。,（二）、影響乳狀液類(lèi)型的因素,1相體積的影響 假定分散相為大小均勻的圓球，按

7、緊密地堆積，圓球體積占總體積的74%。如水的體積占總體積小于26%時(shí)，只能形成WO型乳狀液；大于74%時(shí)，只能形成OW型乳狀液。 2乳化劑分子空間構(gòu)型的影響 截面積小的一頭指向分散相，截面積大的一頭指向分散介質(zhì)，所以一價(jià)金屬皂形成OW型乳狀液，而二價(jià)金屬皂形成WO型乳狀液，,3界面張力的影響 乳化劑聚集于界面形成薄膜，若兩相界面張力不等，則使膜彎曲，其凹面一側(cè)為界面張力較高的相，高界面張力這側(cè)的液體易形成內(nèi)相。 4容器壁性質(zhì)的影響 親水性強(qiáng)的容器易得OW型乳狀液，親油性強(qiáng)的容器易形成WO型乳狀液。,（三）、乳狀液的破壞,1、加入表面活性劑 2、離心 3、加電解質(zhì) 4、加熱 5、吸附法破乳 6、

8、高壓電破乳 7、稀釋法,（四）、常用的去乳化劑,1.陽(yáng)離子表面活性劑 （1）十二烷基三甲基溴化銨（1231） CH3(CH2)10CH2(CH3)3N+Br （2）溴代十五烷吡啶（PPB）,2.陰離子表面活性劑 陰離子表面活性劑，如亞油酸鈉、十二烷基磺酸鈉、石油磺酸鈉等 3其他破乳劑 如用溴代四烷基吡啶作去乳化劑，因其既易溶于水，又易溶于醋酸丁酯中，既能破壞WO型，也能破壞OW型乳狀液，比PPB破乳完全，用量為0.03%0.05%。它能降低青霉素提取時(shí)隨廢液的損失，提高收率。,二、pH的影響,1、pH影響弱酸或弱堿性藥物的分配系數(shù) 2、pH也影響藥物的穩(wěn)定性 例：用醋酸丁酯提取芐基青霉素，在0

9、、pH2.5時(shí)測(cè)得K表=30，KP=10-2.75，可求得,可按下式計(jì)算表觀分配系數(shù)和水相pH的關(guān)系： 可得，當(dāng)pH=4.4時(shí)，K表=1。當(dāng)pH4.4時(shí)，青霉素從醋酸丁酯相轉(zhuǎn)移到水相，稱(chēng)為反萃取。,三、溫度和萃取時(shí)間的影響,高溫不穩(wěn)定 高溫時(shí)溶劑間互溶度增大 四、鹽析作用的影響 由于鹽析劑與水分子結(jié)合，降低了藥物在水中的溶解度，使其易轉(zhuǎn)入有機(jī)相； 鹽析劑降低有機(jī)溶劑在水中的溶解度；鹽析劑增大萃余相比重，有助于分相。,五、溶劑種類(lèi)、用量及萃取方式,分配系數(shù)愈大愈好，若分配系數(shù)未知，則可根據(jù)“相似相溶”的原則，選擇與藥物結(jié)構(gòu)相近的溶劑； 選擇分離因素大于1的溶劑； 料液與萃取溶劑的互溶度愈小愈好；

10、盡量選擇毒性低的溶劑。 溶劑的化學(xué)穩(wěn)定性高，腐蝕性低，沸點(diǎn)不宜太高，揮發(fā)性要小，價(jià)格便宜，來(lái)源方便，便于回收。,如潔霉素20，pH10.0時(shí)，分配系數(shù)（丁醇水）=18，根據(jù)萃取方式理論收得率的計(jì)算方法，得出：,第三節(jié) 萃取過(guò)程和溶劑回收,一、混合 1、攪拌罐 2、管式混合器,3、噴嘴式混和器 4、氣流攪拌混和罐,二、液-液兩相分離,離心機(jī) 三、溶液回收 （一）、單組分溶劑的回收 簡(jiǎn)單蒸餾 （二）、低濃度溶劑回收 精餾：塔底102，塔頂91，蒸餾物為恒沸混和物，含水量為28%-29%，超過(guò)水在醋酸丁酯中溶解度（20，1.4%）。,三、回收與水部分互溶并形成恒沸混和物的溶劑,四、回收完全互溶的混和

11、溶劑并不形成恒佛混和物,如丙酮-丁醇混和溶劑，由于其沸點(diǎn)相差較大（丙酮沸點(diǎn)為56.1，丁醇沸點(diǎn)為117.4），采用精餾方法很易得到純組分。如果混和溶劑要反復(fù)使用，則不需要將它們分成純組分，只需經(jīng)過(guò)蒸餾方式除去不揮發(fā)物質(zhì)，然后測(cè)定混和溶劑的比例，再添加不足的溶劑使達(dá)到要求。,第四節(jié) 雙水相萃取,雙水相萃取技術(shù)(two-aqueous phase extraction) ，又稱(chēng)水溶液兩相分配技術(shù)，它利用不同的高分子溶液相互混合可產(chǎn)生兩相或多相系統(tǒng)，靜置平衡后，分成互不相溶的兩個(gè)水相，利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異來(lái)進(jìn)行萃取的方法，稱(chēng)為雙水相萃取法。 特點(diǎn)：能保留產(chǎn)物的活性，操作可連續(xù)化

