實(shí)驗(yàn)九底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響.ppt

1、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 了解底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。 2 學(xué)習(xí)測(cè)定米氏常數(shù)的原理和方法。,實(shí)驗(yàn)原理 1913年，Michaelis和Menten提出了酶促反應(yīng)速度和底物濃度的關(guān)系式，即米氏方程。VS / ( Km+S )式中： 為反應(yīng)初速度 V為最大反應(yīng)速度 S為底物濃度 Km為米氏常數(shù) Km值是酶的一個(gè)特征性常數(shù)，可近似表示酶與底物的親和力。 Lineweaver-Burk作圖法是用實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定Km值的最常用的方法。,LineweaverBurk的作圖法 雙倒數(shù)作圖法。,1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax,取米氏方程式的倒數(shù)形式：,1/Vmax,斜

2、率=Km/Vmax,-1/Km,米氏常數(shù)Km的測(cè)定,實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇不同的S，測(cè)定相對(duì)應(yīng)的。求出兩者的倒數(shù)，以1/對(duì)1/S作圖，則得到一個(gè)斜率為Km/V的直線。將直線外推與橫軸相交，其橫軸截矩為：1/S1/ Km，由此求出Km值。該法比較簡(jiǎn)便。 本實(shí)驗(yàn)以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測(cè)定Km值。 胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)中堿性氨基酸（L精氨酸和L賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵水解。水解時(shí)生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判斷自由氨基增加的數(shù)量來追蹤反應(yīng)。,甲醛滴定法 由于氨基酸分子在溶液中主要是兩性離子，故不能用酸、堿滴定其含量。但氨基酸的氨基可與甲醛反應(yīng)生成羥甲基和二

3、羥甲基氨基酸，使上述平衡向右移動(dòng)，促使氨基酸分子上的一NH3十基解離釋放出 H+，從而使溶液酸性增加，就可以酚酞作指示劑用 NaOH來滴定。,小知識(shí)點(diǎn)： 酚酞是堿性指示劑（變色范圍是堿性），酸滴堿時(shí)用堿性指示劑；反之堿滴酸時(shí)用酸性指示劑比如甲基橙甲基紅。,三、器材 錐形瓶 滴定管 移液管 水浴鍋 量筒等 四、試劑與材料 1. 酪蛋白 2. 胰蛋白酶 3. 甲醛 4. 酚酞 5. 氫氧化鈉,五、操作 分別向6個(gè)小錐形瓶中加入5 mL甲醛溶液和1滴酚酞，并滴加0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液，直至混合物呈微粉紅色。注意：每個(gè)錐形瓶中的顏色應(yīng)一致。 取100 mL酪蛋白溶液，加入另一錐形瓶中，在3

4、7水浴中保溫10分鐘。將胰蛋白酶也在37 水浴中保溫10分鐘。然后精確量取10 mL酶液加到酪蛋白溶液中（同時(shí)計(jì)時(shí)）。,充分混合后，隨即取出10 mL反應(yīng)混合物（作為零時(shí)的樣品）吹至一含甲醛的錐形瓶中。用0.1 mol/LNaOH溶液滴定，直至混合物呈微粉紅色，記下所用0.1 mol/LNaOH溶液的mL數(shù)。,在2、4、6、8和10分鐘時(shí)，分別取出10 mL消化樣品，準(zhǔn)確照上法操作。注意：在每個(gè)樣品中滴定終點(diǎn)的顏色應(yīng)當(dāng)一致。用增加的滴定度對(duì)時(shí)間作圖，測(cè)定初速度。 配制不同濃度的酪蛋白溶液（7.5、10、15、20、30 g/L）測(cè)定不同底物濃度時(shí)的活力。 用實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果，以以1/對(duì)1/S作圖

5、，求出V和Km的數(shù)值。,【注意事項(xiàng)】 1實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，酶促反應(yīng)速度逐漸下降。原因有多種，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用并加速逆反應(yīng)的進(jìn)行，酶在一定pH及溫度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn)。 2本實(shí)驗(yàn)是一個(gè)定量測(cè)定方法，為獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)盡量減少實(shí)驗(yàn)操作中帶來的誤差。因此配制各種底物溶液時(shí)應(yīng)用同一母液進(jìn)行稀釋，保證底物濃度的準(zhǔn)確性。各種試劑的加量也應(yīng)準(zhǔn)確，并嚴(yán)格控制準(zhǔn)確的酶促反應(yīng)時(shí)間。,【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 1測(cè)定并計(jì)算酶促反應(yīng)速度。 2用實(shí)驗(yàn)所得的反應(yīng)速度，對(duì)相應(yīng)的底物濃度作圖。,【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】 總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并回答