12、，可純化蛋白質(zhì)25倍。,一、雙水相的形成,如葡聚糖與聚乙二醇按一定比例與水混合，靜置平衡后，分成互不相溶的兩個(gè)水相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖,二、雙水相萃取的基本概念,（一）相圖 相圖右上部為兩相區(qū)，左下部為均相區(qū)，兩相與均相的分界線(xiàn)叫雙節(jié)線(xiàn)。組成位于A點(diǎn)的系統(tǒng)實(shí)際上由位于C、B兩點(diǎn)的兩相所組成，BC稱(chēng)為系線(xiàn)。,當(dāng)系線(xiàn)向下移動(dòng)時(shí)，長(zhǎng)度逐漸減小，表明兩相的差別減小，當(dāng)達(dá)到K點(diǎn)時(shí)，兩相間差別消失，K點(diǎn)稱(chēng)為臨界點(diǎn)。,（二）分配系數(shù),影響分配系數(shù)的因素包括很多，如粒子大小、疏水性、表面電荷、粒子或大分子的構(gòu)象等，這些因素微小的變化可導(dǎo)致分配系數(shù)較大的變化，因而雙水相萃取有較好的選擇性。分配系數(shù)K

13、與溶質(zhì)的濃度和相體積比無(wú)關(guān)：,三、影響雙水相萃取的因素,（一）、成相高聚物的分子量 一般原則:對(duì)于給定的相系統(tǒng)，如果一種高聚物被低分子量的同種高聚物所代替，被萃取的大分子物質(zhì),如蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞粒子等，將有利于在低分子量高聚物一側(cè)分配。,如以Dextran 500(MW 500 000)代替Dextran 40（MW 40 000）,即增大下相高聚物的分子量，被萃取的低分子量物質(zhì)如細(xì)胞色素C分配系數(shù)增加并不顯著。然而，被萃取的大分子量物質(zhì)，如過(guò)氧化氫酶的分配系數(shù)可增大到原來(lái)的67倍。,（二）成相聚合物濃度 界面張力,一般來(lái)說(shuō)，雙水相萃取時(shí)，如果相系統(tǒng)組成位于臨界點(diǎn)附近，則蛋白質(zhì)等大分子的分配

14、系數(shù)接近于1。高聚物濃度增加，系統(tǒng)組成偏離臨界點(diǎn)，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)也偏離1，即K1或K1,（三）、電化學(xué)分配 鹽類(lèi)的影響,鹽對(duì)帶電大分子的分配影響很大。各種鹽的分配系數(shù)存在著微小的差異，產(chǎn)生了相間電位。由于蛋白質(zhì)等大分子在水溶液中常帶有電荷，相間電位造成的靜電力能影響所有帶電大分子和帶電細(xì)胞粒子在兩相中的分配。例如，DNA萃取時(shí)，離子組分微小的變化可使DNA從一相幾乎完全轉(zhuǎn)移到另一相。,（四）、疏水效應(yīng),選擇適當(dāng)?shù)柠}組成，相系統(tǒng)的電位差可以消失。排除了電化學(xué)效應(yīng)后，決定分配系數(shù)的其它因素，如粒子的表面疏水性能即可占主要地位。成相高聚物的末端偶聯(lián)上疏水性基團(tuán)后，疏水效應(yīng)會(huì)更加明顯，此時(shí)，如果被分

15、配的蛋白質(zhì)具有疏水性的表面，則它的分配系數(shù)會(huì)發(fā)生改變。,（五）、溫度及其它因素,溫度的影響是間接的，它主要影響相的高聚物組成，只有當(dāng)相系統(tǒng)組成位于臨界點(diǎn)附近時(shí)，溫度對(duì)分配系數(shù)才具有較明顯的作用。 pH對(duì)酶的分配系數(shù)也有很大關(guān)系，特別是在系統(tǒng)中含有磷酸鹽時(shí)，如圖4-18所示。由于pH的變化會(huì)影響磷酸鹽是一氫化物還是二氫化物磷酸鹽的存在，而一氫化物磷酸鹽對(duì)界面電位有明顯的影響。,Dextran、FiColl、淀粉、纖維素等高聚物具有光學(xué)活性,它們應(yīng)該可以辨別分子的D、L型。因此，對(duì)映體分子在上述高聚物相系統(tǒng)中具有不同的分配特征。同樣，一種蛋白質(zhì)對(duì)D或L型能選擇性地結(jié)合而富集于一相中，可將此用于手性

16、分配。例如，在含血清白蛋白的相系統(tǒng)中，D、L型色氨酸可獲得分離。,四、雙水相萃取的應(yīng)用,雙水相系統(tǒng)平衡時(shí)間短，含水量高，界面張力低，為生物活性物質(zhì)提供了溫和的分離環(huán)境。它還具備操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)省時(shí)、易于放大。據(jù)報(bào)道，系統(tǒng)可從10ml直接放大到1m3規(guī)模（105倍）,而各種試驗(yàn)參數(shù)均可按比例放大，產(chǎn)物收率并不降低。,例如PEG-Dextran系統(tǒng)特別適用于從細(xì)胞勻漿液中除去核酸和細(xì)胞碎片。系統(tǒng)中加入0.1mol/L NaCl可使核酸和細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)移到下相（Dextran相）,產(chǎn)物胞內(nèi)酶位于上相，分配系數(shù)為0.11.0。選擇適當(dāng)?shù)柠}組分，經(jīng)一步或多步萃取，可獲得滿(mǎn)意的分離效果。如果NaCl濃度增大到2

17、5mol/L，幾乎所有的蛋白質(zhì)、酶都轉(zhuǎn)移到上相，下相富含核酸。,五、雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展,（一）、廉價(jià)雙水相體系的開(kāi)發(fā) （二）、雙水相親和分配 （三）、液體離子交換劑 ( liquid ion exchanger) 如用PEG6000-(H2PO4)4來(lái)分離純化干擾素時(shí)，其分配系數(shù)可高達(dá)170，而雜蛋白的分配系數(shù)只有0.04。值為4250，這是一般方法所不能達(dá)到的。,第五節(jié) 反膠束萃取,反膠束（reversed micelle），也稱(chēng)反膠團(tuán)或反微團(tuán)，是表面活性劑分散在連續(xù)的有機(jī)相中自發(fā)形成的納米尺度的一種聚集體。,一、基本原理,表面活性劑溶于非極性溶劑中，并使其濃度超過(guò)臨界膠束濃度，便會(huì)在有機(jī)

18、溶劑內(nèi)形成聚集體，非極性基團(tuán)在外，極性基團(tuán)則排列在內(nèi)，形成一個(gè)極性核，此極性核具有溶解極性物質(zhì)的能力。當(dāng)含有此種反膠束的有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)的水溶液接觸后，蛋白質(zhì)及其他親水性物質(zhì)能夠溶于極性核內(nèi)部的水中，由于周?chē)乃畬雍蜆O性基團(tuán)的保護(hù)，蛋白質(zhì)不與有機(jī)溶劑接觸，從而不會(huì)造成失活。,二、反膠束體系,在反膠束萃取的早期研究中多用季胺鹽，目前用得最多的是AOT，其化學(xué)名為丁二酸乙基己基酯-磺酸鈉。,三、反膠束萃取過(guò)程,反膠束選擇性分離目標(biāo)蛋白質(zhì)包括兩個(gè)過(guò)程:萃取過(guò)程(forward extraction)和反萃取過(guò)程(backward extraction)。 萃取過(guò)程:目標(biāo)蛋白質(zhì)從主體溶液轉(zhuǎn)移至反膠束溶

19、液中的過(guò)程； 反萃取過(guò)程:目標(biāo)蛋白質(zhì)從反膠束溶液中轉(zhuǎn)移至第二水相(或以固體的形式游離出來(lái))的過(guò)程。這些過(guò)程可連續(xù)操作，反膠束可在兩套系統(tǒng)中循環(huán)。,四、影響因素,表面活性劑的種類(lèi) 水相pH值 溫度 親和反膠束萃取,五、應(yīng)用舉例,（一）蛋白質(zhì)類(lèi)藥物 （二）、氨基酸 （三）、抗生素 （四）、核酸,第六節(jié) 超臨界流體萃取法,超臨界流體（supercritical fluid ，簡(jiǎn)稱(chēng)SCF）萃取技術(shù)，又稱(chēng)壓力流體萃取、超臨界氣體萃取、臨界溶劑萃取等，是利用處于臨界壓力和臨界溫度以上的一些溶劑流體所具有特異增加物質(zhì)溶解能力來(lái)進(jìn)行分離純化的技術(shù)。,一、基本原理,當(dāng)氣體物質(zhì)處于其臨界溫度(Tc)和臨界壓力(P

20、c)以上時(shí)，不會(huì)凝縮為液體，只是密度增大，具有許多特殊的物理化學(xué)性質(zhì)： 流體的密度接近于液體的密度,粘度接近于氣體；在臨界點(diǎn)附近,超臨界流體的溶解度對(duì)溫度和壓力的變化非常敏感；,利用CO2作為萃取劑主要有以下優(yōu)點(diǎn): (1) 二氧化碳超臨界溫度(Tc=31.06)是所有溶劑中最接近室溫的，可以在3540的條件下進(jìn)行提取,防止熱敏性物質(zhì)的變質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)的逸散。 (2)在CO2氣體籠罩下進(jìn)行萃取,萃取過(guò)程中不發(fā)生化學(xué)反應(yīng);又由于完全隔絕了空氣中的氧,因此,萃取物不會(huì)因氧化或化學(xué)變化而變質(zhì)。,(3)由于CO2無(wú)味、無(wú)臭、無(wú)毒、不可燃、價(jià)格便宜、純度高、容易獲得,使用相對(duì)安全。 (4)CO2是較容易提純與分離的氣體,因此萃取物幾乎無(wú)溶劑殘留,也避免了溶劑對(duì)人體